细胞器的分离-细胞器的分离
细胞器分离
(5) 1／15 mol／L磷酸缓冲液 (pH 6.8)： 1／15 mol／L磷酸二氢钾(KH2PO4) 50 mL 1／15 mol／L磷酸氢二钠(Na2HPO4) 50 mL (6) 卡诺(Cornay)固定液： 无水乙醇 6 mL 冰醋酸 1 mL 氯 仿 3 mL (7) 生理盐水
2．器具： 解剖刀，剪刀，漏斗，玻璃匀浆器，尼 龙织物，刻度离心管，显微镜，冷冻高 速离心机。
鼠肝线粒体的分离
【材料 材料】 材料 鼠肝脏或猪肝脏。 【实验用品 实验用品】 实验用品 1．试剂： (1) 0.25 mol／L蔗糖+0.01 mol／L三羟甲基氨基甲烷 (Tris)一盐酸缓冲液(pH 7.4)： 0.1 mol／L三羟甲基氨基甲烷溶液 10 mL 0.1 mol／L盐酸 8.4 mL 加双蒸水到100 mL，再加蔗糖使浓度为0.25 mol／L。 (2) 0.34 mol／L蔗糖+0.01 mol／L Tris一盐酸缓冲液 (pH7.4)，配法同上。
2．差速离心： 将0.34 mol／L蔗糖溶液4.5mL放入离 心管，然后沿管壁小心地加入4.5mL鼠肝 匀浆覆盖于上层。用冷冻控温的高速离 心按下图顺序进行差速离心。
分离细胞核：
鼠肝匀浆700×g离心10 min 沉淀(细胞核及质膜碎片) 上清液(1)
洗涤(0.25 mol／L预冷蔗糖溶液5 mL洗涤2次， 每次1000×g离心15 min。 沉淀(细胞核及质膜碎片) 清(1)合并 上清液(2)→与上
分离各种细胞器的方法是
分离各种细胞器的方法是
有多种方法可以分离和纯化细胞器，其中一些常用的方法包括：
1. 差速离心法：通过不同细胞器的离心沉淀速度差异，将细胞破碎后的组织液经过一系列离心步骤，最终达到分离不同细胞器的目的。
2. 密度梯度离心法：将细胞破碎后的组织液通过离心在稀溶液和浓溶液的梯度之间分层，不同密度的细胞器会沉降到不同的位置，从而实现分离。
3. 断续梯度离心法：通过逐渐增加或减少离心机转速来做到细胞器的分离。
在不同速度下，不同细胞器会在不同离心机转速时分离出来。
4. 亲和层析法：利用特定化合物与细胞器的结构或功能特异性结合，通过将混合细胞器溶液通入预先固定某种化合物的树脂，然后洗脱其他细胞器，最终纯化目标细胞器。
5. 膜分离法：利用不同细胞器的膜特性，通过破碎和离心等步骤将膜分离出来，并进行纯化。
6. 免疫沉淀法：利用特异性抗体与特定抗原结合，使用磁珠或纳米粒子等辅助载体将目标细胞器选择性地沉淀下来。
7. 光学分选法：利用显微镜观察细胞器的形态和荧光标记，通过脉冲激光和光散射等方法，将不同细胞器分离出来。
这些方法可以根据需要的分离纯化细胞器的目的和细胞类型进行选择和结合使用。
高中生物细胞器的分离教案
高中生物细胞器的分离教案
课时：1课时
教学目标：
1. 了解细胞器的结构和功能；
2. 掌握生物学实验中的细胞器分离方法；
3. 提高学生的实验操作能力和综合分析能力。
教学重点和难点：
重点：细胞器的结构和功能，细胞器分离实验方法。
难点：细胞器的分离过程中的操作技巧和细胞器的鉴定。
教学准备：
1. 实验用具：显微镜、离心机、细胞破碎器、离心管、生理盐水、甘油等；
2. 实验材料：新鲜的细胞组织。
教学过程：
一、细胞器的介绍
1. 介绍细胞器的种类及其功能。
2. 展示细胞器的结构，让学生对细胞器有一个基本的了解。
二、细胞器分离实验
1. 实验步骤：
(1) 取新鲜的细胞组织放入细胞破碎器中；
(2) 加入生理盐水，用离心机进行离心，分离出细胞器；
(3) 将分离出的细胞器放入离心管中，用甘油处理；
(4) 观察分离出的细胞器。
2. 学生操作：
(1) 学生进行实验操作，观察细胞器的分离过程；
(2) 学生用显微镜观察分离出的细胞器，进行细胞器的鉴定。
三、讨论与总结
1. 讨论实验中的操作技巧和结果；
2. 总结细胞器分离实验的要点和注意事项。
四、作业
完成实验报告，包括实验目的、原理、步骤、结果及分析。
教学反思：
通过本节课的教学，学生对细胞器的结构和功能有了更深入的了解，同时也提高了实验操作能力和综合分析能力。
希望通过这样的教学方式，能够激发学生对生物学的兴趣，培养他们的实验技能和解决问题的能力。
06实验六--细胞器的分离与观察nj
（3）纯化：将沉淀用5倍体积0.34mol/L蔗糖溶 液-0.5mmol/Mg（Ac)2溶液混悬，用长针头注射 器再混悬液下轻轻加入4倍体积0.88mol/L蔗糖溶 液-0.5mmol/Mg（Ac)2溶液。尽量使两种溶液明 显分层。以1500g(4752rpm)离心15～20min。弃 上清液，沉淀即为经过纯化的细胞核，用PBS溶 液悬浮，4˚C保存。
分离细胞器最常用的方法是将组织制成匀浆， 在均匀的悬浮介质中用差速离心法进行分离， 其过程包括组织细胞匀浆、分级分离和分析三 步，这种方法已成为研究亚细胞成分的化学组 成、理化特性及其功能的主要手段。
(1)细胞匀浆(Homogenization)：低温条件下， 将组织放在匀浆器中，加入等渗匀浆介质(即 0.25mol／L蔗糖)进行破碎细胞使之成为各种细 胞器及其包含物的匀浆。
洋葱内表皮细胞的线粒体分布
植物根尖液泡的中性红染色
三、材料和试剂
材料：小鼠的肝脏
器材：高速冷冻离心机、天平、显微镜、Eppendorf 管、冰块、冰盒、载玻片、盖玻片、玻璃匀浆器
试剂：生理盐水、0.25mol/L蔗糖溶液、 0.34mol/L蔗糖溶液-0.5mmol/Mg（Ac)2溶液、 0.88mol/L蔗糖溶液-0.5mmol/Mg（Ac)2溶液、 95%乙醇溶液、丙酮、PBS液、 甲基绿-派洛宁染液、中性红-詹纳斯绿染液。
这样不同大小形态密度的颗粒就会以不同的速度向下移动集中到不同的区域可以分别收细胞器分离过程中的悬浮介质常使用水溶性的蔗糖溶液因为它比较接近细胞质的分散相在一定程度上能保持细胞器的结构和功能保持酶的活性避免细胞器的聚集
实验六 细胞器的分离与观察
一、细胞核的分离与观察 二、线粒体的分离与观察
一、实验目的
分离细胞器的方法
• 制备细胞样品 • 进行细胞器分离 • 细胞器纯化 • 细胞器功能分析
细胞器功能研究中的应用
细胞器分离技术为细胞器功能研究提供了便利
• 分离纯化的细胞器可用于功能实验 • 可研究细胞器之间的相互作用和协调
细胞器功能研究的应用领域
• 细胞能量代谢研究 • 蛋白质合成和分泌研究 • 光合作用研究
密度梯度离心法及其原理
密度梯度离心法是通过密度梯度溶液将细胞器分离的方法
• 将细胞样品置于密度梯度溶液中 • 通过离心作用使细胞器在密度梯度中移动和分离
密度梯度离心法的原理
• 利用细胞器之间的密度差异进行分离 • 通过调整密度梯度溶液的浓度和离心时间控制细胞器的分离程度
过滤离心法及其原理
过滤离心法是通过过滤膜将细胞器分离的方法
01 差速离心法的优缺点
• 优点：操作简便，成本较低 • 缺点：分离效果受离心速度和离心时间的影响较大
02 密度梯度离心法的优缺点
• 优点：分离效果好，适用于多种细胞器的分离 • 缺点：操作较复杂，成本较高
03 过滤离心法的优缺点
• 优点：分离速度快，适用于少量细胞器的分离 • 缺点：分离效果受过滤膜孔径和离心速度的影响较大
• 分离纯化正常神经元和神经退行性疾病细胞中的线粒体 和内质网 • 研究线粒体和内质网在神经疾病治疗中的作用和潜在靶 点
案例三：细胞器分离技术在代谢疾病研究中的应用
细胞器分离技术在代谢疾病研究中的应用
• 分离纯化肝脏细胞中的线粒体和内质网 • 研究线粒体和内质网在肝脏代谢中的作用
细胞器分离技术在代谢疾病治疗中的应用
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细胞器的分离方法
细胞器的分离方法
细胞器的分离主要分为物理法和化学法两类。
1、物理法：该方法主要是通过改变细胞内外环境的渗透压，使细胞器发生变形或破裂，使细胞器和细胞质分离。
其中普遍采用的有浓缩法、磁选法、离心法和拆离弹簧杆法等。
2、化学法：利用人工合成的表面活性剂，改变细胞表面电荷，使细胞器和细胞质分离。
其中普遍采用的有抑制剂法、蛋白质酶共沉淀法、离子交换法、反相色谱法、聚丙烯酰胺树脂快速层析法等。
总的来说，细胞器的分离依赖于细胞内外环境的变化，从而起到分离细胞器和细胞质的作用。
只要根据不同的细胞类型和要求，正确选择适当的分离方法，就可以获得足够纯度的细胞器样品。
细胞器的分离与观察
4.14沉淀用1ml0.25mol/L蔗糖溶液洗涤离心2次，每次1000g（3900r/min）离心10min；
4.15纯化：将沉淀用500μL0.34mol/L蔗糖溶液悬浮，然后用注射器加入0.88mol/L蔗糖溶液400μL，1500g（4800r/min）离心15—20min；
4.16用PBS溶液悬浮——干燥——95%乙醇固定（5min）——甲基绿-派洛宁染色20-30min——丙酮分离30S——蒸馏水漂洗——吸干镜检；
2.实验原理、试验流程或装置示意图
2.1新鲜取出的小鼠肝脏为组织块，为了得到细胞核和线粒体，首先需要进行匀浆，将细胞从组织块中分离出来，然后再经过进一步匀浆，使细胞膜破碎，细胞解体，各种细胞器被分离出来；同时，0.25mol/L蔗糖溶液，使肝脏细胞在匀浆的过程中处于低渗条件下，使得细胞更容易破碎，匀浆彻底；
4.实验方法步骤及注意事项
4.1实验方法步骤：
4.11称取0.5g小鼠肝脏置于小烧杯中，用解剖剪将其剪碎，然后用生理盐水清洗数次，最后用0.25mol/L的蔗糖溶液清洗一次；
4.12将清洗好的小鼠肝脏置于玻璃匀浆器中加入1.5ml0.25mol/L的蔗糖溶液即可进行细胞匀浆，待其充分匀浆后备用；
4.13取1.5ml匀浆置离心管中，600g（3000r/min）离心10min，上清液留作线粒体分离；
细胞器分离
差速离心法逐级分离出各个细胞器
低速离心
中速离心
高速离心
超速离心
大颗粒 中颗粒 小颗粒
不同大小的生物颗粒可以利用不同的离心机分离：普 通离心机（8000r/min）可分离直径大于1µm的生物颗 粒；高速离心机（8000-25000r/min）可分离直径为 0.1-10µm的生物颗粒；超速离心机（25000-80000 r/min）可分离直径为3.2-100nm的生物颗粒和生物大 分子。为了限制和保持细胞亚组分内酶的生物活性， 有的离心机还装有低温控制装置（0-4℃）。
离心场的离心力常用重力加速度g（9.8 m/s2）的倍 数来表示，而实际操作时人们习惯用r/min（离心机转
子每分钟旋转的圆周数）来掌握。两者关系如下：
离心力g=1.11×10-5n2r
注：r为离心机中轴到离心机远端的距离，n为离心机 每分钟的转速（r/min）
『实验内容和方法』
1、低速分离细胞核
（1） 将小鼠杀死，取出肝脏，剪成数小块，用预冷的生理 盐水反复洗涤除去血污，用滤纸吸干表面的水分。
（2）称取肝组织1g，取8ml预冷的匀浆介质，先加入少量于 小烧杯中，尽量剪碎肝组织，再将剩余的预冷匀浆介质加 入其中。
（3）匀浆，用3-4层纱布（先用少量匀浆介质润湿）过滤匀 浆介质至离心管中(可先过滤至皿中)，离心管内匀浆液为 6-8ml。
（4）普通离心机里以2500r/min的速度离心15分钟，缓缓吸 取上清液，移入eppendorf管中，放在有冰块的器皿中，等 分离线粒体时用（直接进入第二大步）。同时制一张上清 液涂片A，做好记号，自然干燥。
（5）用8ml离心介质悬浮沉淀物，用吸管混匀，以2500r/min 的速度离心15分钟，吸弃上清液，沉淀物加入0.5ml离心介 质，用吸管充分吹打成悬液，制备1张涂片B，做好标记， 自然干燥。
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大颗粒首先沉到管底
较小颗粒沉降
速度区带分离法：
预先装入有一定密度梯度的材料（蔗糖或甘油）， 利用各种颗粒在梯度液中的沉降速度不同，使具有相同 沉降速度的颗粒处于同一梯度层内。
注：待分离颗粒密度比介质密度都要大：
不能离心太久，否则两种颗粒都会沉到底部
[内容与方法]
内容：
大鼠肝细胞细胞核及线粒体的分离
实验二.细胞器的分离
[目的要求]
(1)初步掌握细胞器的分离原理及一般方法。 (2)学习并掌握高速离心机和匀浆器的使用 方法
[实验原理]
细胞器的分离常通过组织细胞匀浆、 分级分离和分析三个步骤完成。 分级分离方法有两种，即：差速离心 法和密度梯度离心法。
差Байду номын сангаас离心：
采取逐渐提高离心速度的方法分离大小不同的细胞器。 被分离的分子越小，需要的离心速度越高。
方法：
(1)取材：
将饥饿24h的大白鼠处死。迅速取出肝组织浸 入预冷的生理盐水，洗去血污，滤纸吸干。在小烧杯 中剪碎，用少量0.25mo1/L蔗糖液洗涤数次。
(2)匀浆:
每组取适量剪碎组织，放入匀浆器中,加入3ml的 0.25mol/L蔗糖溶液进行匀浆。
(3) 过滤：
将组织匀浆完毕，用尼龙网过滤，每组取 2ml的过滤液移入离心管中。
(6)细胞核鉴定：
。
悬浮：在离心后的沉淀中加入几滴PBS，混匀 涂片,空气干燥． 固定：浸入95％的乙醇溶液5min，晾干 染色： 滴加甲基绿-派洛宁染液染色15min
分色:快速放入丙酮中20s，蒸馏水漂洗，擦干水 分
（7）镜检：观察先用低倍镜。再用高倍镜
线粒体的分离
将分离细胞核时收集的上清液以11400离心10 分钟,弃去上清,沉淀用预冷0.25mol/l的蔗糖溶 液悬浮至离心管1.0处,11400g离心10min,去上 清。 鉴定:在干净的载玻片中央,用牙签挑取沉淀物 均匀涂片.滴加2滴中性红-詹母绿染液染色15 min,盖上盖玻片,镜检.被染成亮绿色的即为线 粒体.
(4)离心：
第一次: 1000rpm,8min。
上清保留于试管1.0处
加0.25M蔗糖至4ml，混匀 第二次: 1300rpm,8min。弃上清 重复1次
(5)纯化：
在沉淀中加入0.34mo1/L蔗糖-0.5mmol/L Mg(Ac)2至2ml，混悬。用长针头注射器在混悬液下 轻轻加入2ml 的0.88mo1/L蔗糖-0.5mmol/L Mg(Ac)2 溶液。尽量使两种溶液明显分层。 2000rpm离心 15min。
注意事项
1、染色时间要充分。 2、丙酮分色时要迅速，以防细胞核脱色。