细胞器分离
06实验六--细胞器的分离与观察nj
四、实验方法与步骤
1.细胞核的分离 （1）组织匀浆:将饥饿24h的大白鼠处死,立即剪开腹部, 迅速取出肝组织浸入预冷的生理盐水,洗去血污,用滤 纸吸干。称取0.5g肝组织,在小烧杯中剪碎,用预冷的 0.25mol/L蔗糖溶液洗涤数次。将烧杯中的悬浮肝组织 倒入匀浆管中进行匀浆,匀浆过程要在冰浴中进行。匀 浆完毕,移入1.5ml离心管中。
(3)分析：分级分离得到的组分，可用细胞化学和 生化方法进行形态和功能鉴定。
Unna染色法（甲基绿-派洛宁染色）
细胞核分析：甲基绿-派洛宁对DNA和RNA有选择性 的染色效果。核酸是酸性的，它们对于碱性染料甲 基绿和派洛宁的亲和力不同，而使这两种染料对两 类核酸具有了选择性。DNA被甲基绿染成绿色，RNA 被派洛宁染成红色，这样就能使细胞中两种核酸分 布显示出来。
（3）纯化：将沉淀用5倍体积0.34mol/L蔗糖溶 液-0.5mmol/Mg（Ac)2溶液混悬，用长针头注射 器再混悬液下轻轻加入4倍体积0.88mol/L蔗糖溶 液-0.5mmol/Mg（Ac)2溶液。尽量使两种溶液明 显分层。以1500g(4752rpm)离心15～20min。弃 上清液，沉淀即为经过纯化的细胞核，用PBS溶 液悬浮，4˚C保存。
核DNA呈蓝绿色，核仁和混杂的细胞质RNA呈红色。
六、实验报告
1. 线粒体提取分离过程中，为什么要在0～4℃进 行？
2. 要获得高活性的线粒体，在线粒体提取、分离 和活性鉴定的过程中需注意哪些问题？根据你的实 际体会，写出操作注意事项及改进方法。
3. 分离介质 0.34mol/L及 0.88mol/L缓冲蔗糖溶 液哪一种在下层? 有什么作用?
实验六细胞器的分离与观察一细胞核的分离与观察二线粒体的分离与观察一实验目的了解细胞器的分离原理掌握差速离心和密度梯度离心技术二实验原理细胞器是细胞中维持细胞复杂生命活动的功能性器官为了研究各种细胞器的功能首先就要将这些细胞器从细胞中分离出来
细胞器分离
差速离心法逐级分离出各个细胞器
低速离心
中速离心
高速离心
超速离心
大颗粒 中颗粒 小颗粒
不同大小的生物颗粒可以利用不同的离心机分离：普 通离心机（8000r/min）可分离直径大于1µm的生物颗 粒；高速离心机（8000-25000r/min）可分离直径为 0.1-10µm的生物颗粒；超速离心机（25000-80000 r/min）可分离直径为3.2-100nm的生物颗粒和生物大 分子。为了限制和保持细胞亚组分内酶的生物活性， 有的离心机还装有低温控制装置（0-4℃）。
离心场的离心力常用重力加速度g（9.8 m/s2）的倍 数来表示，而实际操作时人们习惯用r/min（离心机转
子每分钟旋转的圆周数）来掌握。两者关系如下：
离心力g=1.11×10-5n2r
注：r为离心机中轴到离心机远端的距离，n为离心机 每分钟的转速（r/min）
『实验内容和方法』
1、低速分离细胞核
（1） 将小鼠杀死，取出肝脏，剪成数小块，用预冷的生理 盐水反复洗涤除去血污，用滤纸吸干表面的水分。
（2）称取肝组织1g，取8ml预冷的匀浆介质，先加入少量于 小烧杯中，尽量剪碎肝组织，再将剩余的预冷匀浆介质加 入其中。
（3）匀浆，用3-4层纱布（先用少量匀浆介质润湿）过滤匀 浆介质至离心管中(可先过滤至皿中)，离心管内匀浆液为 6-8ml。
（4）普通离心机里以2500r/min的速度离心15分钟，缓缓吸 取上清液，移入eppendorf管中，放在有冰块的器皿中，等 分离线粒体时用（直接进入第二大步）。同时制一张上清 液涂片A，做好记号，自然干燥。
（5）用8ml离心介质悬浮沉淀物，用吸管混匀，以2500r/min 的速度离心15分钟，吸弃上清液，沉淀物加入0.5ml离心介 质，用吸管充分吹打成悬液，制备1张涂片B，做好标记， 自然干燥。
分离细胞器的方法
分离细胞器的方法细胞器是细胞内的重要结构，它们在细胞的生存和功能执行中起着至关重要的作用。
分离细胞器是细胞生物学和生物化学研究中的重要操作，可以帮助科研人员更好地了解细胞器的结构和功能。
下面将介绍几种常用的分离细胞器的方法。
一、差速离心法。
差速离心法是一种常用的分离细胞器的方法，通过利用细胞器的不同密度来进行分离。
首先，需要将细胞悬液置于离心管中，然后进行低速离心，使细胞器沉淀到离心管底部。
接下来，将上清液转移到另一个离心管中，进行高速离心，这样可以将不同密度的细胞器分离出来。
通过这种方法，可以获得相对纯净的细胞器样品。
二、梯度离心法。
梯度离心法是利用密度梯度离心离心细胞器的方法。
首先，需要制备密度梯度离心液，然后将细胞悬液均匀地加在离心管上，进行超速离心。
在离心过程中，不同密度的细胞器会在密度梯度中分层沉淀，从而实现分离。
这种方法可以得到高纯度的细胞器。
三、超声破碎法。
超声破碎法是一种利用超声波对细胞进行破碎，分离细胞器的方法。
首先，将细胞悬液置于超声破碎仪中，经过超声波的作用，细胞膜会破裂，释放出细胞器。
然后，通过差速离心或梯度离心的方法，可以将细胞器分离出来。
这种方法操作简单，适用于一些对纯度要求不高的实验。
四、亲和层析法。
亲和层析法是利用生物分子之间的特异性相互作用来分离细胞器的方法。
通过将含有特定亲和基质的层析柱与混合细胞器悬液一起进行层析，利用细胞器与亲和基质之间的特异性结合来实现细胞器的分离。
这种方法可以得到高纯度的细胞器样品，适用于对细胞器纯度要求较高的实验。
五、离心上清法。
离心上清法是一种简单快捷的分离细胞器的方法。
首先，将细胞悬液进行差速离心，将上清液收集起来。
然后，通过连续的离心步骤，可以逐渐将不同密度的细胞器分离出来。
这种方法操作简单，适用于一些对纯度要求不高的实验。
总结。
以上介绍了几种常用的分离细胞器的方法，每种方法都有其特点和适用范围。
在实际操作中，可以根据实验的需要选择合适的方法进行细胞器的分离，以获得满意的实验结果。
细胞器的分离实验原理及步骤
实验二十二细胞器的分离一．实验目的：以大鼠肝为例，介绍用差速离心法分离细胞器的一般操作程序二．实验原理：（略）三．试剂和器材（一）试剂：１.生理盐水2 . 0.25mol/L 蔗糖-0.01mol/L Tris-盐酸缓冲液（pH7.4）。
配法：0.1mol/L Tris 10ml 0.1mol/L盐酸 8.4ml 加双蒸水到100ml。
再向上述缓冲溶液中加蔗糖，使浓度为0.25mol/L。
蔗糖为密度梯度离心用D（+）蔗糖。
3. 0.34mol/L 蔗糖-0.01mol/L Tris-盐酸缓冲液（pH7.4）。
4. 0.34mol/L 蔗糖-0.5mmol/L Mg（AC）2溶液，用1mol/L NaOH调pH到7.4。
5. 0.88mol/L 蔗糖-0.5mmol/L Mg（AC）2溶液， pH7.4。
6. RSB溶液：0.01mol/L Tris-盐酸缓冲液（pH7.2）,0.01mol/L NaCl，1.5mmol/L MgCl27. 比重d20=1.18的蔗糖溶液（51.5g/L）。
比重d20=1.16的蔗糖溶液（51.0g/L）。
8. 1%詹纳斯绿（Janus green B）染液，用生理盐水配制9. 甲基绿-派洛宁染液。
配法：甲液：2%甲基绿水溶液 14ml 5%派洛宁水溶液 4ml 蒸馏水 16ml 乙液：0.2mol/L 醋酸缓冲液（pH4.8）16ml将甲液和乙液混合均匀，此染液不宜久置。
10. 卡诺固定液无水乙醇 6ml 冰醋酸 1ml 氯仿 3ml11. 丙酮。
实验六细胞器的分离与观察课件
（3）纯化：将沉淀用5倍体积0.34mol/L蔗糖 溶液-0.5mmol/Mg（Ac)2溶液混悬，用长针头 注射器再混悬液下轻轻加入4倍体积 0.88mol/L蔗糖溶液-0.5mmol/Mg（Ac)2溶液。 尽量使两种溶液明显分层。以 1500g(4752rpm)离心15～20min。弃上清液， 沉淀即为经过纯化的细胞核，用PBS溶液悬浮 ，4˚C保存。
（2）离心：低温离心机（4℃）中进行。
每次离心前一定要在天平（托盘天平）上将 两离心管配平。第一次以600g(3005rpm)离心 10min。将其上清夜移入Eppendorf管中，盖 好盖子置于冰浴中，留待后面使用（分离线 粒体）。沉淀使用1ml预冷的0.25mol/L蔗糖 溶液离心洗涤2次，每次1000g(3880rpm)离心 10min。
四、实验方法与步骤
• 1.细胞核的分离 （1）组织匀浆:将饥饿24h的大白鼠处死,立即剪开 腹部,迅速取出肝组织浸入预冷的生理盐水,洗去血 污,用滤纸吸干。称取0.5g肝组织,在小烧杯中剪碎, 用预冷的0.25mol/L蔗糖溶液洗涤数次。将烧杯中的 悬浮肝组织倒入匀浆管中进行匀浆,匀浆过程要在冰 浴中进行。匀浆完毕,移入1.5ml离心管中。
活体染料之所以能固定、堆积在细胞内某些特 殊的部分，主要是染料的“电化学”特性起重 要作用。碱性染料的胶粒表面带阳离子，酸性 染料的胶粒表现带有阴离子，而被染的部分本 身也是具有阴离子或阳离子，这样线粒体分析：詹纳斯绿（Janus green B） 是对线粒体专一的活细胞染料，毒性很小，属 于碱性染料，解离后带正电，由电性吸引堆积 在线粒体膜上。由于线粒体内具有细胞色素氧 化酶系，能使詹纳斯绿保持在氧化状态（淡蓝 绿色）。中性红为弱碱性染料，对液泡系(即 高尔基体)的染色有专一性，将活细胞中的液 泡系染红色。
细胞器的分离、纯化
1．取去叶脉的新鲜菠菜5g于研钵中，加入 0.35mol/l NaCl 15ml研磨。注意开始研磨时也是 先加入少许介质，磨碎后再加入剩余的。 2．绿色的匀浆液用尼龙网(200目)过滤．滤液分 别转入两支干净的离心管中，以1000rpm离心4分 钟．除去沉淀。 3．上清液在高速低温离心机上以3000rpm离心 5分钟，所得沉淀即为叶绿体。 4．用0.35mol/lNaCl液(视沉淀多少)稀释，置冰 箱中保存备用，在干净的载玻片上滴一滴叶绿体悬 液，加盖玻片(需特别干净．线粒体离心匀浆介质： 0.25 M蔗糖。0.067 M PH7.2PBS， 0.05M EDTA，0.75mg／ml牛血清白蛋白。 2．l％Janus green B的O．25M蔗糖溶液。 3．0.05M Tris—HCl液体 PH 8.0 0.02M Tris 55ml 0.1N HCl 55ml 蒸馏水200ml 4．0.35mol/lNaCl
学习细胞器的分离及纯化的 一般原理和方法。
细胞分级分离法是一种通过离心从而分离细胞内不 同结构成份的细胞器(包括核、叶绿体、线粒体、微 体等)以研究其形态结构，化学组成成份和生理活性 的方法。 这个方法包括匀浆化，分级分离，分析三个步骤。 通过匀浆化得到细胞匀浆液；把匀浆液放在一定的 液体环境下，在离心机中进行离心分离处理。因为 离心力的作用，可以把细胞内比重和大小不同的各 种结构分开。
细胞器的沉降速度取决于辐射向外的离心场，我们 通常用相对离心场表示：
RCF=1．11×10-5· n2r
其中RCF为相对离心场(单位为g)；n为转数(单位 为转数／分)；r为离心半径(单位是cm)
(一)材料：新鲜菠菜 (二)器械：显微镜、高速低温离心机、 普通离心机、离心管、200目的尼龙 网、漏斗、烧杯、组织研磨器等。
细胞器的分离技术-----差速离心法
细胞器的分离技术-----差速离心法高中生物教学中涉及两种重要生物技术：差速离心和密度梯度离心。
高中生物必修一《分子与细胞》分离各种细胞器的方法介绍的是差速离心法。
一、实验原理1.细胞器是细胞中维持细胞复杂生命活动的功能性器官，为了研究各种细胞器的功能，首先就要将这些细胞器从细胞中分离出来。
利用各种物理方法（研磨、超声波振荡、低渗等将组织制成匀浆，细胞中的个中亚组分即从细胞中释放出来。
2.细胞内不同结构的细胞器大小密度存在差异，因此不同细胞器在介质中的沉降系数各不相同。
根据这一原理，常用不同转速的离心法来分离不同的细胞器。
分级分离的方法有差速离心和密度梯度离心两种。
3.分离细胞器最常用的方法是将组织制成匀浆，在均匀的悬浮介质中用差速离心法进行分离，其过程包括组织细胞匀浆、分级分离和分析三步，这种方法已成为研究亚细胞成分的化学组成、理化特性及其功能的主要手段。
二、实验步骤(1)匀浆(Homogenization)低温条件下，将组织放在匀浆器中，加入等渗匀浆介质(即0.25mol／L蔗糖)进行破碎细胞使之成为各种细胞器及其包含物的匀浆。
(2)分级分离(Fractionation)由低速到高速离心逐渐沉降。
先用低速使较大的颗粒沉淀，再用较高的转速，将浮在上清液中的颗粒沉淀下来，从而使各种细胞结构，如细胞核、线粒体等得以分离。
由于样品中各种大小和密度不同的颗粒在离心开始时均匀分布在整个离心管中，所以每级离心得到的第一次沉淀必然不是纯的最重的颗粒，须经反复悬浮和离心加以纯化.（一）差速离心（differential centrifugation）在密度均一的介质中由低速到高速逐级离心，用于分离不同大小的细胞和细胞器。
差速离心法是指有低速到高速逐级沉淀分离，使较大的颗粒先在较低速中沉淀，再用较高的转速将原先悬浮于上清夜中的较小颗粒分离沉淀下来，从而使各种亚细胞组分得以分离。
但由于样品中各种大小和密度不同的颗粒在离心十是均匀分布于整个离心介质中的，故每级分离得到的第一次沉淀必然不是纯的最重的颗粒，需经反复悬浮和离心加以纯化。
实验 细胞器的分离
• ①、②、③片，自然干燥后，放入Giemsa染 液缸中染色 5min，用蒸馏水洗去染液，镜检。 • ④片先滴 1—2 滴健那绿 B 于玻片上，挑少许 沉淀在染液中混匀，染5min，加盖片镜检。
• ⑤片先滴 1—2 滴健那绿 B 于玻片上，滴一滴 上清液在染液中混匀，染 5min，加盖组织； 2.过滤匀浆液的纱布事先用预冷蔗糖液 浸湿； 3.收集液体要避免吸到脂肪层； 4.标记玻片。
三、实验步骤:
蛙肝 ↓冷生理盐水10ml洗，吸干水分，放在小烧杯中 ↓加入预冷蔗糖液(少于9ml)，剪碎 匀浆
↓纱布过滤至15ml离心管，溶液体积14ml。
滤液→做涂片①
↓2000 rpm离心10 min
沉淀 上清液 →做涂片② ↓加预冷蔗糖液至10ml，吹打均匀 ↓5ml,11000 rpm离心10 min，弃上清液 混合液 沉淀 ↓2000 rpm离心10 min，弃上清液 ↓加2ml预冷蔗糖液，吹打均匀 沉淀 混合液 ↓加1ml蔗糖液，混匀 ↓11000 rpm离心10 min 做涂片③ 沉淀 上清液 ↓ ↓ 取少许于载片, 取1滴于载片 加健那绿B 混匀④ 加健那绿B 混匀⑤
实验报告：
1.绘制1-5号涂片镜下形态图；
2.分析比较不同涂片间结果的差异及原因。
用另一玻片轻触液滴前端
载玻片
约1/4处，滴加液滴
图示：涂片制作过程
实验六 细胞器的分离: 细胞核与线粒体的分级分离
一、实验目的
1. 了解用差速离心的方法分级分离细胞组分 的原理和过程。 2. 熟悉离心机、匀浆器的使用方法。
二、实验原理
差速离心：根据被分离物质的体积差异，逐渐提高离心 速度以分离大小不同的细胞器的方法。体积大的沉降快， 反之，则慢。
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(5) 1／15 mol／L磷酸缓冲液 (pH 6.8)： 1／15 mol／L磷酸二氢钾(KH2PO4) 50 mL 1／15 mol／L磷酸氢二钠(Na2HPO4) 50 mL (6) 卡诺(Cornay)固定液： 无水乙醇 6 mL 冰醋酸 1 mL 氯 仿 3 mL (7) 生理盐水
2．器具： 解剖刀，剪刀，漏斗，玻璃匀浆器，尼 龙织物，刻度离心管，显微镜，冷冻高 速离心机。
鼠肝线粒体的分离
【材料 材料】 材料 鼠肝脏或猪肝脏。 【实验用品 实验用品】 实验用品 1．试剂： (1) 0.25 mol／L蔗糖+0.01 mol／L三羟甲基氨基甲烷 (Tris)一盐酸缓冲液(pH 7.4)： 0.1 mol／L三羟甲基氨基甲烷溶液 10 mL 0.1 mol／L盐酸 8.4 mL 加双蒸水到100 mL，再加蔗糖使浓度为0.25 mol／L。 (2) 0.34 mol／L蔗糖+0.01 mol／L Tris一盐酸缓冲液 (pH7.4)，配法同上。
2．差速离心： 将0.34 mol／L蔗糖溶液4.5mL放入离 心管，然后沿管壁小心地加入4.5mL鼠肝 匀浆覆盖于上层。用冷冻控温的高速离 心按下图顺序进行差速离心。
分离细胞核：
鼠肝匀浆700×g离心10 min 沉淀(细胞核及质膜碎片) 上清液(1)
洗涤(0.25 mol／L预冷蔗糖溶液5 mL洗涤2次， 每次1000×g离心15 min。 沉淀(细胞核及质膜碎片) 清(1)合并 上清液(2)→与上
(3) 1％詹纳斯绿B(Janus green B)染液，称取50 mg詹纳斯绿B液溶于5mL生理盐水中，稍微加 热使之溶解后，过滤，即为1％原液。 (4) 姬姆萨染液(Giemsa)： 称取Giemsa粉0.5 g、 甘油33 mL、纯甲醇33 mL。先在Giemsa粉中 加少量甘油，然后在研钵内研磨至无颗粒状， 再将剩余甘油倒入混匀，56℃左右保温2 h， 使其充分溶解，最后加甲醇混匀，成为Giemsa 原液，保存于棕色瓶。使用时吸出少量用1／ 15mol／L磷酸缓冲液作10~20倍稀释。
将动植物组织制成匀浆，在适当的悬浮介质中 用差速离心法可以分离细胞线粒体。在一定的 离心场中(选用离心机的一定转速)，球心颗粒 的沉降速度取决于它的密度、半径和悬浮介质 的黏度。在一均匀悬浮介质中离心一定时间， 组织匀浆中的各种细胞器及其他内含物由于沉 降速度不同将停留在高低不同的位置。依次增 加离心力和离心时间，就能够使这些颗粒按其 大小、轻重分批沉降在离心管底部，从而分批 收集。细胞器沉降先后顺序是细胞核、线粒体、 溶酶体和其他微体、核糖体和大分子。
（2）保存液：0.3mol/L甘露醇(pH7.4) （3）20％次氯酸钠(NaClO)溶液。 （4）1％詹纳斯绿B染液，用生理盐水配 制。 2．器材：温箱、冰箱、纱布、瓷研钵、冷 冻控温高速离心机。
【实验步骤 实验步骤】 实验步骤
1．玉米种子用20％次氯酸钠溶液浸泡10min消毒，清水 冲洗30min，再浸泡清水15h。将种子平铺在放有湿纱 布的盘内，保持湿度，置温箱28℃于暗处培育2~3d。 待芽长到1~2cm长时剪下约15g，放0~4℃1h。 2．加3倍体积分离介质，在瓷研钵内快速研磨成匀浆。 3．用多层纱布过滤，滤液经700×g离心10min。除去核 和杂质沉淀。 4．取上清液10000×g离心10min，沉淀为线粒体。再 同上离心洗涤一次。 5．沉淀为线粒体，可存于0.3mol/L甘露醇中。注意以上 匀浆化及离心均控制在0~4℃进行。 6．线粒体的观察：取线粒体沉淀涂在清洁的载玻片上， 不待干立即滴加1％詹纳斯绿B染色20min，放上盖玻 片，用显微镜观察，线粒体是蓝绿色圆形颗粒。
分离线粒体：
混合上清液10000×g离心10 min 沉淀(线粒体) 上清液(弃去)
洗涤 加预冷的0.25 mol／L蔗糖溶液10 mL， 10000×g离心10 min 沉淀(纯化的线粒体) 上清液(弃去)
3．活性鉴定：
(1) 细胞核：取核沉淀1滴涂于载玻片，加入 Carnoy固定液15 min，晾干。Giemsa染液染 10 min，蒸馏水漂洗数秒，用滤纸吸干水、用 显微镜(40×)检查，细胞核呈紫红色，混杂的 胞质为浅蓝色碎片。 (2) 线粒体： 取线粒体沉淀滴在载玻片上，勿太 密。滴加1％詹钠斯绿溶液染液，10 min后用 光学显微镜观察，线粒体蓝绿色，呈小棒状或 哑铃状。
【实验步骤 实验步骤】 实验步骤
1．选取新鲜的菠菜嫩叶，洗擦干后去除叶梗及 粗脉，称3g于0.35 mol／L氯化钠溶液45mL中， 置入组织捣碎机或研钵中。 2．利用组织捣碎机低速(5000 r／min)匀浆3~5 min，或研磨成匀浆。 3．用6层纱布过滤，滤液盛于烧杯中。 4．取滤液4 mL在1000 r／min下离心2 min，弃 去沉淀。 5．将上清液在3000 r／min下离心5 min．弃去 上清液，沉淀即为叶绿体(混有部分细胞核)。
詹纳斯绿B是一种活体染料，能对动、植物的 细胞或组织在活体状态下进行无毒害的染色。 由于染料(碱性染料)的胶粒表面带有阳离子， 酸性染料的胶粒表面带阴离子，而被染部分本 身具有阴离子或阳离子，这样，它们彼此之间 发生吸引作用，染料就被堆集下来。染色法可 以显示出活细胞内的某种天然结构存在的真实 性，而不影响细胞的生命活动和产生任何物理、 化学变化以至引起细胞的死亡。
【注意事项 注意事项】 注意事项 实验全过程要求在0℃~4℃进行，如果使 用非冷冻控温的离心机，一般只宜分离 细胞核和线粒体，同时注意使样品保持 冷冻；尽可能充分破碎组织、缩短匀浆 时间。整个分离过程不宜过长。 【实验报告 实验报告】 实验报告 绘制线粒体示意图。
II 叶绿体的分离与荧光观察
【目的 目的】 目的 了解叶绿体分离的一般原理和方法，并熟悉应用荧 光显微镜方法观察叶绿体荧光现象。 【原理 原理】 原理 叶绿体是植物细胞中较大的一种细胞器，能发生特 有的能量转换。利用低速离心机可以分离叶绿体，其 分离在等渗溶液(0．35 mol／L氯化钠或0．4 mol／L 蔗糖溶液)中进行，目的是为了防止渗透压的改变引起 叶绿体的损伤。将匀浆液在1000 r／min离心，去除其 中的组织残渣和一些未被破碎的完整细胞，然后， 3000 r／min离心，可获得沉淀的叶绿体(混有部分细 胞核)。在室温下进行分离要迅速。
玉米线粒体的分离
从植物细胞分离线粒体，除了作线粒体功能测 定外，在植物细胞遗传工程中，常用于分离核 外基因—线粒体DNA等目的。 分离线粒体的方法仍采用均匀介质中的差速离 心。介质中0.25mol/L蔗糖也可以用0.3mol/L甘 露醇代替。EDTA整合二价阳离子，Ca2＋除去 后细胞间粘着解体，促使组织分散成单个细胞。 牛血清白蛋白(BSA)能包在细胞外面，并作为 竞争性底物削弱蛋白酶的作用。
【实验报告 实验报告】 实验报告
绘制普通光学显微镜下观察的叶绿体形 态示意图，记录荧光显微镜观察的现象， 分析结果。
【材料 材料】 材料 菠莱叶片。 【实验用品 实验用品】 实验用品 1．试剂：蒸馏水，0.35 mol／L氯化钠溶液， 0.01％吖啶橙。 2．器材：普通离心机，组织捣碎机，天平，荧 光显微镜，显微镜，载玻片，盖玻片，镊子， 接种针，目镜测微尺，物镜测微尺，恒温箱， 培养皿，滤纸，试管，试管架，移液管，滴管， 烧杯，无荧光载片，盖玻片，离心管。
某些物质在一定短波长的光(如紫外光)的照射 下吸收光能进入激发态，从激发态回到基态时， 就能在极短的时间内放射出比照射光波长更长 ( ) 的光(如可见光)，这种光就称为荧光。若停止 供能荧光现象立即停止。有些生物体内的物质 受激发光照射后，可直接发出荧光(称为自发 荧光)，如叶绿素的火红色荧光。有的生物材 料本身不发荧光，但它吸收荧光染料后同样也 能发出荧光(称为间接荧光)，如叶绿体吸附吖 啶橙后可发橘红色荧光。本实验利用荧光显微 镜对发荧光的叶绿体进行观察。
【实验步骤 实验步骤】 实验步骤 1．制备肝细胞匀浆：实验前将鼠空腹12小 时，击头处死，剖腹取肝，迅速用生理 盐水洗净血水，用滤纸吸干水，称取肝 组织2 g，剪碎；用预冷的0.25 mol／L蔗 糖溶液洗涤数次。然后按每克肝加4.5 mL预冷的0.25 mol／L蔗糖溶液的量，分 数次添加蔗糖溶液，在0~4℃冰浴中用玻 璃匀浆器将肝制成匀浆，用双层纱布过 滤。
悬浮介质通常采用缓冲的蔗糖溶液，它 较接近细胞质的分散相，在一定程度上 能保持细胞器的结构和酶的活性；pH7.2 的条件下；亚细胞组分不容易重新聚集 成团，有利于分离。整个操作过程样品 要保持在0℃~4℃，避免酶失活。
细胞器标记酶的测定是评价细胞器内膜 组分和分离纯度的主要依据，如线粒体 内膜上分布有细胞色素氧化酶，该酶使 詹纳斯绿B染料保持在氧化状态呈现蓝绿 色从而使线粒体显色，而胞质中的染料 被还原成无色。
【材料 材料】 材料 玉米黄化幼苗(水稻、高粱等幼苗均可)。 【实验用品 实验用品】 实验用品 1．试剂： （1）分离介质：0.25mol/L蔗糖，50mmol/L的Tris-盐酸 缓冲液(pH7.4)，3mmol/LEDTA，0.75mg/mL牛血清白 蛋白(BSA)。 50mmol/L的Tris-Hcl缓冲液(pH7.4)配法： 50mL0.1mol/L三羟甲基氨基甲烷(Tris)溶液与42mL 0.1mol/L盐酸混匀后，加水稀释至100mL。
实验4 细胞器分离、 实验 细胞器分离、制备与观察
I 线粒体制备与活性鉴定 【目的 目的】 目的 1．掌握分离制备动物和植物细胞线粒体的方法。 2．对分离得到的线粒体进行活性鉴定。 【原理 原理】 原理 线粒体（mitochondria）是真核细胞特有的， 司能量转换的重要细胞器。细胞中的能源物 质——脂肪、糖、部分氨基酸在此进行最终的 氧化，并通过藕联磷酸化生成ATP，供给细胞 生理活动之需。