水稻纹枯病拮抗细菌7-5的鉴定及其生防机制初步研究
水稻恶苗病拮抗细菌的筛选及生防机制
收稿日期:20220721基金项目:辽宁省科技厅博士启动科研基金项目(2022-B S -227)㊂作者简介:佟德利(1983 ),男,辽宁锦州人,沈阳师范大学副教授,博士;通信作者:贺海升(1982 ),男,内蒙古呼伦贝尔人,沈阳师范大学实验师,博士㊂第41卷 第2期2023年 4月沈阳师范大学学报(自然科学版)J o u r n a l o f S h e n y a n g N o r m a lU n i v e r s i t y (N a t u r a l S c i e n c eE d i t i o n )V o l .41N o .2A pr .2023文章编号:16735862(2023)02018607水稻恶苗病拮抗细菌的筛选及生防机制佟德利1,刘静华1,于 鑫1,朱广鹏1,李梦琦1,贺海升2(1.沈阳师范大学生命科学学院,沈阳 110034;2.沈阳师范大学实验教学中心,沈阳 110034)摘 要:从稻蟹生态种养水稻根际土壤中分离得到3株对水稻恶苗病具有防治作用的拮抗细菌,其防治效果可分别达到69%,60%,62%㊂经鉴定,3株拮抗细菌分别为解淀粉芽孢杆菌J 2(B a c i l l u s a m y l o l i q u e f a c i e n s )㊁芽孢杆菌属J 3(B a c i l l u s s p .)和枯草芽孢杆菌F 3(B a c i l l u s s u b t i l i s )㊂3株拮抗细菌均可代谢产生蛋白酶与纤维素分解酶,致使病原菌菌丝顶端部分膨大,从而抑制菌丝生长,降低恶苗病发病率㊂拮抗细菌也可同时促进水稻苗期光合作用和生物量的增加,诱导水稻超氧化物歧化酶(s u p e r o x i d e d i s m u t a s e ,S O D )㊁过氧化物酶(p e r o x i d a s e ,P O D )和过氧化氢酶(c a t a l a s e ,C A T )活性提高,丙二醛(m a l o n d i a l d e h yd e ,M D A )含量下降,进而提高水稻防御能力,降低病害发生㊂3株拮抗细菌均表现出对水稻恶苗病良好的防治效果,且对水稻生长产生积极影响,具有一定的开发潜力㊂关 键 词:藤仓镰刀菌;拮抗细菌;生防机制中图分类号:S 158.5 文献标志码:Ad o i :10.3969/j .i s s n .16735862.2023.02.016S c re e n i n g o fa n t a g o n i s t i cb a c t e r i aa g a i n s t F u s a r i u mf u j i k u r o i i n r i c e a n db i o c o n t r o lm e c h a n i s mT O N G D e l i 1,L I U J i n g h u a 1,Y U X i n 1,Z HU G u a n g p e n g 1,L I M e n g q i 1,H E H a i s h e n g2(1.C o l l e g e o f L i f e S c i e n c e ,S h e n y a n g N o r m a lU n i v e r s i t y ,S h e n y a n g 110034,C h i n a ;2.E x p e r i m e n t a l T e a c h i n g C e n t e r ,S h e n y a n g N o r m a lU n i v e r s i t y ,S h e n y a n g 110034,C h i n a )A b s t r a c t :T h r e e a n t a g o n i s t i c b a c t e r i a a g a i n s t F u s a r i u m f u j i k u r o i w e r e i s o l a t e d f r o m r i c e r h i z o s p h e r es o i lc u l t i v a t e d b y r i c e -c r a b e c o l o g i c a lc u l t u r e .T h e y w e r ei d e n t i f i e d a s B a c i l l u s a m y l o l i q u e f a c i e n s J 2,B a c i l l u s s p .J 3a n d B a c i l l u s s u b t i l i s F 3.A l l o f t h e mh a d g o o d c o n t r o l e f f e c t o n r i c e s e e d l i n g m a l i g n a n t s e e d l i n g di s e a s e ,a n dt h ec o n t r o l e f f e c t r e a c h e d69%,60%a n d62%,r e s p e c t i v e l y .A l l t h e t h r e ea n t a g o n i s t i cb a c t e r i ac o u l d p r o d u c e p r o t e a s e sa n dc e l l u l o l y t i ce n z ym e s ,w h i c h c a u s e d t h e a p i c a l p a r t o f t h em y c e l i u mt o e x p a n d ,t h u s i n h i b i t i n g t h e g r o w t h o fm y c e l i u ma n d r e d u c i n g t h ei n c i d e n c eo f m a l i g n a n ts e e d l i n g d i s e a s e .A n t a g o n i s t i c b a c t e r i ac o u l d p r o m o t et h e p h o t o s y n t h e s i s a n db i o m a s so f r i c ea t s e e d l i n g s t a g e ,i n d u c e t h ea c t i v i t i e so f s u p e r o x i d e d i s m u t a s e (S O D ),p e r o x i d a s e (P O D )a n d c a t a l a s e (C A T )i n r i c e a n d d e c r e a s e t h e a c t i v i t y o fm a l o n d i a l d e h y d e (M D A ),t h e r e b y i m p r o v i n g t h e d e f e n s e a b i l i t y o f r i c e a n d r e d u c i n g t h e o c c u r r e n c e o f r i c e d i s e a s e s .A l l t h e t h r e ea n t a g o n i s t i cb a c t e r i as h o w e d g o o dc o n t r o l e f f e c to nr i c e m a l i g n a n t s e e d l i n g di s e a s e ,a n dh a da p o s i t i v e e f f e c t o n r i c e g r o w t h ,w h i c hh a d c e r t a i nd e v e l o p m e n t p o t e n t i a l .K e y wo r d s :F u s a r i u m f u j i k u r o i ;a n t a g o n i s t i cb a c t e r i a ;b i o c o n t r o lm e c h a n i s m水稻作为我国第一大粮食作物,其种植与产量关乎国家粮食安全[1]㊂然而,水稻病害的发生严重影响水稻的品质与产量,常见的水稻真菌病害包括水稻基腐病㊁纹枯病㊁恶苗病㊁稻瘟病㊁白叶枯病等[26]㊂其中,水稻恶苗病在中国稻区分布广泛,该病主要由藤仓镰刀菌(F u s a r i u m f u j i k u r o i )和层出镰刀菌(F u s a r i u m p r o l i f e r a t u m )引起,二者分布最广㊁致病力最强[7]㊂水稻恶苗病在水稻苗期的症状包括徒长㊁叶片细长呈淡绿色㊁矮化㊁死苗等,在成株期引起根部和茎基部腐烂,严重时整株枯死[8],该病爆发后,一般造成水稻减产10%~20%,严重时高达50%[910]㊂目前,控制水稻真菌病害主要以化学杀菌剂为主,但其具有潜在的环境风险,因而生物防治已经成为控制植物病害的理想方法[1112]㊂学者已经筛选出对植物霜霉病[1316]㊁黄瓜灰霉病[17]㊁番茄灰霉病[1819]㊁水稻基腐病[2]㊁水稻纹枯病[3]㊁水稻稻瘟病[5]㊁水稻白叶枯病[6]等植物病害具有较好效果的拮抗微生物,但对水稻恶苗病的生物防治的报道较少㊂本研究以稻蟹生态种养田块中水稻根际土壤细菌为材料,旨在筛选对水稻恶苗病具有防治作用的拮抗菌株,并研究其防治效果和对水稻生长的影响㊂1 材料与方法1.1 材料土壤样品采自辽宁省盘山县稻蟹共作田水稻根际,水稻恶苗病病原菌为藤仓镰刀菌(F u s a r i u mf u ji k u r o i ),由沈阳师范大学微生物学实验室保存㊂1.2 方法1.2.1 拮抗细菌的分离㊁筛选与鉴定拮抗细菌的分离采用稀释平板法获得细菌纯培养[20]㊂采用马铃薯葡萄糖琼脂培养基(po t a t o d e x t r o s e a g a rm e d i u m ,P D A )平板对峙法筛选拮抗细菌,在平板采取2点对峙,一端接种1c m 藤仓镰刀菌菌饼,将已分离纯化的拮抗菌株分别点接在距离指示菌3c m 处的点上,以不接拮抗菌株为对照,置于25ħ恒温培养,每个处理重复3次㊂待对照菌株长满整个培养皿,测定菌丝生长距离,计算抑菌率[20]:抑菌率(%)=抑菌距离(c m )对照组距离(c m )ˑ100% 菌株鉴定结合‘常见细菌系统鉴定手册“[21]与分子测序方法[22],测序由苏州泓迅生物科技股份有限公司完成㊂1.2.2 拮抗细菌对水稻苗期恶苗病的影响稻种经消毒㊁催芽后,每盆种植50粒水稻种子,25ħ光照培养箱中培养,采用剪叶喷雾接种法,于两叶一心期对水稻叶鞘部位进行微伤口处理,对照接种恶苗病菌和无菌水,以C K 表示;同时接种恶苗病菌和J 2,J 3,F 3,菌悬液的处理以T 1,T 2,T 3表示,每天早晚各接种一次,直至不流液,每个处理重复3次,连续接种15d 后,调查水稻恶苗病的发病率[2324]㊂发病率(%)=水稻发病数水稻总株数ˑ100%1.2.3 拮抗细菌无菌发酵液对水稻恶苗病菌丝生长的影响在9m L 酵母浸出粉胨葡萄糖(y e a s te x t r a c t p e p t o n ed e x t r o s e m e d i u m ,Y E P D )培养基中加入1m L 病原菌孢子悬浮液,150r ㊃m i n -1,25ħ条件下摇瓶培养12h 以获得菌丝体㊂之后按照10%的终浓度加入菌株无菌发酵液,摇瓶培养24h 后对藤仓镰刀菌的菌丝形态进行显微观察,以不加菌株无菌发酵液为对照[25]㊂1.2.4 拮抗细菌相关代谢酶活性参照关小敏[20]的方法测定拮抗细菌蛋白酶㊁纤维素酶㊁果胶酶和几丁质酶活性㊂1.2.5 拮抗细菌对水稻幼苗生长的影响完成1.2.2实验的同时,C K ,T 1,T 2和T 3各处理随机选取3株水稻幼苗进行株高㊁叶绿素含量和相关酶的测定㊂利用S P A D -502P l u s 型叶绿素计测定叶片叶绿素含量,测定时选取不同叶片的相同位置;利用可见分光光度法测定超氧化物歧化酶(S O D )活性和丙二醛(M D A )含量;愈创木酚比色法测定过氧化物酶(P O D )活性;紫外比色法测定过氧化氢酶(C A T )活性㊂781 第2期 佟德利,等:水稻恶苗病拮抗细菌的筛选及生防机制2 结果与分析2.1 拮抗细菌的筛选鉴定2.1.1 拮抗细菌对水稻恶苗病的拮抗效果从水稻根际土壤中初筛得到具有恶苗病菌拮抗能力的细菌24株,经过反复筛选,最终获得3株具有稳定拮抗能力的菌株,将其分别编号为J 2,J 3,F 3㊂由表1可见,3株拮抗细菌的抑菌率基本在50%以上㊂其中,J 2的拮抗效果显著高于其他菌株(P <0.05),抑菌率达到了60%,J 3和F 3的抑菌率分别为48%和52%㊂表1 3株拮抗细菌对恶苗病菌的影响T a b l e1 E f f e c t s o f t h r e ea n t a g o n i s t i cb a c t e r i a s t r a i n s o n F u s a r i u mf u ji k u r o i i n r i c e 拮抗细菌对照组距离/c m 抑菌距离/c m 抑菌率/%J 22.5ʃ0.12 1.5ʃ0.06a 60ʃ2.4a J 32.5ʃ0.121.2ʃ0.05b 48ʃ2.0b F 32.5ʃ0.121.3ʃ0.04b 52ʃ1.6b2.1.2 形态学及生理生化鉴定表2 3株拮抗细菌的部分生理生化特性T a b l e2 S o m e p h y s i o l o g i c a l a n db i o c h e m i c a l c h a r a c t e r i s t i c s o f t h r e ea n t a g o n i s t i cb a c t e r i a J 2菌株J 3菌株F 3菌株硝酸盐还原试验+++明胶液化试验--+淀粉水解试验---吲哚试验+++硫化氢试验++- 注:+,阳性;-,阴性㊂3株拮抗细菌在营养琼脂培养基(p o t a t od e x t r o s ea g a rm e d i u m ,N A )中培养24h ,菌落均呈乳白色㊁近圆形凸起,前期表面光滑㊁边缘整齐㊁不透明㊁易挑取㊂菌体均呈杆状,J 2细胞大小(0.4~0.8)ˑ(0.6~1.0)μm ,J 3细胞大小(0.6~0.8)ˑ(0.6~1.0)μm ,F 3细胞大小(0.6~1.0)ˑ(0.6~1.2)μm ,革兰氏染色均为阳性㊂3株拮抗细菌的部分生理生化特性见表2㊂其中,J 2和J 3硝酸盐还原试验㊁吲哚试验㊁硫化氢试验为阳性;明胶液化试验㊁淀粉水解试验为阴性;F 3硝酸盐还原试验㊁明胶液化试验㊁吲哚试验为阳性;硫化氢试验㊁淀粉水解试验为阴性㊂2.1.3 分子生物学鉴定如图1所示,3株拮抗细菌16S r DN A 序列通过N C B I 的B l a s t 程序与数据库中的16S r D N A 序列进行比对,J 2与解淀粉芽孢杆菌属16S r D N A 序列的相似性高达99%,初步确定其为解淀粉芽孢杆菌(B a c i l l u s a m y l o l i q u e f a c i e n s );J 3与芽孢杆菌16S r D N A 序列的相似性高达99%,初步确定其为芽孢杆菌属(B a c i l l u s s p .);F 3与枯草芽孢杆菌属16S r D N A 序列的相似性高达99%,初步确定其为枯草芽孢杆菌(B a c i l l u s s u b t i l i s )㊂图1 基于16S r D N A 序列构建的3株拮抗细菌的系统进化树F i g .1 P h y l o g e n e t i c t r e eo f t h r e ea n t a g o n i s t i cb a c t e r i ab a s e do n 16S r D N As e q u e n c e s 881沈阳师范大学学报(自然科学版) 第41卷2.2拮抗细菌对水稻恶苗病的防治效果表3 3株拮抗细菌分别处理对水稻植株苗期恶苗病的控制效果T a b l e3 C o n t r o l e f f e c t s o f t h e t h r e ea n t a g o n i s t i c s t r a i n s i n t h es e e d l i n g s t a g eo f r i c e p l a n t s 处理发病率%防治效果%C K 99ʃ0.8a 1.0ʃ0.8c T 131ʃ1.2c 69ʃ1.2a T 240ʃ1.4b 60ʃ1.4b T 338ʃ1.4b 62ʃ1.4b 注:不同字母表示不同处理间的显著性差异(P <0.05)㊂ 表3所示水稻盆栽结果表明,对于只接种恶苗病菌处理,水稻叶片呈淡黄绿色且叶鞘黄色,发病指数为99%;与单加病原菌处理相比,接种拮抗细菌处理J 2,J 3,F 3后,水稻发病率显著降低(P <0.05),水稻叶片与叶鞘大部分为绿色,小部分发病为黄绿色,发病指数分别为31%,40%,38%,平均相对防效分别高达69%,60%,62%,但J 3和F 3之间差异并不显著(P >0.05),二者与J 2差异显著(P <0.05),表明3株拮抗细菌对水稻恶苗病防治效果较好㊂2.3 拮抗细菌生防机制2.3.1 拮抗细菌无菌发酵液对水稻恶苗病菌丝生长的影响由图2可知,摇瓶培养24h 后,病原菌菌丝表面光滑㊁圆润,生长正常㊂添加10%发酵液后,各处理菌丝顶部均呈现部分膨大,生长出现异常,可能与拮抗细菌在生长过程中产生的代谢酶或者某些抗菌类的物质相关[2627]㊂图2 3株拮抗细菌无菌发酵液对恶苗病菌丝的影响(40ˑ)F i g .2 E f f e c t s o f s t e r i l e f e r m e n t a t i o nb r o t ho f t h r e ea n t a g o n i s t i cb a c t e r i a l s t r a i n s o n t h em y c e l i ao fm a l i g n a n t s e e d l i n g d i s e a s e (40ˑ)2.3.2 拮抗细菌代谢酶检测由表4可知,3株拮抗细菌蛋白酶㊁纤维素酶试验均为阳性,蛋白酶产酶圈直径分别为2,1.8,2.2c m ,纤维素酶产酶圈直径分别为2.5,1.6,1.7c m ,表明3株拮抗细菌均能产生蛋白酶和纤维素酶,对蛋白和纤维素具有分解作用㊂然而,3株拮抗细菌果胶酶和几丁质酶试验均为阴性,表明均未能产生相应酶降解果胶和几丁质㊂表4 3株拮抗细菌产酶结果T a b l e4 R e s u l t s o f e n z y m e p r o d u c t i o nb y t h r e ea n t a go n i s t i cb a c t e r i a 代谢酶J 2产酶直径/c m J 3产酶直径/c m F 3产酶直径/c m 蛋白酶试验21.82.2纤维素酶试验2.51.61.7果胶酶试验几丁质试验注:-,阴性,未能产生相应酶㊂2.4 拮抗细菌对水稻幼苗生长的影响2.4.1 拮抗细菌对水稻株高和叶绿素含量的影响由图3所示,与单加恶苗病菌处理相比,接种拮抗细菌J 2,J 3,F 3后,水稻株高和叶绿素含量均显著提高(P <0.05)㊂其中,水稻株高分别提高30.52%,32.25%和27.16%,但三者之间差异并不显著(P >0.05);叶绿素含量分别提高15.7%,12.13%和9.62%,且三者之间差异显著(P <0.05)㊂接种3981 第2期 佟德利,等:水稻恶苗病拮抗细菌的筛选及生防机制091沈阳师范大学学报(自然科学版)第41卷株拮抗细菌对水稻幼苗生长㊁叶绿素合成有明显的促进作用,水稻可以更好地进行光合作用㊂图33株拮抗细菌对水稻株高和叶绿素的影响F i g.3E f f e c t s o f t h r e ea n t a g o n i s t i cb a c t e r i a s t r a i n s o n p l a n t h e i g h t a n dc h l o r o p h y l l i n r i c e2.4.2拮抗细菌对水稻幼苗抗氧化酶活性和M D A含量的影响由图4可知,接种拮抗细菌J2,J3,F3后,水稻幼苗根和叶S O D,P O D,C A T活性均显著提高,M D A 含量显著下降(P<0.05)㊂其中,水稻根部S O D活性分别提高44.45%,22.22%和35.09%,但J2和F3之间差异并不显著(P>0.05);P O D酶活性分别提高77.19%,63.03%和63.03%,但J3和F3之间差异并不显著(P>0.05);C A T酶活性分别提高45.75%,49.13%和9.55%,但J2和J3之间差异并不显著(P>0.05);M D A含量分别降低18.47%,20.05%和17.83%,且J3和F3之间差异显著(P<0.05)㊂水稻叶片S O D酶活性分别提高60.51%,61.94%和44.03%,但J2和J3之间差异并不显著(P>0.05);P O D酶活性分别提高90.70%,124.65%和89.40%,但J2和F3之间差异并不显著(P>0.05);C A T酶活性分别提高75.01%,142.42%和75.01%,且三者之间差异显著(P<0.05); M D A含量分别降低47.35%,53.59%和52.41%,但J3和F3之间差异不显著(P>0.05)㊂图43株拮抗细菌对水稻幼苗抗氧化酶活性和M D A含量的影响F i g.4E f f e c t s o f t h r e ea n t a g o n i s t i cb a c t e r i a s t r a i n s o na n t i o x i d a n t e n z y m ea c t i v i t i e s a n dM D Ac o n t e n t i n r i c es e e d l i n g sS O D 是细胞防御系统中的第一道防线,能维持机体内氧自由基的动态平衡,可减轻氧自由基对细胞造成的伤害,在细胞代谢过程中具有极其重要的地位㊂C A T 也是清除细胞内过氧化氢含量的主要酶,常与S O D 联合清除细胞内活性氧自由基,然后P O D 将S O D 歧化产生的H 2O 2分解,三者协同作用,在细胞防御系统中发挥着尤为重要的作用[2829]㊂水稻幼苗经拮抗细菌处理后,S O D ,P O D 和C A T活性显著提高,M D A 活性下降,表明加入拮抗细菌可以有效清除氧自由基,阻碍脂质过氧化物M D A 产生,提高水稻自身防御能力,降低病害发生㊂3 讨 论解淀粉芽孢杆菌(B a c i l l u s a m y l o l i q u e fa c i e n s )和枯草芽孢杆菌(B a c i l l u s s ub t i l i s )广泛应用于农业㊁食品㊁医药等行业[5,30]㊂解淀粉芽孢杆菌对金银花白粉病㊁甘蔗鞭孢堆黑粉病㊁稻梨孢菌㊁番茄灰霉病具有良好的防治作用[31],枯草芽孢杆菌对水稻稻瘟病[5]㊁纹枯病[32]㊁黄瓜枯萎病和辣椒疫霉病[33]等植物真菌病害有不同程度的防治效果,本研究也获得了类似的结果,表明芽孢杆菌属的细菌对植物真菌病害具有良好的防治潜能㊂解淀粉芽孢杆菌可同时产生脂肽类和蛋白类活性物质,可以有效抑制孢子萌发㊁胞内物质外泄等[31]㊂类芽孢杆菌能够产生纤维素酶㊁蛋白酶㊁果胶酶等,这些酶能够导致病原菌菌丝发生畸形,如菌丝顶端膨大㊁菌丝变短㊁弯曲㊁缠绕等[20]㊂本研究发现3株拮抗细菌均对蛋白㊁纤维素有分解作用,说明这些酶可以降解病原菌菌丝体细胞,导致菌丝发生熔断畸变,抑制菌丝生长㊂枯草芽孢杆菌常作为有益菌剂用于农业生产,可有效促进小麦㊁向日葵㊁水稻等作物的生长[3436]㊂本研究亦发现相似结果,解淀粉芽孢杆菌J 2㊁芽孢杆菌属J 3㊁枯草芽孢杆菌F 3可显著降低水稻恶苗病的发病情况,防效分别高达69%,61.4%和63.4%,并能促进植株生长,株高分别提高30.52%,32.25%和27.16%㊂在植物自身防御相关酶系中,P O D ,S O D ,C A T 具有协同作用,P O D 可以提高植物体内S O D 和C A T 清除自由基和分解H 2O 2为H 2O 和O 2的能力,同时,还可以阻碍脂质过氧化物M D A 的产生,防御酶的共同作用,使得植物能抵抗病害入侵和不良环境的影响[25]㊂本研究中水稻幼苗经拮抗细菌处理后,S O D ,P O D 和C A T 活性显著提高,M D A 活性下降,表明加入拮抗细菌可以提高水稻自身防御能力,降低病害发生,与张伟珍等[37]的研究结果相一致㊂4 结 论从稻蟹生态种养水稻根际土壤中分离得到3株对藤仓镰刀菌具有防控作用的拮抗细菌,经鉴定分别为解淀粉芽孢杆菌(B a c i l l u s a m y l o l i q u e f a c i e n s )㊁芽孢杆菌属(B a c i l l u s s p .)㊁枯草芽孢杆菌(B a c i l l u s s u b t i l i s ),3株拮抗细菌均对水稻苗期恶苗病具有良好的防治效果,防效均在60%以上㊂3株拮抗细菌均可代谢产生蛋白酶与纤维素分解酶,并对病原菌菌丝产生不利影响,从而有效抑制病原菌生长,降低恶苗病发病率㊂此外,拮抗细菌还可以诱导水稻S O D ,P O D 和C A T 活性提高,M D A 活性下降,从而提高水稻防御能力,降低病害发生率㊂参考文献:[1]徐春春,纪龙,李凤博,等.当前我国水稻产业发展形势与战略对策[J ].华中农业大学学报,2022,41(1):2127.[2]梁丽琼,黄少莉,邵杭,等.水稻基腐病菌拮抗菌解淀粉芽孢杆菌E 3菌株的鉴定及抑菌活性[J ].华南农业大学学报,2021,42(4):5162.[3]谢剑波.水稻纹枯病拮抗菌WK 1的分离鉴定及其生防作用研究[D ].长沙:湖南农业大学,2020.[4]李玉洋,辛寒晓,范学明,等.水稻恶苗病拮抗菌的筛选㊁鉴定及其抑菌活性[J ].生物技术通报,2017,33(5):190196. 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研究探讨水稻纹枯病抗性鉴定体系的确立与遗传多样性
研究探讨水稻纹枯病抗性鉴定体系的确立与遗传多样性摘要：水稻是人民生活不可缺少的农作物，而水稻纹枯病的出现使得粮食大幅减产。
目前，我国对于田间水稻纹枯病的研究技术还不能够达到国际先进水平。
因此，本研究通过大量的实验方法与菌株鉴别技术，来确立并完善水稻纹枯病的抗性鉴定体系，希望能够明确纹枯病菌的遗传结构，从而防治病害。
关键词：水稻纹枯病；抗性鉴定；遗传多样性田间水稻纹枯病的泛滥严重威胁着我国粮食的总体产量，在其发展的多年时间里，有很多科研人员研究其发病机理。
随着人们对于纹枯病菌重视程度的提高，我们已了解其适宜的生长环境与病害发生程度的相关因素。
但是，纹枯病菌的适应能力超强，容易大量繁殖，我国在水稻纹枯病抗性遗传方面的研究非常有限。
本研究将从纹枯病菌入手，同时阐述病菌致病型的鉴定技术，希望能够为我国水稻种植提供帮助。
1.水稻纹枯病菌的相关探究要想确立并完善田间水稻纹枯病抗性鉴定体系，应该首先了解纹枯病菌的生长形态与致病机理。
水稻纹枯病的病原菌为立枯丝核菌，其有性态为瓜王革菌，初生菌丝无色，分枝与主枝近于直角，分枝基部明显缢缩，距分枝不远处具分隔。
通过相关的实验测定认为，水稻纹枯病菌菌丝细胞为多核，菌核由菌丝体交织纠结而成，开始的时候为乳白色，之后逐渐变黑，成熟之后具有粗糙的表面与坚固的保护层，可以让纹枯病菌抵抗严寒与恶劣的自然环境。
对于纹枯病菌的多样性研究也是十分必要的，运用菌丝融合作为立枯丝核菌的种内分类与鉴定方法，能够最大限度地将各种融合群的遗传本质体现出来，有利于接下来的融合菌群与遗传菌群的关系研究，立枯丝核菌不同菌系间的菌丝生长速度、菌核形成所需时间、菌核多少等性状存在明显的差异，笔者通过大量的实验室研究并观察菌群在培养皿中的分布情况认为，纹枯病菌的培养性状可以分为中央分布、边缘分布与随机分布三种。
2.田间水稻纹枯病抗性鉴定体系的确立2.1水稻纹枯病菌的致病型鉴定分析植物致病的原因以及病菌的类型与分化方式能够有助于植物物种的抗性鉴定与品种杂交。
作物病原真菌的拮抗菌筛选及其活性物质初步鉴定
作物病原真菌的拮抗菌筛选及其活性物质初步鉴定作者：胡洪涛张亚妮张舒李金泉张佑宏汪本福曹春霞任淑惠朱志刚姚经武龙同黄大野杨自文来源：《绿色科技》2017年第23期摘要：从湖北、安徽等地的水稻、小麦、豇豆、西瓜等种植区采集土壤，进行了微生物分离和培养。
采用对峙培养法，筛选到20株对11种重要作物病原真菌，如水稻稻瘟菌、小麦赤霉菌、豇豆根腐菌、西瓜枯萎菌等，具有不同拮抗活性的细菌，其中2株具有广谱抗真菌活性。
利用高效液相色谱和质谱对其中一株菌株的代谢产物进行了制备和结构初步鉴定，发现其主要活性成分为多烯类物质，分子量为803.67。
继续深入研究抗菌物质结构和抑菌机理，将有助于新型生物源杀菌剂的开发。
关键词：生防菌；稻瘟菌；赤霉菌；抑菌活性；高效液相色谱；质谱中图分类号：S476文献标识码：A 文章编号：1674-9944（2017）23-0164-041 引言作物真菌性病害，如水稻稻瘟病（Rice blast）、小麦赤霉病（Fusarium head blight）、西瓜枯萎病（Fusarium wilt of watermelon）、豇豆根腐病（Cowpea root rot）等，是世界性重要作物病害，全球每年仅因稻瘟病和赤霉病流行导致的经济损失就高达数十亿美元[1，3]，同时，赤霉菌所产生的真菌毒素严重威胁着食品安全[4]；西瓜枯萎病和豇豆根腐病是重要土传性病害，常导致西瓜和豇豆大面积死亡。
目前，防治真菌性病害的方法众多，但多以化学药剂防效最好，然而，化学药剂大量施用，不仅导致农药残留超标，也给环境和食品安全带来极大隐患。
生物农药环境兼容性好、对生物安全，是作物病害绿色防控技术体系的关键。
供药筛选的化合物主要由3种获取途径，购买已知化合物库、分离和提取天然产物以及化学合成，其中微生物来源的天然产物因其种类众多、易扩大和再生，而成为药物开发的最主要来源[5]。
由于前人研究多关注放线菌和真菌，因而在过去所发现的2万多种微生物来源的活性物质中，绝大部分来源于放线菌和真菌[5]，只有小部分约7%来源于细菌，说明细菌来源的活性物质亟待研究和开发。
拮抗细菌的研究进展
拮抗细菌的研究进展一、本文概述随着全球范围内抗生素耐药细菌问题的日益严重，拮抗细菌的研究已成为生物医药领域的研究热点。
本文综述了近年来拮抗细菌研究的最新进展，包括新型拮抗细菌的发现、作用机制的研究、以及其在临床治疗中的应用等方面。
文章首先简要介绍了拮抗细菌的定义和分类，然后重点阐述了各类拮抗细菌的研究现状和发展趋势，最后对拮抗细菌研究的未来方向进行了展望。
通过本文的综述，旨在为拮抗细菌的研究提供全面的参考和借鉴，推动拮抗细菌研究的发展，为解决全球抗生素耐药细菌问题提供新的思路和方法。
二、拮抗细菌的分类与特性拮抗细菌是一类具有抑制或杀死其他微生物的细菌，广泛存在于自然界中。
根据它们的来源、生理特性和作用方式，可以将拮抗细菌分为几个主要的类别。
根据来源，拮抗细菌可以分为内生菌和外生菌。
内生菌通常寄生于植物或动物体内，与其宿主形成共生关系，如一些植物根际促生菌和动物肠道益生菌。
这些细菌能够产生抗菌物质，对宿主体内的病原菌进行抑制。
而外生菌则广泛存在于土壤、水体等环境中，它们能够产生多种抗菌物质，对多种病原菌具有广泛的拮抗作用。
根据生理特性，拮抗细菌可以分为产酸菌、产碱菌、产酶菌等。
产酸菌能够通过降低环境pH值来抑制病原菌的生长，如乳酸菌就是一种常见的产酸拮抗细菌。
产碱菌则相反，它们能够提高环境pH值，抑制一些喜酸性病原菌的生长。
产酶菌则能够产生具有抗菌活性的酶类，如溶菌酶和几丁质酶等，这些酶能够破坏病原菌的细胞壁或细胞膜，从而杀死病原菌。
根据作用方式，拮抗细菌可以分为直接拮抗和间接拮抗。
直接拮抗是指拮抗细菌通过产生抗菌物质直接杀死或抑制病原菌的生长。
而间接拮抗则是指拮抗细菌通过竞争营养物质、占据生态位或促进宿主免疫等方式，间接抑制病原菌的生长。
拮抗细菌具有多种特性，使它们成为防治植物病害、动物疾病以及食品防腐等领域的重要资源。
拮抗细菌具有广泛的抗菌谱，能够抑制多种病原菌的生长。
拮抗细菌通常对宿主无毒无害，甚至能够促进宿主生长和提高免疫力。
水稻纹枯病防治关键技术研究
我国作为世界上著名的农业大国，在我国有超过一半的人口以稻米为主食，因此保障水稻稳产、高产至为重要，而水稻纹枯病又称“烂叶子病”，居水稻三大病害之首，此种水稻病害在我国南方地区盛行，发病严重的水稻基杆组织会出现坏死，最后造成稻穗干枯，从而严重影响出米率，因此为了能够保障我国水稻农业安全生产，强化水稻纹枯病防治关键技术研究十分重要。
1水稻纹枯病发病条件及危害症状水稻纹枯病又称“烂叶子病”，是由立枯丝核菌感染得病，此种病菌会以菌核方式在田间杂草、稻草以及土壤中越冬，并在翌年水稻春播插秧时浮出水面，随后附着在离水面较近的叶鞘中，并随着田间温度的不断升高，立枯丝核菌核就会侵入到水稻叶鞘中，并形成病斑，然后通过接触传染到临近的水稻植株上，逐渐横向、纵向蔓延，形成侵染结构，对水稻生长造成危害。
通常情况下水稻纹枯病主要发生在苗期和穗期，在发病初期主要表现为叶鞘长有病斑，并且这种病斑会逐渐扩大，而在温度和湿度皆比较适宜的情况下，叶鞘中的病斑就会呈现为中间为灰绿色，而若是田间天气比较干燥，病斑的边缘将呈现出褐色，中间为灰白色，此时发病的叶鞘就已经接近坏死，而叶片功能的丧失会导致水稻茎秆组织坏死，并引发水稻倒伏，最终造成整穗枯死，对水稻结实率、出米率造成严重的影响，因此强化水稻纹枯病防治关键技术研究十分重要。
2水稻纹枯病防治关键技术研究2.1农业防治技术农业防治技术是一种十分重要的水稻纹枯病防治技术，具体而言，农业防治水稻纹枯病主要包括以下几个方面的技术措施。
①稻鸭工作模式，通过实验表明，稻鸭工作模式不仅可以除草、除虫，同时还可以防治水稻纹枯病，如郑希教授研究发现，鸭在稻田中浑水的过程，可以将泥抹在水稻杆上，从而对水稻形成一种保护，这是可以抑制水稻纹枯病的。
②消除菌核，由于水稻纹枯病立枯丝核菌主要是通过田间越冬繁殖，因此通过清除田间病株及杂草的方式，不给立枯丝核菌提供越冬寄存的机会。
或者在稻田灌水时，可以将浮出水面的菌核打捞处理，这样都可以极大的控制病原菌传播。
水稻纹枯病拮抗细菌分离与鉴定
１ ２ １ 拮 抗细 菌 的分 离 从 水 稻 田采 集 患 病稻 ． ．
株 和 土 样 ， 稻 组 织 用 无 菌 水 漂 洗 ３次 ， 成 ２ｃ 水 切 ｍ
治Ⅲ ， 但长期 单一 使 用 井 岗霉 素防 治水 稻 纹 枯 病
（ ． 龙 江省 农业 科 学院 五 常水稻研 究所 ， １黑 黑龙 江 五 常 １ ０ ２ ；． ５ ２ ９ ２ 黑龙 江 省 国 营渔 场 管理指
导 站 ， 龙 江 哈 尔滨 １ ０ １ ） 黑 ５ ０ ０
摘 要 ： 从 水 稻 纹枯 病 稻 田 土壤 中分 离 筛选 的 １ ６株 细 菌进 行抑 茵 率 比较 ， 对 其 进 行 鉴 定 。 对 ７ 并 以期 为 水稻 纹枯 病 的 生物 防 治 提 供 理 论依 据 。 结 果表 明 ： Ｒ３ Ｓ ２菌 株 抑 菌 带 为 １ ． ６ ４ｍｍ， 茵 率 为 ７ ． ， 据 形 态 学和 生理 抑 ３６ 根 生 化 特 征 初 步 鉴 定 为 枯 草 芽孢 杆 菌 （ ａ ｉ ｕ ｂ ｉ ｓ 。 Ｂ ｃｌ ｓ ｕ ｔ ｉ） ｌ ｓ ｌ
ｚ ｃ ｎａｓｌｎ ｏｔ ｉ ｏａ ｉ引起 的 水 稻 真 菌 性 病 害 ， 病 引 ｏ 该 起水稻 结实率 下降 ， 千粒重 降低 ， 般受 害轻者 减 一
产 ５ ～ １ ， 者 可 达 ５ ～ ７ ， 重 时 导 致 Ｏ 重 Ｏ ０ 严 植 株 倒 伏 枯 死 。随 着 黑 龙 江 省 水 稻 种 植 面 积 逐 年 增 加 ， 肥 量 的 增 加 以 及 不 利 气 候 条 件 影 响 ， 稻 施 水 纹 枯 病 已 经 上 升 为 主 要 病 害 ， 黑 龙 江 省 各 稻 区 在
拮抗细菌防治水稻细菌性条斑病的研究的开题报告
拮抗细菌防治水稻细菌性条斑病的研究的开题报告
一、研究背景和目的
水稻细菌性条斑病是水稻生产中重要的细菌性病害，具有传播速度快、病情严重等特点，给水稻生产带来了严重的经济损失。
传统的治疗
方法主要是使用化学农药，但这些药剂会污染环境，对人类和生态系统
造成危害。
因此，开展细菌防治水稻细菌性条斑病的研究具有重要意义。
本研究旨在通过筛选抗性正常细菌，研究拮抗作用，探究拮抗细菌
防治水稻细菌性条斑病的可行性。
二、研究内容和方法
1. 筛选抗性正常细菌：从水稻根际土壤中分离得到多种正常细菌，
通过平板筛选和液体培养等方法，筛选出耐药性比较强的正常细菌，并
进行纯化与保存。
2. 确定拮抗作用机制：采用植物病原菌和拮抗菌单独培养和混合培养，通过测定抑菌环、抑菌率、Co-culture等方式，确定拮抗作用机制。
3. 研究拮抗细菌防治水稻细菌性条斑病的效果：采用田间盆栽试验，通过喷雾等方式，对不同时间、不同浓度的拮抗细菌进行处理，在不同
阶段对水稻进行观测，探究拮抗细菌防治水稻细菌性条斑病的可行性和
效果。
三、研究预期结果和意义
1. 确定拮抗作用机理：通过筛选得到的拮抗细菌，研究拮抗作用机理，从而为拮抗细菌的选择和优化提供理论依据。
2. 研究拮抗细菌防治水稻细菌性条斑病的效果：通过田间试验，评
估不同时间、不同浓度的拮抗细菌对水稻细菌性条斑病的防治效果，验
证拮抗细菌防治水稻细菌性条斑病的可行性和效果。
本研究的预期结果和意义在于开发一种新的、有效的、环保的水稻细菌性条斑病防治方法。
这将有助于保护水稻生产，促进农业可持续发展，同时也有助于环保事业的推进。
水稻纹枯病克星生物农药克纹灵研制成功
2023-11-09contents •克纹灵的研发背景•克纹灵的研发历程•克纹灵的主要成分与作用机制•克纹灵的田间试验与效果评估•克纹灵的应用前景与推广价值•克纹灵的未来研究方向与挑战目录01克纹灵的研发背景水稻纹枯病会导致稻株枯萎，使得水稻减产。
产量减少品质下降增加生产成本受纹枯病影响，水稻品质会下降，稻谷的蛋白质含量和加工品质都会受到影响。
为了防治水稻纹枯病，农民需要投入大量的人力物力，增加了生产成本。
03水稻纹枯病的危害0201很多现有的农药对于水稻纹枯病防治效果不佳，容易产生抗药性。
效果不佳大量使用化学农药不仅对环境造成污染，还会威胁到其他生物的安全。
污染环境现有农药的不足克纹灵的研制成功为水稻纹枯病的防治提供了一种新的、有效的解决方案。
提供新的解决方案作为一种生物农药，克纹灵的使用不会对环境造成太大的污染，有利于保护生态环境。
保护环境克纹灵的使用可以有效地防治水稻纹枯病，提高水稻的产量和品质，从而提高农业生产效益。
提高农业生产效益克纹灵的研发意义02克纹灵的研发历程背景介绍水稻纹枯病是一种常见的真菌病害，对水稻的产量和品质造成严重威胁。
为了解决这一问题，生物农药克纹灵的研发团队应运而生。
团队成员该研发团队由植物病理学、微生物学、农药学等领域的专家组成，具备丰富的研发经验和专业技能。
研发团队的组建研究目标确定克纹灵的主要活性成分，明确其作用机制，并研究其在农业生产中的应用效果。
研究方案通过实验室研究和田间试验相结合的方式，对克纹灵的活性成分进行筛选和优化，同时对其使用方法和最佳防治时期进行探索。
研发计划的制定研发过程中的困难与挑战活性成分的筛选与优化01在克纹灵的研发过程中，筛选和优化活性成分是关键环节，但筛选过程中需要克服诸多难点，如生物农药的稳定性、安全性等问题。
田间试验的不可控因素02田间试验过程中，气候、土壤、水稻品种等因素都会影响克纹灵的实际效果。
如何确保试验结果的准确性和可重复性是一大挑战。
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中国水稻科学(Chin J Rice Sci ), 2018, 32(3): 277－284 DOI: 10.16819/j.1001-7216.2018.7074 277水稻纹枯病拮抗细菌7-5的鉴定及其生防机制初步研究张清霞 张迎 何玲玲 陈夕军* 童蕴慧 纪兆林(扬州大学 园艺与植物保护学院，江苏 扬州 225009； * 通讯联系人，E-mail ：xjchen@)Identification of Strain 7-5, Antagonistic to Rice Sheath Blight, and Preliminary Study of Its Biocontrol MechanismZHANG Qingxia, ZHANG Ying, HE Lingling, CHEN Xijun *, TONG Yunhui, JI Zhaolin(College of Horticulture and Plant Protection , Yangzhou University , Yangzhou 225009, China ；*Corresponding author , E-mail: xjchen@ )Abstract ：【Objective 】The objective is to obtain antagonistic bacteria for biocontrol on rice sheath blight and reveal the biological control mechanism. 【Method 】The control experiment of rice sheath blight by seven antagonistic bacteria stored in our lab was performed using pot cultures at the seedling stage. The strain 7-5 was identified based on a 16S rDNA BLAST and the strain ’s physiological and biochemical characterization. The antifungal compounds produced by bacterial strain 7-5 were detected by PCR amplification and thin layer chromatography (TLC). 【Result 】The suppressive effects of bacteria 7-5, 4-74 and 4-78 on the rice sheath blight in a greenhouse were as high as 69.0%, 70.8% and 75.4%, respectively. Strain 7-5 could strongly inhibit the growth of Rhizoctonia solani , Monilinia fructicola and Botrytis cinerea , whereas both strains 4-74 and 4-78 had narrow inhibitory spectra. Strain 7-5 was identified as Pseudomonas chlororaphis and produced many antifungal factors, including phenazine-1-carboxylic acid, 2,4-diacetylphloroglucinol, pyoluteorin, siderophores, hydrogen cyanide and extracellular proteinase, but not including pyrrolnitrin, chitinase and cellulase. 【Conclusion 】The production of antibiotics plays a key role for P. chlororaphis 7-5 to control the rice disease. Key words ：Pseudomonas chlororaphis ；rice sheath blight ；antibiotics ；biological control摘 要：【目的】旨在获得对水稻纹枯病有生防效果的拮抗细菌，探索生防细菌作用机理。
【方法】通过苗期防病试验从本实验室保存的7株拮抗细菌中筛选对水稻纹枯病有较好防病效果的菌株。
结合生理生化性状和16S rDNA 基因序列同源性分析，对生防细菌7-5进行初步鉴定，并通过PCR 扩增、薄层层析等探讨7-5产生抗生素的种类。
【结果】供试7株细菌中7-5、4-74和4-78对水稻纹枯病防效分别可达69.0%、70.8%和75.4%。
其中4-74和4-78抑菌谱窄，7-5对水稻纹枯病菌、桃褐腐病菌和草莓灰霉病菌都具有较强抑菌能力。
菌株7-5 鉴定为绿针假单胞菌；该菌株可产生吩嗪-1-羧酸、嗜铁素、氢氰酸、蛋白酶、藤黄绿脓菌素和2，4-二乙酰基间苯三酚等抗菌物质，不产生硝吡咯菌素、几丁质酶和纤维素酶。
【结论】绿针假单胞菌 7-5主要通过产生抗生素防治水稻纹枯病。
关键词：绿针假单胞菌；水稻纹枯病；抗生素；生物防治 中图分类号：S435.111.4+2; S435.111.4+9 文献标识码：A 文章编号：1001-7216(2018)03-0277-08由立枯丝核菌(Rhizoctonia solani )引起的水稻纹枯病是一种世界性病害，在世界各主要水稻产区都有发生且危害严重。
近年来，随着矮秆多蘖品种的推广，水稻密集型栽培方式的采用，以及氮肥施用量的不断增加，纹枯病的危害逐年加重，在我国各稻区已经成为最严重的水稻病害之一。
目前，对于该病害的防治主要是以化学防治为主，但随着近年来该病害发生的不断加重，对于药剂的使用量也逐年增加，导致农药残留日趋严重[1]。
尽管井冈霉素对纹枯病防治效果较好，但经过长期使用在田间[2]治技术和方法迫在眉睫。
生物防治具有对人畜安全、对环境压力小、不易诱导病菌产生抗药性等优点，有的生防菌还可以促进农作物生长，因而具有广阔的发展前景。
许多微生物对水稻纹枯病菌有较强的拮抗能力，如链霉菌(Streptomyces )[3]、禾长蠕孢菌(Helminthosporium gramineum )[4]、假紫色色杆菌(Chromobacterium pseudoviolaceum )[5]、芽孢杆菌(Bacillus )[6]、假单胞菌(Pseudomonas ) 和木霉(Trichoderma )[7]等。
不同微生物对水纹枯病菌作用[4]278 中国水稻科学(Chin J Rice Sci) 第32卷第3期(2018年5月)孢假壳素来防治水稻纹枯病，发现该物质能明显减轻水稻纹枯病，而且对水稻的生长无任何副作用，亦不影响产量和品质。
稠李链霉菌JAU4234对水稻纹枯病菌作用机制是抑制菌丝生长、抑制致病因子表达和蛋白质合成[3]。
陈思宇报道荧光假单胞菌XF-174对水稻纹枯病的盆栽和田间小区防效均为40%以上，该细菌主要产生蛋白酶、嗜铁素、赤霉素等次生代谢产物，不产生几丁质酶、纤维素酶和吲哚乙酸[8]。
已报道的生防细菌中，假单胞菌由于其独特的种群优势，应用其防治植物病害已成为当前研究的热点。
假单胞菌属细菌是植物根际土壤微生态的优势微生物种群之一，具有分布广、数量多、营养要求简单、繁殖快、竞争定殖力强的特点[9]。
而在众多的假单胞属细菌中分离得到最多且研究比较深入的有绿针假单胞菌(P. chlororaphis)、荧光假单胞菌(P. fluorescens)以及铜绿假单胞菌(P. aeruginosa)。
其作用机制主要产生次生代谢产物包括抗生素吩嗪-1-羧酸(phenazine-1-carboxylic acid，PCA)、2,4-二乙酰基间苯三酚(2,4-diacetylphloroglucinol，PHL)、硝吡咯菌素(pyrrolnitrin，PRN)、藤黄绿脓菌素(pyoluterorin，PLT)、假单胞菌酸(pseudomonic acid)、氢氰酸和植物生长素吲哚乙酸(indole-3-acetic acid，IAA)，挥发性有机化合物如3-羟基-2-丁酮及2R，3R-丁二醇等[10-11]。
在水稻纹枯病生物防治中，利用生防细菌抑制病原物侵染提高植物抗病能力是一条有效途径。
为挖掘更多的生防资源，我们从实验室保存的生防菌中筛选对水稻纹枯病防病效果强的拮抗细菌，通过16S rDNA 序列分析和生理生化性状测定，明确菌株7-5 的分类地位，并对其可能的生防性状进行初步探索。
1 材料与方法1.1材料供试水稻为纹枯病感病品种Lemont。
供试细菌为4-78、10-3、12-4、7-5、4-74、HTC-1、HTC-5、W10，均为本实验室保存。
其中，解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)W10是本实验室保存的一株抑菌谱广、对多种植物病害都有较好防病效果的生防细菌，本研究中以该细菌作为参照菌株。
供试真菌包括病原真菌水稻纹枯病菌(Rhizoctonia solani)、油菜菌核病菌(Sclerotinia sclerotiorum)、桃褐腐病菌(Monilinia fructicola)、稻瘟病菌(Pyricularia grisea)、草莓灰霉病菌(Botrytis cinerea)、辣椒疫霉病菌(Phytophthora capsici)，均由本实验室保存。
所用试剂Taq DNA聚合酶、dNTP，购于TaKaRa 公司；2,4-二乙酰基间苯三酚、乙酰丙酮铜和4,4’-对二甲氨基二苯基甲烷由中国农业大学张力群教授馈赠；藤黄绿脓菌素和吩嗪-1-羧酸纯品由上海交通大学张雪洪教授馈赠；其他试剂均为国产分析纯。
所用培养基包括金氏B培养基[12]、几丁质酶检测培养基[13]、蛋白酶检测培养基[14]、纤维素酶检测培养基[15]、嗜铁素检测培养基[16]、PPM培养基[17]。
1.2苗期防病试验参考陈夕军[18]的方法略作修改。
将水稻纹枯病感病品种Lemont种子经1%双氧水浸泡1 d后，再用清水浸泡2 d左右，浸种温度为30℃。
待绝大多数种子发芽后分别播于直径20 cm的塑料盆中，每盆栽种10粒种子，待水稻长成4叶1心时接种，去除大于4叶和小于3叶的植株，各重复均保留7株苗。