核酸分子杂交技术与核酸序列测定
核酸分子杂交名词解释
核酸分子杂交名词解释核酸分子杂交是一种重要的分子生物学技术，用于研究核酸的结构、功能和相互作用，并在基因克隆、基因表达调控等领域具有广泛的应用。
以下是与核酸分子杂交相关的重要名词的解释：1. 核酸分子杂交（Nucleic Acid Hybridization）：指将两个不同的核酸分子（DNA或RNA）通过互补的碱基配对形成双链结构的过程。
核酸分子杂交可用于分析DNA或RNA的序列、测定基因表达水平以及检测特定的核酸序列。
2. 探针（Probe）：一条含有特定序列的标记化核酸分子，用于与目标序列进行杂交。
探针通常由放射性核素、荧光染料或酶等标记物标记，以便于在实验中检测其位置和数量。
3. 靶标（Target）：指待被杂交的目标核酸分子，它可以是DNA或RNA，含有待检测或待分析的特定序列。
靶标可以来自于生物样品，如组织、细胞或血清等。
4. 互补序列（Complementary Sequence）：两条核酸分子间相互配对的碱基序列。
在DNA分子中，腺嘌呤（A）与鸟嘌呤（G）通过双氢键相互配对，胸腺嘧啶（T）与胞嘧啶（C）相互配对；在RNA分子中，腺嘌呤（A）与尿嘧啶（U）相互配对，胸腺嘧啶（T）与胞嘧啶（C）相互配对。
5. 杂交化（Hybridization）：指探针与靶标间通过互补序列形成双链结构的过程。
杂交化通常需要一定的时间和温度条件，以保证探针和靶标的互补碱基序列能够正确配对。
6. 杂交化条件（Hybridization Conditions）：影响探针和靶标杂交的因素，包括温度、盐浓度、引物浓度、溶液pH值等。
不同的杂交化条件可选择性地控制互补序列的结合和分离，从而改变杂交的特异性和灵敏度。
7. 杂交化信号（Hybridization Signal）：当探针与靶标杂交时，由于探针上的标记物，如放射性同位素或荧光染料的发光、发射或放射活性，而产生的信号。
通过检测杂交化信号的强度和位置，可以确定探针与靶标的结合情况，以及目标序列的存在与数量。
核酸杂交技术全解
（二）Southern印迹杂交
Southern印迹杂交（Southern blot hybridization/ Southern blotting）是指DNA与 DNA分子之间的杂交。 可用于基因组DNA的定性与定量分析，重组质粒 和噬菌体的分析等。
（二）Southern印迹杂交
包括两个主要过程： 将待测定核酸分子通过一定的方法转移并结合到 一定的固相支持物（硝酸纤维素膜或尼龙膜）上， 即印迹（blotting）。 固定于膜上的核酸与同位素标记的探针在一定的 温度和离子强度下退火，即分子杂交过程。
Southern印迹
凝胶中DNA分离带
凝胶中DNA 的NaOH变
性
探针杂交带曝光显 影
Southern杂交的应用
应用 单基因遗传病的基因诊断
基因点突变的检测
临床应用－－用于下列疾病的产前诊断 镰型细胞贫血 苯丙酮酸尿症 珠蛋白合成障碍性贫血 假肥大型肌营养不良 血友病 慢性进行型舞蹈病
(4) cDNA探针的标记 (5) 寡核苷酸探针的标记 (6) 单链DNA探针的标记 (7) RNA探针的标记
（1）DNA随机引物标记
随机引物：含有各种可 能排列顺序的寡核苷酸 片段的混合物。
DNA聚合酶ⅠKlenow片段： 保 留 5’→3’DNA 聚 合 酶 活性,弱3’→5’外切酶 活 性 ， 无 5’→3’ 外 切 酶活性。
根据杂交探针标记 • 同位素杂交 • 非同位素杂交
根据杂交介质 • 液相杂交 菌落杂交
Southern印迹杂交 • 固相杂交 Northern印迹杂交
点杂交 • 原位杂交 狭缝杂交
分子杂交技术一般过程
☆ 探针制备及标记（同位素或非同位素） ☆ 待测核酸样品制备（分离，纯化） ☆ 杂交（液相，固相，原位杂交） ☆ 杂交后处理（去掉非特异杂交分子） ☆ 显示结果（显色，发光，放射自显影） ☆ 结果分析
[说明]核酸分子杂交及PCR技术
![[说明]核酸分子杂交及PCR技术](https://img.taocdn.com/s3/m/cd08778f50e79b89680203d8ce2f0066f53364c4.png)
核酸的分子杂交技术一、核酸分子杂交用标记的已知DNA或RNA片段（探针）来检测样品中未知核酸序列，通过核苷酸间碱基互补的原则发生异源性结合，再经显影或显色的方法，将结合核酸序列的位置或大小显示出来。
待测的核酸序列，可以是克隆的基因片段，也可以是未克隆化的基因组DNA和组织细胞的RNA。
二、核酸分子杂交的分类液相杂交核算分子杂交印记杂交固相杂交原位杂交1.固相杂交：将需要杂交的一条核酸链先固定在固体支持物上，另一条核酸链游离在液体中。
2.液相杂交：参与反应的两条核酸链都游离在液体中。
常用固相杂交类型：Southern印迹杂交、Northern印迹杂、菌落原位杂交、斑点杂交、狭缝杂交、组织原位杂交、夹心杂交等。
三、核酸分子杂交的基本原理1、变性：在某些理化因素的作用下，核酸双链分子碱基对的氢键断裂，疏水作用被破坏，双链螺旋或发夹结构被拆开，有规则的空间结构被破坏，形成单链分子，称为核酸的变性。
﹡引起核酸变性的因素：热、酸、碱、化学试剂（如：尿素、甲酰胺、甲醛等）。
﹡加热变性是最常用的方法，一般加热80-100℃数分钟即可使核酸分子氢键断裂，双链分开。
﹡变性的核酸分子失去了生物活性，同时理化性质也随之改变，其紫外吸收值（A260）也随之升高。
可用紫外吸收的变化来跟踪DNA的变性过程。
以A260吸收值对应温度作图，得到DNA的变性曲线或熔解曲线。
增色效应：DNA变性后对260nm紫外光收增加的现象。
DNA热变性现象双螺旋结构即发生解体，两条链分开形成无规则线团。
同时，一系列物化性质发生改变：260nm处紫外吸收值升高，粘度降低，浮力密度升高。
由于二级结构的丧失，也失去了部分或全部生物活性。
增色效应和减色效应当DNA分子加热变性后，其260nm的紫外吸收会急剧增加的现象称为增色效应。
变性DNA复性后，在260nm处的吸收值减少的现象称为减色效应。
A260值达到最大值1/2时的温度称为解链温度或熔解温度（melting temperature,Tm)，此时50%的DNA分子发生了变性。
核酸分子杂交实施方案
核酸分子杂交实施方案核酸分子杂交是一种重要的实验技术，广泛应用于生物学、医学和生物化学领域。
它通过核酸序列的互补配对来检测、定量和分析特定的核酸分子，因此在基因克隆、基因表达调控、病毒检测等方面有着重要的应用价值。
下面将介绍核酸分子杂交的实施方案，包括实验材料准备、实验步骤和结果分析等内容。
实验材料准备。
1. 核酸探针，根据实验需要设计合适的核酸探针，通常选择20-30个碱基长度的寡核苷酸序列作为探针。
2. 核酸标记物，可以选择放射性同位素标记、酶标记或荧光标记的核酸标记物。
3. 核酸杂交缓冲液，包括盐类、缓冲剂、表面活性剂等成分，用于维持核酸的稳定性和杂交反应的进行。
4. 核酸杂交膜，选择适合的膜材料，如硝酸纤维素膜、尼龙膜等，用于固定核酸样品和进行杂交反应。
5. 核酸杂交仪器，包括恒温振荡器、放射自显影仪等设备，用于控制反应条件和检测结果。
实验步骤。
1. 核酸样品制备，从细胞、组织或体液中提取核酸样品，并进行纯化和定量处理。
2. 核酸标记，将核酸样品与核酸标记物进行反应，标记核酸样品，使其具有检测信号。
3. 核酸杂交，将标记的核酸样品与核酸探针共同加入核酸杂交缓冲液中，进行恒温振荡反应，使其发生互补配对杂交。
4. 杂交膜固定，将杂交反应产物通过滤纸吸附或紫外交联的方式固定在核酸杂交膜上。
5. 杂交膜检测，利用放射自显影仪或荧光成像系统对固定的核酸杂交膜进行检测，观察杂交信号强度和位置。
结果分析。
根据核酸杂交膜的检测结果，可以分析样品中特定核酸序列的存在与否、数量的多少以及位置的分布等信息。
通过比对标准曲线或对照样品，可以定量分析目标核酸的含量，并进行统计学处理和结果解释。
总结。
核酸分子杂交是一种重要的实验技术，通过合理的实施方案和严格的实验操作，可以获得准确、可靠的实验结果。
在实验中需要注意核酸样品的处理和标记、杂交条件的控制、杂交反应产物的固定和检测等关键步骤，以确保实验的成功进行和结果的可靠性。
分子诊断学知识点总结
分子诊断学知识点总结分子诊断学是指利用分子生物学的技术和方法，对生物体内的DNA、RNA、蛋白质等分子水平进行诊断和检测的一门学科。
随着分子生物学技术的不断发展和进步，分子诊断学在临床诊断、疾病预防和治疗等方面发挥着越来越重要的作用。
下面将对分子诊断学的基本原理、常见技术和应用进行概述。
一、基本概念1. DNA、RNA和蛋白质的基本结构和功能DNA是生物体内的遗传物质，包含了细胞的遗传信息，主要存在于细胞核中。
RNA是一种中间体分子，可以将DNA中的遗传信息转录成蛋白质。
蛋白质是生物体内的重要分子，是细胞结构和功能的基本单位。
2. 基因突变与疾病基因是决定生物性状的遗传信息的单位，基因突变是指基因序列发生了变化，可能导致蛋白质功能异常，甚至引发疾病。
3. 分子诊断学的基本原理分子诊断学利用分子生物学技术对生物体内的分子进行检测和分析，从而实现疾病的诊断、预防和治疗。
二、常见技术1. 聚合酶链式反应（PCR）PCR是一种在体外扩增DNA片段的技术，可以从少量的DNA样本中扩增出大量的DNA片段，是分子诊断学中常用的技术手段。
2. 核酸杂交技术核酸杂交技术是一种通过DNA或RNA的互补配对进行检测的方法，可以用于寻找特定基因或病毒的存在。
3. 蛋白质质谱分析蛋白质质谱分析是一种通过蛋白质的质量和结构来对蛋白质进行分析和检测的技术。
4. 基因测序技术基因测序技术是一种对DNA序列进行测定和分析的技术，可以帮助人们了解基因的结构和功能。
5. 基因芯片技术基因芯片技术是一种可以在一个芯片上同时检测多个基因的技术，可以用于疾病的诊断和预测。
三、应用领域1. 临床诊断分子诊断学在临床诊断中可以对各种疾病进行快速和精准的诊断，如肿瘤、遗传病、感染病等。
2. 疾病预防分子诊断学可以通过对病原体的检测和分析，帮助人们预防感染性疾病的发生和传播。
3. 个体化治疗分子诊断学可以根据个体的基因信息，为患者提供个性化的治疗方案，提高治疗的效果和减少副作用。
核酸分子杂交
RNA提取
RNA变性电泳 印迹转移 预杂交 杂交
RNase 具有活性高，不 易灭活 抑制RNase活 性
所有的试剂和器皿都 必须进去除RNase 处理！！
变性处理：甲醛、乙二醛
破坏RNA二级结构
洗膜
放射自显影或化学显色
基本步骤
1. RNA经变性电泳完毕后，可立即将RNA转 移至硝酸纤维素滤膜上。 2. 将该杂交膜夹于两张滤纸中间，用真空烤箱 于80℃干燥0.5-2小时。 3. 预杂交，时间为1-2小时。 4. 杂交 过夜 5. 洗膜 6. 用X光片进行放射自显影，附加增感屏于70℃曝光24-48小时。
Northern 杂交与Southern 杂交很相似。主 要区别是被检测对象为RNA，其电泳在变 性条件下进行,以去除RNA 中的二级结构， 保证RNA 完全按分子大小分离。
变性电泳主要有3 种:
甲醛变性电泳 乙二醛变性电泳
羟甲基汞变性电泳
电泳后的琼脂糖凝胶用与Southern 转移相 同的方法将RNA 转移到硝酸纤维素滤膜上, 然后与探针杂交。
3. 屏蔽防护：利用射线通过物质时，与物 质相互作用使其能量被物质吸收而逐渐 减弱的原理，可以设置一定的屏障物来 进行防护。常用的材料有水、砖、大理 石、混凝土、重金属铅等。
32P
有机玻璃版 铅衣
4. 利用衰变：可利用放射性物质存在自发 衰变，其活性随之减少的原理进行外照 射防护。如：半衰期小于15天的放射性 废物，允许放置10个半衰期后作一般废 物处理。
注意事项 1. DNase I的量 2. dNTP a-P 3. 温度4-16℃
Pol I DNase I
两条链都可 被标记
随机引物合成法
核酸分子杂交的种类及应用
核酸分子杂交摘要:核酸分子杂交技术就是基因工程中重要的研究手段,就是目前生物化学、分子生物学、与细胞生物学研究中应用最广泛的技术之一。
也就是现阶段定性、定量与定位检测DNA与RNA序列片段必须掌握的基本技术与方法。
本文主要介绍了核酸分子的原理,分类以及它的相关应用。
关键词:核酸分子;分类;应用;1、核酸杂交技术的原理核酸分子(DNA、RNA)就是由许多单核苷酸分子通过3,5磷酸二酯键相互连接所形成的生物大分子。
DNA分子双链的形成,DNA的复制,以及RNA的转录等都遵循碱基互补配对原则。
DNA就是由两条互补配对的单核苷酸链通过氢键连接的双链分子。
双链结构的核酸分子在加热、偏碱环境或受尿素、甲酰胺等氢键解离剂的作用,则形成单链分子,称为核酸“变性”。
两条单链核甘酸若有同源顺序,则在一定条件下,她们的碱基互补配对,从而形成双链分子,称为核酸“复性”或核酸“杂交”[1]。
核酸分子杂交就是用核酸分子的变性,复性等理化性质而设计的一种常用技术。
通常利用一种顺序已知,并被放射性同位素标记的核酸片段瞧作为探针,与未知样品的核酸进行分子杂交,如果样品中的核酸与探针有碱基互补顺序就能形成杂交分子。
此时标有同位素或生物素的探针则固定在标本上,用放射性自显影法或免疫组化法可显示出探针[2]。
核酸分子杂交可分为液相杂交、固相杂交与原位杂交[3]。
2、固相分子杂交:将待测的靶核甘酸链预先固定在固体支持物(硝酸纤维素膜或尼龙膜)上,而标记的探针则游离在溶液中,进行杂交反应后,使杂交分子留在支持物上,然后再进行检测与计算。
固相分子杂交又可分为:Southern印迹杂交、Northern印迹杂交、Western印迹杂交、斑点杂交、菌落原位杂交等。
2、1 Southern印迹杂交1975年建立的一种DNA转移方法。
该法利用硝酸纤维素膜(或经特殊处理的滤纸或尼龙膜)具有吸附DNA的功能。
首先用酚提法从待检测组织中提取DNA,然后以限制性内切酶消化待测的DNA片段,接着进行琼脂糖凝胶电泳使DNA按分子量大小分离,电泳完毕后,将凝胶放入碱性溶液中使DNA变性,解离为两条单链。
核酸杂交
•第一节 核酸分子杂交的基本原理 •第二节 核酸探针 •第三节 核酸分子杂交技术
第一节
核酸分子杂交的基本原理
DNA和DNA链、RNA与DNA链或两条RNA链之间， 只要具有一定的互补序列均可在适当的条件下发生杂 交。常用已知的 DNA 或 RNA 的片段作为探针，包括 特异的DNA序列，或转录的RNA序列或cDNA序列， 或人工合成的寡核苷酸片段。
(4)
与核酸分子的结合稳定牢固，
非特异性吸附少。
(5)
具有良好的机械性能。
下面介绍几种常用的固相支持物：
(1) 硝酸纤维素膜：特别适用于蛋白质(如抗体和酶等) 的非放射性标记探针的杂交体系。 (2) 尼龙膜(nylon membrane)：尼龙膜结合单链及双链 DNA和RNA的能力较硝酸纤维素膜更强，耐碱处理适 合于一步法的菌落原位印迹法。 尼龙膜的缺点是不宜使用非同位素探针，即使用各种 蛋白 ( 如 BSA 、牛奶等 ) 进行预杂交，产生的杂交信号 本底较高，与非特异吸附有关。 PVDF膜：比尼龙膜结合力更强，且在预杂交中很容 易被封闭，使用同位素和非同位素探针都可产生较浅 的本底，而且结实耐用，可以多次杂交。
同源样品杂交后，阳性结果产生斑点，故称斑点杂
交。
4.反向斑点杂交(reverse dot hybridization)：直接将不 同的探针点印并固定在膜上，再将待测的DNA样品与 之杂交，这样一次杂交反应就可以判断待测 DNA是否 含有这些探针的同源序列。
5.菌落或噬菌斑杂交(图7-13)。
二、核酸原位杂交
⒊电转法如图7-11所示。
㈣ 印迹类型
Southern印迹杂交法(Southern blot hybridization)(图 7-12)。
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适用于基因表达的检测。
RNA探针
• RNA是单链分子，所以它与靶序列的杂交 反应效率极高
• 早期采用的RNA探针是细胞mRNA探针和 病毒RNA探针。利用mRNA与基因的 DNA 杂交，可以反映出基因的转录状态。
人工合成的寡核苷酸探针
复性
RNA
DNA
1. 原理 DNA的变性与复性
2. 常见条件：加热 S形曲线 解链温度（Tm） A260增高的原因
3. 分子杂交的目的
应 用： (1)检测特定生物有机体之间是否存在
亲缘关系； (2)用来揭示核酸片段中某一特定基因
的存在与否、拷贝数及表达丰度。
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DNA变性的本质是双链间氢键的断裂
Content of Table
前言 1 核酸分子杂交技术的原理 2 核酸探针的制备 3 核酸探针的标记 4 核酸分子杂交技术
前言
核酸分子杂交
把亲源关系较近的，不同生物个体来源的 变性DNA或RNA单链，经退火处理形成DNA-DNA 或DNA-RNA这一过程叫分子杂交。
第一节 核酸分子杂交的
基本原理
二、探针的标记
• 探针标记方法: 放射性和非放射性两种
放射性核素： 32P、35S和3H 非放射性标记物： 1）半抗原：生物素、地高辛素 抗原-抗体反应 2）配体：生物素-亲和素反应 3）荧光素 (FITC、罗丹明) 4）化学发光探针
探针标记方法
• 核酸分子杂交所用的探针几乎都用体外标记法标 记，分为化学法和酶法
例：变性引起紫外吸收值的改变
DNA的紫外吸收光谱 增色效应：DNA变性时其溶液A260增高的现象。
热变性
解链曲线：如果在连续加热DNA的过程中以
温 度 对 A260 （ absorbance ， A ， A260 代 表 溶 液 在 260nm处的吸光率）值作图，所得的曲线称为解 链曲线。
最基本的原则是核酸探针与要检测的核酸之 间在核酸序列上要有高度的特异性
基因组DNA探针
• 真核生物基因组中存在大量的重复序列和 非编码序列，因此选择基因组DNA做探针 时，一定要充分考虑实验目的性
• 利用分子克隆或PCR方法可以获得某一段 特定的DNA序列
cDNA探针
• cDNA是能与mRNA互补的DNA分子，它是 利用RNA分子作模板在逆转录酶作用下产 生的。
• 首先用E.coli的DNAse I 在探针DNA双链上造成缺口， 然后再借助于DNA pol I的5`→3`外切酶活性，切去带有5`磷酸的核苷酸；同时利用该酶5`→3`聚合酶活性，使生物 素或同位素标记的互补核苷酸补入缺口。
• 这两种活性同时作用，缺口不断向3`方向移动，DNA链 上的核苷酸不断为标记的核苷酸取代，成为带有标记的 DNA，纯化除去游离脱氧核苷酸后成为标记DNA探针。
• 化学法P48：利用标记物分子上的活性基团与探 针分子上的基团发生的化学反应直接将标记物结 合到探针分子上。特点是简单、快速、均匀。
• 酶法P48：将标记物预先标记在核苷酸分子上， 然后利用酶促反应将标记的核苷酸分子渗入到探 针分子上去，或将核苷酸分子上的标记基团交换 到探针分子上。
一个想的标记物应满足：
第二节 核酸探针技术及其标记
探针 (probe) P46 经过特殊标记的核酸片段，具有特定的序列，
能够与待测的核酸片段互补结合，因此可用于检 测核酸样品中的特定基因。
一、核酸探针的种类和应用
根据核酸性质和检测目的不同可以分为： （一）基因组DNA探针 （二）cDNA探针 （三）RNA探针 （四）人工合成的寡核苷酸探针
• 利用DNA合成仪，采用化学方法人工合成 寡核苷酸探针
设计寡核苷酸探针的原则
• 1）序列及长度 根据靶分子的序列而定， 长度一般为18-50个核苷酸合适。
• 2）碱基成分 一般G+C含量为40%-60% • 3）探针分子内不存在互补，避免出现“发
夹”结构 • 4）避免单一碱基的重复出现，不超过4个 • 5）与非靶标区域的同源性不超过70%
(1)标记前后探针基本结构、化学性质相同; (2)特异性强、本底低、重复性好； (3)操作简单、节时； (4)安全、无环境污染。
常用探针的标记方法
3.2.1 缺口平移法 3.2.2 随机引物标记法 3.2.3 末端标记法 3.2.4 生物素光照标记法
缺口平移法的原理
• 将DNAase I 的水解活性与大肠杆菌DNA polymerase I 的5`→3`的聚合酶活性和5` →3`的外切酶活性相结合。
Tm：变性是在一个相当窄的温度范围内完成， 在这一范围内，紫外光吸收值达到最大值的 50%时的温度称为DNA的解链温度，又称融解 温 度 (melting temperature, Tm) 。 其 大 小 与 G+C含量成正比。
DNA的复性与分子杂交
DNA复性(renaturation)的定义
一、分子杂交与印迹技术的原理P44
（一）核酸分子杂交 (nucleic acid hybridization ) 在DNA复性过程中，如果把不同DNA单
链分子放在同一溶液中，或把DNA与RNA放 在一起，只要在DNA或RNA的单链分子之间 有一定的碱基配对关系，就可以在不同的分 子之间形成杂化双链(heteroduplex) 。
随机引物标记法原理
用一些六核苷酸作为随机引物，将这些 引物和探针DNA片段一起热变性，退火后， 引物与单链DNA互补结合，再在DNA聚合酶的 作用下，按碱基互补配对原则不断在其3`OH端添加标记的单核苷酸修补缺口，合成新 的标记的探针片段。
末端标记法原理
（1）一种是在5`末端加成标记法： 先用碱性磷酸酶（AP）去掉dsDNA 5`-磷 酸，再用T4多核苷酸激酶催化标记的ATP 的γ-磷酸转移加到DNA片段5`-OH上。
在适当条件下，变性DNA的两条互补链 可恢复天然的双螺旋构象，这一现象称为复性。
热变性的DNA经缓慢冷却后即可复性， 这一过程称为退火(annealing) 。
复性条件：Tm－50C 4度以下几乎不复性
核酸分子杂交的应用
研究DNA分子中某一种基因的位置 鉴定两种核酸分子间的序列相似性 检测某些专一序列在待检样品中存在与否 是基因芯片技术的基础