N-H的乙酰化
一种测定羟丙基壳聚糖N-取代度、总取代度和乙酰化度的方法[发明专利]
![一种测定羟丙基壳聚糖N-取代度、总取代度和乙酰化度的方法[发明专利]](https://img.taocdn.com/s3/m/8b895e224531b90d6c85ec3a87c24028915f8596.png)
(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201810987193.2(22)申请日 2018.08.28(71)申请人 青岛科技大学地址 266000 山东省青岛市市北区郑州路53号(72)发明人 张永勤 张凤国 王鹏博 许文廷 邢明霞 吕兴霜 张坤 (74)专利代理机构 青岛中天汇智知识产权代理有限公司 37241代理人 郝团代(51)Int.Cl.G01N 24/08(2006.01)(54)发明名称一种测定羟丙基壳聚糖N -取代度、总取代度和乙酰化度的方法(57)摘要本发明公开一种测定羟丙基壳聚糖N -取代度、总取代度和乙酰化度的方法，具体包括以下步骤：样品制备：a.干燥羟丙基壳聚糖样品；b.向干燥好的羟丙基壳聚糖样品中加入氘代试剂，直至将其完全溶解；样品测试：通过核磁共振仪获得羟丙基壳聚糖的核磁共振图谱；数据处理：从得到的核磁共振谱图中，首先进行波谱归属，然后进行各质子峰的面积积分与计算；得到羟丙基壳聚糖N -取代度、总取代度和乙酰化度的计算公式。
本申请能检测出两个独立的H 9-N 质子峰和H 9-O 质子峰，通过H 9-N 质子峰可探知羟丙基壳聚糖分子中发生氨基的羟丙基化的糖单元的比例。
相对于现有技术中的取代度的测定方法，本发明归属更为明确、细致，测定更为准确、多指标高效、简便、快速。
权利要求书2页 说明书9页 附图3页CN 109211957 A 2019.01.15C N 109211957A1.一种测定羟丙基壳聚糖N-取代度的方法，其特征在于，具体包括以下步骤：(1)样品制备a.干燥羟丙基壳聚糖样品，将其水分控制在4％以下；b.向干燥好的羟丙基壳聚糖样品中加入氘代试剂，直至将其完全溶解；(2)样品测试将步骤(1)中制备的样品置于核磁共振仪中，获得羟丙基壳聚糖的核磁共振图谱；(3)数据处理从(2)步骤得到的核磁共振谱图中，首先进行波谱归属，然后进行各质子峰的面积积分与计算；波谱归属为1.22ppm左右的质子峰为与氨基相连的羟丙基上的甲基质子峰，其积分为H9-N；波谱归属为4.9ppm左右的质子峰为氨基未被取代的糖单元上的异头碳质子峰，其积分为H1-D；波谱归属为2.05ppm左右的质子峰为与氨基相连的乙酰基上的甲基质子峰，其积分为H Ac，则N-取代度的计算公式如下：2.根据权利要求1所述的一种测定羟丙基壳聚糖N-取代度的方法，其特征在于，所述步骤(3)的数据处理中，波谱归属为5.0ppm左右的质子峰为氨基被羟丙基取代的糖单元上的异头碳质子峰，其积分为H1-S；波谱归属为4.6ppm左右的质子峰为氨基被乙酰化了的糖单元上的异头碳质子峰，其积分为H1-Ac；H Ac/3等同替换为H1-Ac，H1-S等同替换为H9-N/3，则N-取代度的计算公式如下：3.根据权利要求1所述的一种测定羟丙基壳聚糖N-取代度的方法，其特征在于，用于测定羟丙基壳聚糖总取代度的方法，所述步骤(3)中波谱归属为1.22ppm左右的质子峰为与氨基相连的羟丙基上的甲基质子峰，其积分为H9-N；波谱归属为1.11ppm左右的质子峰为与C6位和C3位羟基相连的羟丙基上的甲基质子峰，其积分为H9-O，H9-N和H9-O这两个甲基质子峰的总积分为H9；则总取代度的计算公式如下：4.根据权利要求3所述的一种测定羟丙基壳聚糖N-取代度的方法，其特征在于，用于测定羟丙基壳聚糖总取代度的方法，所述步骤(3)的数据处理中，波谱归属为5.0ppm左右的质子峰为氨基被羟丙基取代的糖单元上的异头碳质子峰，其积分为H1-S；波谱归属为4.6ppm左右的质子峰为氨基被乙酰化了的糖单元上的异头碳质子峰，其积分为H1-Ac；H Ac/3等同替换为H1-Ac，H1-S等同替换为H9-N/3，则总取代度的计算公式如下：5.根据权利要求1所述的一种测定羟丙基壳聚糖N-取代度的方法，其特征在于，用于测定羟丙基壳聚糖的乙酰化度DA的方法，则乙酰化度DA的计算公式如下：6.根据权利要求1-5任一所述的一种测定羟丙基壳聚糖N-取代度的方法，其特征在于，所述的羟丙基壳聚糖的结构式如下：其中，与氨基相连的羟丙基基团上的羟基为仲羟基，与羟基相连的羟丙基基团上的羟基为伯羟基。
表观遗传之组蛋白修饰—组蛋白乙酰化解决方案
表观遗传之组蛋白修饰—组蛋白乙酰化解决方案一、组蛋白乙酰化作用越来越多的证据表明：组蛋白乙酰化在转录调控中的作用机制表现为：①组蛋白尾部乙酰基的加入，中和了组蛋白的电荷，弱化了组蛋白与DNA的相互作用，疏松了染色质结构，有利于转录的进行，②组蛋白的乙酰化可以为转录因子的招募提供特异性的锚定位点：③组蛋白乙酰化结合其他组蛋白修饰（甲基化，磷酸化、泛素化）形成组蛋白密码影响基因的转录。
二、组蛋白乙酰化修饰蛋白乙酰化：在乙酰基转移酶的作用下，在蛋白质赖氨酸残基上添加乙酰基的过程。
组蛋白乙酰化：是一种翻译后修饰，多发生在核心组蛋白N一端碱性氨基酸集中区的特定赖氨酸残基，将乙酰辅酶A的乙酰基转移到赖氨酸的sNH3+中和掉1个正电荷。
由组蛋白乙酰转移酶（HATs）和组蛋白去乙酰基转移酶(histone deacetylase，HDACs)共同决定。
重要性：通过研究组蛋白乙酰化和组蛋白脱乙酰化，研究人员可以对“组蛋白密码”有更多的了解，可以研发HDAC的药物，组蛋白脱乙酰基酶抑制剂（HDACi）通常用作情绪稳定剂和抗癫痫药，最近已被用作可能的癌症，神经退行性疾病和炎性疾病的治疗方法。
三、组蛋白乙酰化相关研究工具1.组蛋白提取试剂盒在我们进行某项实验之前首先需要做很多的准备工作，比如组蛋白修饰实验，需要准备的是组蛋白。
那么我们怎么来准备适合我们实验需要的组蛋白呢？取决于你用的提取试剂盒。
比如OP-0006 EpiQuik Total Histone Extraction Kit(100)：适合从哺乳动物的细胞或者组织中提取总核心组蛋白(H2A, H2B, H3, and H4)，组蛋白提取物中的翻译后修饰（PTM）保持完整，因此可与Epigentek的组蛋白修饰测定试剂盒一起使用，或用于组蛋白甲基化，乙酰化，磷酸化，SUMO化，泛素化，瓜氨酸化和ADP-核糖基化研究。
2.组蛋白乙酰化定量试剂盒组蛋白乙酰化，包括组蛋白H3和组蛋白H4，参与染色质结构的调节和转录因子向基因启动子的募集。
26-第10章 基因组表观遗传-组蛋白乙酰化
人类 基因 组组 蛋白 修饰 作图
上图图示为Chr.21染色质的部分作图结果，下面为染色质免疫沉淀抗体： H3K4me1, H3K4me2, H3K4me3; H3K9me1, H3K9me2, H3K9me3; H3K27me1, H3K27me1, H3K27me3; H3K36me1, H3K36me3; H3K79me1，H3K79me2, H3K79me3; H4K20me1, H4K20me3; H3R2me2 (as), H2A+H4R3me2, H2BK5me1, H2A.Z, Pol II, CTCF
HAT功能域有四个保守的基序（A,B,C和D）。 染色质又被去乙酰化。
组蛋白去乙酰化酶家族
根据功能与DNA序列相似性,将组 蛋白去乙酰化酶分为四大类: HDACI (histone deacetylase 1): HDAC1, HDAC2, HDAC3和 HDAC8. HDAC1, HDAC2和 HDAC8主要分布于细胞核, HDAC3主要分布于细胞质; HDACII (histone deacetylase 2): HDAC4, HDAC5, HDA6C, HDAC7, HDAC8，HDAC9 和HDAC10, 类同于HDACI. HDACII可在细胞核和细胞 质之间穿梭分布. HDACIII(histone deacetylase 3): SIRT1, SIRT2, SIRT3, SIRT4, SIRT5, SIRT6 和 SIRT7. HDACIV (histone deacetylase 4): HDAC11, 非典型去乙酰化酶.
-
组蛋白乙酰化酶
根据在细胞中的分布特点， 传统上将HA T 分为两大类。 A 型：位于细胞核，通过 核小体组蛋白的乙酰化调 控基因表达，可识别并乙 酰化组蛋白赖氨酸, Gcn5 p300/CBP和TAF11 250属 于此类，含bromodomain 结构域。B型：位于细胞 质，在组装为核小体前将 组蛋白乙酰化。B型HA T 缺少bromodomain结构域， 其功能是将新生的核心组 蛋白乙酰化。这些乙酰化 组蛋白一旦进入核内渗入
肽链书写规则
肽链书写规则常用的多肽的书写有两种形式——单字母和三字母形式。
无论是哪一种形式书写。
只要是同一条肽链，则它所表达的多肽结构就是一样的。
书写出来的多肽序列不仅仅是自己能明白，让其他人可以正确理解。
为避免出现解读分歧；国际上统一规定：多肽的N端（氨基端）在最左边，多肽的C端（羧基端）在最右边。
1.多肽的单字母书写形式顾名思义就是一个字母代表一个氨基酸（方便记录和书写）。
氨基酸的单字母选择也不是随意的。
目前我们通用的单字母规则主要是常见的20种氨基酸，氨基酸用大写字母（L-氨基酸）表示。
例如A 表示L-丙氨酸（Alanine）、C表示L-半胱氨酸（Cysteine）和G表示L-甘氨酸（Glycine）。
如果氨基酸的构型改变，例如D-丙氨酸（Alanine），在用单字母表示时，我们则是用小写字母表示。
例如D-丙氨酸（Alanine）用a表示，D-异亮氨酸（Isoleucine）用i表示和D-甲硫氨酸（Methionine）用m表示。
多肽序列单字母书写举例①多肽序列1: G T F L V R C D M A，共10个氨基酸，所有字母均是大写，则表示所有的氨基酸均是天然存在的L型氨基酸。
②多肽序列2：G T F L v R C d M A，共10个氨基酸，序列里面有两个氨基酸是小写，说明对应的两个氨基酸是D型氨基酸。
③多肽序列1：G T F L V R C D M A 也可以写成H-G T F L V RC D M A-OH，左边的H- 代表N端的氨基，右边的-OH 代表C端的羧基。
不过一般通常为了美观整齐，H-和-OH同时写或同时不写。
④多肽序列3：G T F L V R C D M A-NH2，与多肽序列1的区别是，右边多了-NH2，代表C端酰胺化。
⑤多肽序列4：AC-G T F L V R C D M A,与多肽序列1的区别是，左边多-AC，代表N端乙酰化。
2多肽的三字母书写形式顾名思义就是三个字母代表一个氨基酸，并且三字母和前面提到的单字母是一一对应关系。
《分子生物学》习题及答案解析.doc
分子生物学习题及答案第1章序言1.简述孟德尔、摩尔根和Waston等人对分子生物学发展的首要奉献。
孟德尔是遗传学的奠基人，被誉为现代遗传学之父。
他经过豌豆试验，发现了遗传学三大根本规律中的两个，别离为别离规律及自在组合规律。
摩尔根发现了染色体的遗传机制，创建染色体遗传理论，是现代试验生物学奠基人。
于1933年因为发现染色体在遗传中的效果，赢得了诺贝尔生理学或医学奖。
Watson于1953年和克里克发现DNA双螺旋结构一（包含中心法则）,取得诺贝尔生理学或医学奖，被誉为''DNA之父”。
2.写出DNA、RNA、mRNA和siRNA的英文全名。
DNA： deoxyribonucleic acid 脱氧核糖核酸RNA： ribonucleic acid 核糖核酸mRNA： messenger RNA 信使RNAtRNA： transfer RNA 转运RNArRNA： ribosomal RNA 核糖体RNAsiRNA： small interfering RNA 搅扰小RNA3.试述''有其父必有其子”的生物学实质。
其生物学实质是基因遗传。
子代的性状由基因决议，而基因因为遗传的效果，其基因的一半来自于父方，一般来自于母方。
4.早期首要有哪些试验证明DNA是遗传物质？写出这些试验的首要进程。
1）肺炎链球菌转化试验：表面光滑的S型肺炎链球菌（有荚膜多糖一致病性）；表面粗糙R型肺炎链球菌（无荚膜多糖）。
%1活的S型一打针一试验小鼠一小鼠死亡%1死的S型（经烧煮灭火）一打针一试验小鼠一小鼠存活%1活的R型一打针一试验小鼠一小鼠存活%1死的S型+活的R型一试验打针一小鼠死亡%1别离被杀死的S型菌体的各种组分+活的R型菌体一打针一试验小鼠一小鼠死亡（内只要死的S型菌体的DNA转化R型菌体导致致病菌）*DNA是遗传物质的载体2）噬菌体侵染细菌试验%1细菌培育基35S符号的氨基酸+无符号噬菌体一培育1-2代一子代噬菌体简直不含带有35S符号的蛋白质%1细菌培育基32N符号的核昔酸+无符号噬菌体一培育1-2代一子代噬菌体含有30% 以上32N符号的核昔酸*噬菌体传代进程中发挥效果的或许是DNA而不是蛋白质。
精细有机合成技术：N-酰化反应基本原理
第二节 N-酰化反应
间苯二胺与等摩尔的盐酸作用，生成间苯二胺的单盐酸盐，然后控制在 40℃以下加入过量5%的乙酐，将得到间乙酰氨基苯胺的盐酸盐。
将H-酸悬浮在水中，用NaOH调节pH为6.7～7.1，在30～50℃滴加稍过量的 乙酐可以制得N-乙酰基-H-酸。
在酰化剂分子中，X是—OH时，酰化剂是羧酸；X是—OCOR时，酰化剂是 酸酐；X是—Cl时，酰化剂是酰氯。
第二节 N-酰化反应
2. N-酰化影响因素 （1）酰化剂的活性的影响 酰化剂的反应活性取决于羰基碳上部分正电荷
的大小，正电荷越大反应活性越强。对于R相同的羧酸衍生物，离去基团X的吸 电子能力越强酰基上部分正电荷越大。所以其反应活性如下：
通常对于活泼的胺，化方法 第二节 N-酰化反应
1. 用羧酸的N-酰化 羧酸是最廉价的酰化剂，用羧酸酰化是可逆过程。
为了使酰化反应尽可能完全，并使用过量不太多的羧酸，必须除去反应生成 的水。如果反应物和生成物都是难挥发物，则可以不断地将反应生成的水蒸出； 如果反应物能与水形成共沸混合物冷凝后又可与水分层，则可以采用共沸蒸馏， 冷凝后使有机层返回反应器。也可以加苯或甲苯等能与水形成共沸混合物帮助脱 水。少数情况可以加入化学脱水剂如五氧化二磷，三氯化磷等。
第二节 N-酰化反应
由于酰化时生成的氯化氢与游离氨结合成盐，降低了N-酰化反应的速度， 因此在反应过程中一般要加入缚酸剂来中和生成的氯化氢，使介质保持中性或 弱碱性，并使胺保持游离状态，以提高酰化反应速度和酰化产物的收率。但是， 介质的碱性太强，会使酰氯水解，同时耗用量也增加。常用的缚酸剂有：氢氧 化钠、碳酸钠、碳酸氢钠、醋酸钠及三乙胺等有机叔胺。但是，酰氯与氨或易 挥发的低碳脂肪胺反应时，则可以用过量的氨或胺作为缚酸剂。在少数情况下， 也可以不用缚酸剂而在高温下进行气相反应。
n-酰基氨基酸盐
n-酰基氨基酸盐1. 概述n-酰基氨基酸盐（N-acetyl amino acid salt）是一类化合物，其中n-酰基氨基酸是一种氨基酸衍生物，是由氨基酸的羧基和乙酰化剂反应得到，形式上是将羧基中的H替换成(CH3)2CO基团得到的产物。
其盐形式是指其与阳离子形成的结晶物，如Na+、K+等。
该类化合物广泛应用于医药、食品、保健品等领域，具有调节血糖、抗衰老、抗氧化等功能，具有良好的应用发展前景。
2. 合成方法n-酰基氨基酸的合成方法有多种，其中最常见的方法是通过羧基和乙酰化剂在氢氧化钠缓冲溶液中反应得到。
反应过程中，乙酰化剂可以选择醋酸酐或醋酸乙酯等。
反应后，可以通过结晶、过滤、干燥等方法得到纯品。
例如，以天冬氨酸为例，其合成反应式为：NH2CH(COOH)CH2COONa + (CH3CO)2O → NH2CH(COCH3)CH2COONa + CH3COOHn-酰基氨基酸盐的制备方法是将n-酰基氨基酸加入适量的水中，加入氢氧化钠缓冲溶液，搅拌溶解，再加入需要的阳离子，如Na+、K+等，搅拌均匀后，过滤，冷却结晶、干燥即可得到n-酰基氨基酸盐。
3. 应用（1）保健品领域：n-酰基氨基酸盐可以作为保健品的重要原料。
其具有调节血糖、抗衰老、抗氧化等功能，可以用于改善体质、提高免疫力等。
（2）医药领域：n-酰基氨基酸盐在医药领域也得到了广泛的应用。
通过改善血糖、降低血脂、抗肿瘤、抗感染等作用，可以用于预防糖尿病、高血压、心血管疾病、癌症等，具有广泛的应用前景。
（3）食品领域：n-酰基氨基酸盐可以作为食品添加剂，具有滋补养生作用。
例如，在面包等食品中添加一定量的n-酰基氨基酸盐，可以增加产品的营养价值，改善口感，提高产品销售量。
（4）化妆品领域：由于n-酰基氨基酸盐具有抗氧化、抗衰老等作用，可以作为化妆品添加剂，具有美容护肤的效果。
4. 发展趋势近年来，n-酰基氨基酸盐的应用领域不断扩展，尤其在保健品和医药领域得到了广泛应用。
药物超敏反应综合征
药物超敏反应综合征药物超敏反应综合征（DIHS）是一种以急性广泛的皮损，伴发热、淋巴结肿大、多脏器受累（肝炎、肾炎、肺炎卜嗜酸粒细胞增多及单核细胞增多等血液学异常为特征的严重全身性药物反应。
皮损初发多为斑丘疹或多形性红斑，更为严重者表现为伴面部水肿的剥脱性皮炎、SJS综合症、中毒性表皮坏死松解症。
通常潜伏期2-6周（平均3周）。
症状于停用原因药物之后仍持续发展并转为迁延化往往经过I个月以上缓解，典型DIH S临床表现显示双峰性。
致死率大约10 %，主要死于重症肝炎。
一、病因1•药物：大致限于别嘌呤醇、卡马西平、苯妥英钠、苯巴比妥、拉莫三嗦、氨苯飒、柳氮磺胺吡啶、阿巴卡韦（abac avir,非核昔类逆转录酶抑制剂）、美西律、米诺环素、替考拉宁和阿米替林。
2•病毒感染：每2-6周出现HHV-6周期性的再激活。
DHS是由药物过敏和HHV-6感染再激活共同导致的疾病。
3. 遗传：DHS的易感性很可能是多基因遗传。
大多数药物的乙酰化是由N-乙酰转移酶2（N AT2来完成，而乙酰化的表型（快、中、慢）与N AT2基因型相关，只有快乙酰化表型能保护机体免遭药物活性代谢产物所引起的损害。
慢乙酰化基因的表达是DHS的一个危险因子。
另有证据表明，与细胞色素P450亚型等药物代谢酶异构体及P糖蛋白等药物转运体相关的基因一旦发生变异机体对药物代谢产物的解毒力下降，增强患者对药物代谢产物的易感性。
人类白细胞抗原（H LA研究发现多个等位基因DHS的遗传危险因子。
4•原有疾病患有SLE肾功能不全、恶性肿瘤、艾滋病等原有疾病者，发生DI H S的机会增加。
二、发病机制确切发病机制尚不清楚。
目前认为，DHS是由药物及病毒再激活引发的免疫过敏反应。
存在两个关键阶段：早期存在以B细胞及免疫球蛋白（尤其是IgG）明显减少为特征的免疫抑制，这种免疫抑制一方面引发H HV-6再激活，另一方面又抑制了药物特异性T细胞活化，因而发病较一般药疹更为迟后。