总谷胱甘肽的测定方法
谷胱甘肽的制备及含量测定
• 3.谷胱甘肽的主要来源 • 谷胱甘肽广泛存在于动、植物中，在生物体内有着重 要的作用。在面包酵母、小麦胚芽和动物肝脏中的含量很 高，达100～1000mg/100g,在人体血液中含26～ 34mg/100g，鸡血中含58～73mg/100g，猪血中含10～ 15mg/100g,在西红柿、菠萝、黄瓜中含量也较高(12～ 33mg/100g)，而在甘薯、绿豆芽、洋葱、香菇中含量较 低(0.06～0.7mg/100g)。
谷胱甘肽的制备及含量测定
一、谷胱甘肽的背景知识
• 1.谷胱甘肽是一种什么 样的物质 谷胱甘肽(glutathiose,rglutamyl cysteingl +glycine,GSH)是一种 含γ-酰胺键和巯基的三 肽，由谷氨酸、半胱 氨酸及甘氨酸组成。 谷胱甘肽：还原型谷胱 甘肽、阿拓莫兰、古 拉定
提取工艺
1、取5g干酵母，与15ml蒸馏水充分混合后倒入25ml沸腾的水中。 2、用5ml水洗涤烧杯一并倒入，使混合液保持在95-100℃，沸腾5min。 放置冰水中速冷。 3、在2000rpm速度下离心10min，取上清液，即谷胱甘肽抽提液。 4、谷胱甘肽抽提液，调pH至3.0。 5、上处理好的732阳离子交换吸附柱吸附。 6、用0.25mol/L的NaOH溶液洗脱，洗脱流速10ml/min。收集洗脱液， 洗脱终点用亚硝基氰化钠检测。 7、中和洗脱液至pH6.5。
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谷胱甘肽还可以保护血红蛋白不受过氧化氢、自由基 等氧化从而使它持续正常发挥运输氧的能力。还原型谷胱 甘肽既能直接与过氧化氢等氧化剂结合，生成水和氧化型 谷胱甘肽，也能够将高铁血红蛋白还原为血红蛋白。 • 谷胱甘肽保护酶分子中-SH基，有利于酶活性的发挥， 并且能恢复已被破坏的酶分子中-SH基的活性功能，使酶 重新恢复活性。 • 谷胱甘肽还可以抑制乙醇侵害肝脏所产生的脂肪肝。 • 谷胱甘肽对于放射线、放射性药物所引起的白细胞减 少等症状，有强有力的保护作用。谷胱甘肽能与进入人体 的有毒化合物、重金属离子或致癌物质等相结合，并促进 其排出体外，起到中和解毒作用 。
不同方法提取谷胱甘肽的比较
不同方法提取谷胱甘肽的比较实验一不同方法提取谷胱甘肽的比较一、实验目的1、掌握从干酵母中粗提谷胱甘肽的各种方法。
2、掌握还原型谷胱甘肽定量的方法。
二、实验原理谷胱甘肽是种重要的三肽，以还原型（GSH)和氧化型（GSSG)广泛的存在于动、植物及微生物。
在生物体内起作用的主要是GSH，是细胞内主要的还原性物质，能保护细胞免受氧化性、毒害性化合物和辐射的伤害，还是酶的辅因子。
GSH在临床上是重要的解毒药物。
谷胱甘肽是小分子物质，水中溶解度较大，细胞表面出现裂缝就能分散到溶剂中，故可用一些温和的方法提取。
本实验采用热处理、冰冻处理、酸处理、有机溶剂处理等方法提取酵母细胞中的谷胱甘肽，比较最后的得率，探讨各种提取方法的优点和缺点。
三、实验器材、材料和试剂1、器材冰箱，离心机，水浴锅，电炉，滴定管，烧杯，玻棒，研钵。
2、实验材料活性干酵母，2%偏磷酸，5%碘化钾，0.0001mol/l碘酸钾溶液，淀粉指示剂，乙酸：乙醇（2:1）,36%乙酸溶液。
四、实验步骤1、热水抽提：1g干酵母与5ml水混合，加15ml沸水，置100℃水浴保温10min，立即放入冰水速冷，取10ml离心，取5ml上清滴定，得滴定体积V1。
2、冷冻研磨后有机酸搅拌提取：1g干酵母先在研钵中研细，与10ml水混合，-20℃冷冻成半固体状，研磨5min转入小烧杯，加10ml 36%乙酸搅拌15min，取10ml离心，取5ml上清滴定，得滴定体积V2。
3、酸热处理：1g干酵母加20ml2%偏磷酸，60℃水浴中搅拌抽提15min，置冰水速冷，取10ml离心，取5ml上清滴定，得滴定体积V3。
4、有机混合液处理：1g干酵母加20ml有机混合液（甲酸：乙醇=2：1），室温搅拌抽提15min，置冰水速冷，取10ml离心，取5ml上清滴定，得滴定体积V4。
5、碘量法测定：取5ml待测样品，置于250ml锥形瓶中，加入5ml2%偏磷酸溶液、1ml5%碘化钾溶液和2滴淀粉指示剂，用0.0001mol/L的碘酸钾滴定至溶液由无色变为蓝色为止。
谷胱甘肽含量测定
植物生理学模块实验指导玲主编科学还原型谷胱甘肽含量的测定方法（分光光度计法）【实验目的】了解植物组中中抗坏血酸-谷胱甘肽循环代过程，学习还原型谷胱甘肽含量的测定原理和方法。
【实验原理】谷胱甘肽是有谷氨酸（Glu）、半胱氨酸（Gly）组成的天然三肽，是一种含巯基（—SH）的化合物，广泛存在于动物组织、植物组织、微生物和酵母中。
谷胱甘肽能和5,5’-二硫代-双-（2-硝基苯甲酸）（5,5’-dithiobis-2-nitrobenoic acid，DTNB）反应产生2-硝基-5-巯基苯甲酸和谷胱甘肽二硫化物（GSSG）。
2-硝基-5-巯基苯甲酸为一黄色产物，在波长412nm处具有最大光吸收。
因此，利用分光光度计法可测定样品中谷胱甘肽的含量。
【器材与试剂】1.实验仪器与用具研钵、高速冷冻离心机、微量移液枪、离心管、试管、水浴锅、容量瓶（100ml、200ml、1000ml）、分光光度计2.实验试剂50g/L三氯乙酸（TCA）溶液（含5mmol/L Na2-EDTA）：称取5g三氯乙酸，用蒸馏水溶解稀释至100ml。
再称取186mg Na2-EDTA·2H2O，加入到100ml 50g/L三氯乙酸溶液中溶解。
0.1mol/L磷酸钠溶液缓冲液（pH7.7）：配制方法见附录。
0.1mol/L(pH6.8)磷酸钠缓冲液：配制方法见附录。
4mmol/L二硫代硝基苯甲酸（5,5’-dithiobis-2-nitrobenoic acid，DTNB）溶液：称取15.8mg DTNB，用0.1mol/L、pH6.8磷酸缓冲液溶解，定容至10ml，混匀，4℃保存。
现用现配。
100μmol/L还原型谷胱甘肽标准液：称取3.1mg 还原型谷胱甘肽，加入少量无水乙醇溶解，加蒸馏水定容至100ml。
3.实验材料同抗坏血酸。
【实验步骤】1.标准曲线制作取6支试管，编号，按照表1加入各种试剂，混匀，25℃保温反应10min。
食用菌中谷胱甘肽的测定
食用菌中谷胱甘肽的测定谷胱甘肽是一种重要的抗氧化物质，被广泛应用于食品工业中。
食用菌是一类含有高丰富谷胱甘肽的食材，因此测定食用菌中谷胱甘肽的含量具有重要的意义。
本文将介绍几种常用的测定食用菌中谷胱甘肽的方法。
一、硫巴比妥酸法测定谷胱甘肽含量硫巴比妥酸法是目前测定谷胱甘肽含量最常用的方法之一。
该方法的原理是谷胱甘肽与硫巴比妥酸在碱性条件下反应生成黄色产物，通过测定产物的吸光度可以间接测定谷胱甘肽的含量。
具体操作步骤如下：1. 将食用菌样品粉碎并称取适量，加入酸性溶液中，破坏细胞结构释放出谷胱甘肽。
2. 加入碱性溶液和硫巴比妥酸，使谷胱甘肽与硫巴比妥酸反应生成黄色产物。
3. 使用分光光度计测定产物的吸光度，利用标准曲线计算样品中谷胱甘肽的含量。
二、高效液相色谱法测定谷胱甘肽含量高效液相色谱法是一种常用的分离和定量化合物的方法。
该方法的原理是利用色谱柱对样品中的谷胱甘肽进行分离，通过检测谷胱甘肽的峰面积或峰高来定量谷胱甘肽的含量。
具体操作步骤如下：1. 将食用菌样品制备成适宜的提取液，经过离心等处理步骤，获得待测样品。
2. 使用高效液相色谱仪，将待测样品注入进样器，经过一定的流动相条件下，在色谱柱中进行分离。
3. 通过检测谷胱甘肽的峰面积或峰高，利用标准曲线计算样品中谷胱甘肽的含量。
三、氧化还原法测定谷胱甘肽含量氧化还原法是一种直接测定谷胱甘肽含量的方法。
该方法的原理是利用谷胱甘肽与还原剂在适宜的条件下发生氧化还原反应，通过测定反应前后还原剂的含量变化来确定谷胱甘肽的含量。
具体操作步骤如下：1. 将食用菌样品制备成适宜的提取液，通过离心等处理步骤，获得待测样品。
2. 将待测样品与还原剂在适宜的条件下反应，使谷胱甘肽发生氧化还原反应。
3. 通过测定反应前后还原剂的含量变化，计算谷胱甘肽的含量。
在测定食用菌中谷胱甘肽的含量时，需要注意样品的制备过程，确保提取到的谷胱甘肽是代表样品中真实含量的。
同时，选择合适的测定方法，准确、快速地测定谷胱甘肽含量，有助于评估食用菌的品质和营养价值。
谷胱甘肽(GSH)含量测定
谷胱甘肽（GSH）含量测定一、实验目的1.了解植物组中中抗坏血酸-谷胱甘肽循环代谢过程;2.学习还原型谷胱甘肽含量的测定原理和方法。
二、实验原理谷胱甘肽是有谷氨酸（Glu）、半胱氨酸（Cys）、甘氨酸(Gly)组成的天然三肽，是一种含巯基（—SH）的化合物，广泛存在于动物组织、植物组织、微生物和酵母中。
它作为体内重要的抗氧化剂和自由基清除剂，如与自由基、重金属等结合，从而把机体内有害的毒物转化为无害的物质，排泄出体外。
谷胱甘肽能和2-硝基苯甲酸（DTNB）反应产生2-硝基-5-巯基苯甲酸和谷胱甘肽二硫化物（GSSG），2-硝基-5-巯基苯甲酸为一黄色产物，在波长412nm 处具有最大光吸收。
因此，利用分光光度计法可测定样品中谷胱甘肽的含量。
三、实验材料小麦幼嫩叶片四、实验方法及步骤1.制作标准曲线取7只干净的试管编号，按如下表格加入各试剂，反应20分钟后在412nm 下用分光光度计测其吸光度，制作标准曲线；2.样品测定a、称取小麦叶片0.2g，加入少量5%偏磷酸缓冲液研磨提取，并用5%偏磷酸缓冲液定容至6ml，8000rpm离心10min,取上清液；b、取上述上清液2ml显色，操作同标准曲线。
3.结果计算：GSH含量（ug/Gfw）= (Cx*Vt)/(Fw*Vs)注：Cx---2ml样品中GSH含量（ug），即每管中GSH的含量Vt---样品提取液总体积(ml)；Vs----显色时所取样的体积(ml)；FW---样品鲜重（g）。
五、实验结果1.标准曲线1.样品测定结果六、注意事项1.使用移液管吸取试剂时，视线要垂直于移液管且与液面凹面水平，不能斜视，以免量取试剂不准确。
2.在提取样品时，最好沉淀出去蛋白质，以防止蛋白质中所含巯基及相关酶对测定结果的影响。
3.在研磨叶片时，为方便研磨，刚开始时加入少量的提取液。
实验五植物组织中谷胱甘肽含量的测定
实验五植物组织中⾕胱⽢肽含量的测定⾕胱⽢肽含量的测定⼀、实验⽬的1、了解⾕胱⽢肽在植物抗逆中作⽤。
2、了解⽬前⾕胱⽢肽含量的测定⽅法。
3、掌握⽐⾊法测定植物体⾕胱⽢肽含量的原理与技术。
⼆、实验原理还原性⾕胱⽢肽(GSH)作为⽣物体内最主要的⾮蛋⽩巯基以及含量最丰富的低分⼦多肽，是植物细胞重要的抗氧化剂之⼀，在植物抗逆过程中直接或间接地参与了许多植物的功能活动，是⼀个良好的表⽰氧化胁迫的指标。
⾕胱⽢肽(GSH)是由⾕氨酸、半胱氨酸和⽢氨酸结合⽽成的三肽，半胱氨酸上的巯基为其活性基团。
在巯基化合物的存在下，⽆⾊的DTNB将被转变成黄⾊的5-巯基-2-硝基苯甲酸。
由于5-巯基-2-硝基苯甲酸在412 nm处具有最⼤吸收，⽽且DTNB的吸收光谱并不造成⼲扰，所以可以⽤分光光度计进⾏测定。
即：GSH和TDBN在pH=7时⽣成黄⾊物质，其颜⾊深浅与GSH的浓度成线性关系。
三、实验材料、试剂与仪器1、实验材料：⼩麦叶⽚2、实验试剂：（1）GSH标准溶液〔0.01mg/ml GSH标准溶液（=亦即10µg/ml）〕：称取50mg 分析纯GSH，溶于蒸馏⽔中，并定容于100ml，即为0.5mg/ml 之标准母液，⽤稀释10倍（0.05mg/ml=亦即50µg/ml GSH）注：⽤时再稀释5倍即为10µg/ml；（2）5%偏磷酸；（3）0.2mol/L 磷酸钾缓冲液，pH7.0；（4）TDNB试剂：称取39.6mg⼆硫代双-⼆硝基苯甲酸（TDNB），⽤0.2mol/L磷酸钾缓冲液溶解并定容于100ml；（5）1mol/L NaOH溶液。
3、实验仪器：V-1000D型可见分光光度计；离⼼机；离⼼管；刻度试管；研钵；吸⽔纸适量；移液管等。
四、⽅法与步骤1、标准曲线的制作取7⽀刻度试管，编号，按表加⼊试剂：试剂（ml）试管号1 2 3 4 5 6 7GSH标准溶液（10µg/ml）0 0.1 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0补蒸馏⽔到2ml 2 1.9 1.8 1.6 1.4 1.2 1.0磷酸缓冲液 4 4 4 4 4 4 4DTNB试剂0.4 0.4 0.4 0.4 0.4 0.4 0.4 GSH浓度（µg/2ml即每管含量）0 1 2 4 6 8 10将上述溶液混合均匀，在室温下显⾊5min。
还原型谷胱甘肽(GSH)与氧化型谷胱甘肽(GSSG)的测定
还原型谷胱甘肽(GSH)与氧化型谷胱甘肽(GSSG)的测定关键词：还原型谷胱甘肽GSH氧化型谷胱甘肽GSSG测定2009-04-24 00:00 来源：互联网点击次数：6147GSH和GSSG 参照Anderson等（1992）。
取0.5 g样品，加入3 mL冰冷的6%的偏磷酸（含1 mmol•L-1 EDTA ，pH 2.8），冰浴研磨，匀浆液以20,000 g，4 ℃离心15 min，取上清液来马上测定GSH和GSSG的含量或储存在-20 ℃下等待测定。
总的GSH和GSSG含量测定如下：200 μL提取液加 1.2 mL反应液包含400 μL反应液1（110 mmol•L-1 Na2HPO4•7H20，40 mmol•L-1NaH2PO4•H2O，15 mmol•L-1EDTA，0.3 mmol•L-15,5‘-dithiobis-（2-nitrobenzoic acid）DTNB，0.04% BSA）、320 μL反应液2 （1 mmol•L-1 EDTA，50 mmol•L-1 imidazole 咪唑solution and 0.02% BSA）、400 μL反应液3（5% Na2HPO4，pH 7.5的溶液稀释50倍）、80 μL 9.0 mmol•L-1 NADPH。
测定OD412下的吸收值。
GSSG 含量测定如下：200 μL提取液加入1 mL的2-2乙烯嘧啶（稀释50倍）在25°C下水浴1 h再测定OD412下的吸收值。
GSH的含量可以从总的GSH和GSSG含量中减去GSSG含量获得。
GSH测定方法：取样品0.5 g，加入预冷的5%磺基水杨酸2.5 ml和少许石英砂，充分冰预研磨，转入离心管中，于4℃下20,000×g离心20min，将上清液分装，液氮冷冻后于-20℃保存或直接进行抗氧化剂分析。
取50 μL上清液，用5% 磺基水杨酸定容至100 μL （即加入5% 磺基水杨酸50 μL），加入24 μL 1.84 mol•L-1三乙醇胺triethlene diamine以中和样液，加入50 μL 10% 乙烯吡啶Polyvinyl pyridine （用70% 乙醇配制），25℃水浴1 h，以除去GSH，到时加入706 mL 50 mmol•L-1磷酸缓冲液，pH 7.5，内含2.5 mmol•L-1 EDTA，加入20 μL 10 mmol•L-1 NADPH 和80 μL 12.5 mmol•L-1 DTNB（二硫硝基苯甲酸），混匀，25℃保温10 min，到时加入20μL 50 U•mL-1 GR，总体积为1 mL，立即混匀，读出3 min时的OD值。
谷胱甘肽测定实验报告
一、实验目的了解植物组织中抗坏血酸-谷胱甘肽循环代谢过程，学习还原型谷胱甘肽含量的测定原理和方法。
二、实验原理谷胱甘肽（GSH）是一种具有抗氧化作用的天然三肽，由谷氨酸、半胱氨酸和甘氨酸组成。
在生物体内，谷胱甘肽具有多种生理功能，如保护细胞免受氧化损伤、参与药物和毒素的解毒过程等。
还原型谷胱甘肽含量的测定对于研究生物体内氧化还原平衡、疾病诊断和药物治疗具有重要意义。
本实验采用分光光度计法测定植物组织中还原型谷胱甘肽的含量。
该方法的原理是：在一定的pH条件下，还原型谷胱甘肽与5,5'-二硫双硝基苯甲酸（DTNB）反应，生成黄色的5-硫代2-硝基苯甲酸阴离子，于423nm波长处有最大吸收峰。
通过测定该波长处的吸光度值，可以计算出还原型谷胱甘肽的含量。
三、实验材料与仪器1. 材料：小麦幼嫩叶片、5,5'-二硫双硝基苯甲酸（DTNB）、磷酸盐缓冲液（pH 7.0）、乙二胺四乙酸（EDTA）、无水乙醇等。
2. 仪器：分光光度计、电子天平、离心机、匀浆器、恒温水浴锅、微量加样器等。
四、实验方法与步骤1. 样品制备：取小麦幼嫩叶片，用无水乙醇研磨成匀浆，离心取上清液。
2. 标准曲线绘制：分别取6支干净的试管，按表1加入试剂，反应20分钟后，于423nm波长处测定吸光度值，以DTNB浓度为横坐标，吸光度值为纵坐标绘制标准曲线。
3. 样品测定：取6支干净的试管，按表2加入试剂，反应20分钟后，于423nm波长处测定吸光度值，根据标准曲线计算还原型谷胱甘肽的含量。
五、实验结果与分析1. 标准曲线：根据实验数据绘制标准曲线，得到线性回归方程为y=0.0048x-0.0031，相关系数R²=0.9967。
2. 样品测定：根据标准曲线计算小麦幼嫩叶片中还原型谷胱甘肽的含量为（X±SD）mg/g。
六、讨论1. 实验结果表明，小麦幼嫩叶片中含有一定量的还原型谷胱甘肽，其含量与样品制备方法和实验条件有关。