Caspase在水产动物中的研究进展
Caspase基因的研究进展
Caspase基因的研究进展（1河北大学附属医院血液科071000；2河北大学附属医院医疗保险办公室071000；3河北大学附属医院感染性疾病科071000；4保定市第五医院检验科071051；5保定市第一医院手术室071000）标签：Caspase；基因；细胞凋亡1Caspase的概述Caspase基因自1992年人类第1次纯化Caspase-1并测序其cDNA，目前共发现14个家族成员（Caspase1-14），以无活性的酶原形式存在于细胞质中。
其酶原均由N端前域、大亚基单位、小亚基单位三部分组成。
根据酶原组成的同源性及功能，把Caspase家族分为三大类：①凋亡启动因子（apoptotic initiators）：Caspase-2、Caspase-8、Caspase-9和Caspase-10；②凋亡执行因子（apoptotic executioners）：Caspase-3、Caspase-6、Caspase-7；③炎症介导因子（inflammatory mediators）：Caspase-1、Caspase-4、Caspase-5、Caspase-11。
2Caspase的激活Caspase基因是执行细胞凋亡的主要酶类，主要通过Caspase蛋白的次序激活实现诱导细胞凋亡过程。
其本身没有活性，活化时需将原结构域切除，解离出一大一小两个亚基，分别为P20和P10，两个亚基以（P20/P10）形式组合，成为活化的Caspase基因。
当细胞接受凋亡刺激时，Caspase基因被系列反应激活，进而诱导细胞发生凋亡［2］。
根据起始激活Caspase的不同，凋亡途径分为3种［3］：Cyt-C通路、死亡受体通路、内质网通路。
Cyt-C通路即内源性细胞凋亡途径，当细胞受到凋亡信号刺激，线粒体释放Cyt-C到胞浆，通过与apaf-1（凋亡细胞蛋白酶激活因子，Apoptosis Protease Activating Factor-1）结合，使Caspase-9聚集和活化，激活下游Caspase基因；在dATP存在时，Caspase-9可直接活化Caspase-3，介导细胞凋亡。
硝基苯 水体硝基苯对日本青鳉和稀有鮈鲫的亚急性毒理学效应
硝基苯水体硝基苯对日本青鳉和稀有鮈鲫的亚急性毒理学效应中国科学 B 辑: 化学《中国科学》杂志社2021年第37卷第2期: 197~206SCIENCE IN CHINA PRESS水体硝基苯对日本青鳉和稀有鮈鲫的亚急性毒理学效应周群芳傅建捷孟海珍朱学艳江桂斌*①②②张建斌刘杰民时国庆①①②①②①②①① 环境化学与生态毒理学国家重点实验室, 中国科学院生态环境研究中心, 北京100085;② 北京科技大学应用科学学院化学系, 北京 100083摘要通过硝基苯对日本青鳉Medaka, Oryzias latipes 和稀有鮈鲫Gobiocypris rarus 两种小型实验鱼类的模拟暴露试验发现, 静水体系的硝基苯化合物含量在实验观测期间呈线性下降趋势. Medaka 和稀有鮈鲫可以剂量相关方式累积硝基苯, 回放清水时又可快速排出. 与Medaka 相比, 稀有鮈鲫表现出相对更为灵敏的中毒反应.硝基苯可影响实验鱼肝脏抗氧化防御体系中超氧化物歧化酶SOD与过氧化氢酶CAT 活性. 暴露实验鱼脑乙酰胆碱酯酶AChE活性变化揭示了硝基苯潜在的中枢毒性效应. 组织病理学研究证实硝基苯可对实验鱼靶器官产生组织损伤效应. 关键词硝基苯日本青鳉稀有鮈鲫生物富集消除分子生物标志物组织病理学效应1 引言硝基苯俗称密斑油, 是化学工业中大量使用的化工原料和反应中间体, 广泛用于生产苯胺、农药、鞋油、止痛剂、染料和硝酸纤维素化合物. 由于硝基苯具有强烈的苦杏仁气味, 因而被认为是一种危险性空气污染物. 根据动物实验研究证明硝基苯具有致癌性, 因此它被划分为2B 组致癌物, 即人类可疑致癌物[1]. 在我国, 由于其高毒性效应, 国家环境保护局已将硝基苯定为环境中优先监测污染物之一.然而, 由于生产管理等过程中存在的种种原因引起硝基苯意外泄漏事件屡有发生. 据估计每年释放到环境中的硝基苯约占其产量的0.06%~1.5%[2], 这导致周边环境受到严重污染, 因此研究硝基苯的毒理学效应, 特别是利用水生态毒理学方法可以很好地评价硝基苯污染对区域水生态系统的影响, 对正确反映水环境硝基苯污染持久性及其对周围人体健康可能产生的潜在风险具有重要意义.目前关于硝基苯类化合物对实验生物的毒理学效应研究报道比较多[3~5], 然而针对硝基苯对水生生物如鱼类、软体动物、浮游植物或浮游动物等的毒性报道大部分局限于其致死率的研究上[6~11], 探讨硝基苯在水生物体内的富集与消除. 对生物体正常生化过程的影响、以及其组织损伤效应的研究很有限[12,13], 而且所用暴露体系、实验动物或者终点指标各不相同,因此利用以往毒性研究资料难以正确评价高浓度水体硝基苯污染事件对水生态系统可能产生的影响.本研究通过硝基苯对两种实验鱼类: 日本青鳉Medaka和稀有鮈鲫水体模拟暴露试验, 以考察水中硝基苯的稳定性, 探讨短期暴露下实验鱼对硝基苯富集与消除状况. 研究了硝基苯对超氧化物歧化酶收稿日期: 2021-09-04; 接受日期: 2021-12-31国家自然科学基金批准号: 40503014, 40590392, 中国科学院知识创新项目批准号: KJCX2-SW-H06, KZCX2-YW-402和北京市科技新星计划批准号: 2021A51资助项目* 联系人, E-mail: gbjiang@rcees.ac198中国科学 B 辑化学第37卷SOD、过氧化氢酶CAT、乙酰胆碱酯酶AChE在内的典型分子生物标志物活性影响, 并从细胞、亚细胞结构水平分析了污染物暴露引起的鱼体组织病理学变化, 以此正确评价水体硝基苯污染对鱼类可能产生的亚急性毒理学影响.久性状况.基于急性毒性实验获得的两种鱼类的48 h LC50值, 设置空白对照组, 6.25, 12.5, 25, 50 mg/L, 研究亚急性暴露情况下, 两种小型实验鱼类在96 h内对水体硝基苯化合物的富集状况. 实验过程中, 每隔24 h换水1次, 换水量为暴露体积的一半. 定时采集水样以监测水中硝基苯维持水平. 暴露开始后, 每天观察实验鱼游动、觅食行为等生活状态. 暴露4天后,取样, 鱼体用滤纸干燥后称重, ?20℃冷冻保存, 测定其体内硝基苯浓度以研究实验鱼对水体不同浓度硝基苯的富集状况.为了研究鱼体对水体硝基苯富集随时间的变化以及暴露鱼体回放清水后体内硝基苯的消除情况, 设置50 mg/L暴露组, 取稀有鮈鲫和Medaka 各34条, 暴露24 h, 而后投放到清水中24 h, 每隔一定时间取样. 每次各两条, 分别测体内硝基苯浓度.设置空白对照组, 5, 20, 80 mg/L, 分别于暴露24 h 与48 h采样分析鱼体肝脏抗氧化防御体系典型分子生物标志物如SOD, CAT, 以及脑中枢神经毒性分子生物标志物乙酰胆碱酯酶活性变化, 从而筛选早期反映硝基苯暴露的生物标志物, 并探讨硝基苯对实验鱼短期暴露引起急性中毒反应的内在作用机制.取50 mg/L暴露组在暴露7天后的鱼样, 冷休克后解剖取新鲜肝脏、鳃器官置于戊二醛或福尔马林液中固定, 以进行组织病理学观察.2 实验部分2.1 仪器安捷伦6890气相色谱-5973N 质谱仪Agilent Technologies, DE, USA联用系统用于鱼体内硝基苯的分析.固相微萃取装置购自Supelco Inc Bellefonte, PA, USA, 萃取纤维为聚二甲基硅氧烷polydimethy- lsioxane, PDMS, 100 μm, 用于样品的顶空萃取. TECAN 酶标仪DNA Expert, Austria用于SOD, AChE以及蛋白含量测定. 紫外-可见分光光度计11-3010, 日本,Hitachi用于CAT 测定. 奥林巴斯光学显微镜BX41, Japan. Hitachi扫描电镜S-3000N,日本. Hi-tachi 透射电镜H-7500,日本.2.2 试剂硝基苯分析纯, 北京化工厂, 称取1 g 硝基苯溶于1 L水中, 制成1 g/L标准浓溶液, 工作液由上述溶液依次稀释获得, 所有溶液均为现用现配.SOD 分子生物标志物分析采用南京建成生物工程研究所生产的商品试剂盒.2.5 实验方法水样与鱼体中硝基苯测定方法参考文献[14]. 取10 mL水样于50 mL锥形瓶中, 在磁子搅拌下, 插入固相微萃取装置, 顶空萃取10 min, 萃取结束后, 将萃取纤维插入GC/MS气相色谱进样口进行热解析分析. 仪器进样口温度为250℃, 采用不分流进样. 色谱柱为DB-5 MS柱30 m ×0.25 mm, 0.25 μm. 载气为高纯氦99.999%,北京市华元气体化工有限公司. 采用恒流模式, 柱流速1 mL/min. 程序升温: 70℃, 保持3 min, 以10℃/min的速率升温至150℃, 保持2 min. 质谱离子源温度230℃, 四极杆温度150℃. 溶剂延迟设为3 min. 采用选择离子模式定量检测, 定2.3 实验动物实验动物采用实验室标准无病害环境下流水式养殖的稀有鮈鲫和Medaka. 实验水质参数如下: pH为7.4 ± 0.5; 溶解氧浓度为6 mg/L; 硬度为200 mg CaCO 3/L; 水温控制在25.0 ± 1℃范围内; 白天/黑夜循环时间是12 h/12 h; 暴露密度控制在1 g/L内. 实验采用换水式. 实验用鱼为3月龄成年雌性或雄性鱼,Medaka 体重为0.21 ± 0.03 g, 体长3.02 ± 0.04 cm, 稀有鮈鲫体重为0.28 ± 0.05 g, 体长3.04 ± 0.02 cm.2.4 实验设计设置12.5 mg/L组为静水式暴露, 在整个暴露期量离子为39, 51, 77, 93, 123. 匀浆后的鱼样置于50 mL 密闭锥形瓶中, 以上述方法进行萃取分析. 通过在20 μg/g的加标水平上进行加标回收实验, 发现水样与鱼样中硝基苯的加标回收率分别为85.8%和间不换水, 在暴露期间以及鱼样采集完一定时间内取水样测定其中硝基苯浓度, 以有助于评价自然水体中由于硝基苯污染突发事件发生后其在水体中持第2期周群芳等: 水体硝基苯对日本青鳉和稀有鮈鲫的亚急性毒理学效应 19982.3%, 这表明该分析方法可应用于本研究测定.SOD 酶活性单位定义为每毫升反应液中, 每分钟抑制邻苯二酚自氧化速率达50%的酶蛋白量[15].单位CAT 酶活性定义为25℃下, 100s内使过氧化氢分解1/2时的酶蛋白量.乙酰胆碱酯酶活性单位定义为每分钟酶水解底物ASCH的量, 定量通过在412 nm处检测水解产物与DTNB 反应生成的黄色物质的吸光度值实现[16].组织病理学观察用实验鱼靶器官或组织样品通过固定、脱水后, 进行石蜡包埋, H&E染色, 光学显微镜观察, 或者临界点干燥, 喷金处理, 扫描电镜观察, 或者树脂包埋, 超薄切片, 铅铀染色, 透射电镜观察.图2 各暴露组水体硝基苯浓度变化0.49, 11.22 ± 1.88, 24.95 ± 5.29, 48.90 ± 3.91 mg/L, 各组实际浓度值与各设定值偏差在7.8%~21%范围内, 这说明本研究中的较短时间内通过换水式暴露方式可以维持实验鱼相对稳定的暴露环境, 为了简便起见, 在后续研究中采用了硝基苯暴露的表观浓度来评价其对实验鱼的毒性效应.2.6 统计分析数据组间差异采用单因素方差分析ANOVA, 检验水准为P3 结果与讨论3.1 水体硝基苯浓度监测12.5 mg/L静水式暴露组水中硝基苯浓度监测结果见图1, 显然硝基苯在水体中的浓度呈线性下降R 2>0.99, 5天129.6 h后水体浓度下降为起始浓度的一半, 9天216 h后水中硝基苯的消除率达77.8%, 这一结果与文献报道硝基苯在水中的半衰期结果相吻合[17]. 水体硝基苯化合物大部分可通过挥发作用扩散入空气[18~20],因而其水中浓度可在较短时间内降低.6.25~50 mg/L暴露组水体硝基苯浓度监测结果如图2所示. 由图2可以发现在整个暴露期间水中硝基苯浓度变化不大, 各组浓度平均值分别为6.21±3.2 两种实验鱼对硝基苯急性毒性响应在整个急性毒性测试过程中, 详细观察了高浓度暴露50, 80, 110, 140, 170, 200 mg/L下两种实验鱼的生活行为. 对照组所有实验鱼在整个实验过程中泳动、呼吸、觅食、对外界物理刺激如轻敲缸壁等行为无明显变化. 在急性暴露实验中高浓度组200 mg/L稀有鮈鲫在实验开始0.5 h之内全部失去平衡, 并在1 h以后开始逐渐死亡, 至24 h全部死亡.Medaka 在暴露开始阶段对毒物响应灵敏度显著低于稀有鮈鲫, 暴露开始1 h内大部分鱼沉在缸底, 仅有两条出现身体平衡失调, 出现直立游泳等异常行为, 其它鱼在高浓度暴露后短期内的主要中毒症状表现为对外界物理刺激反应迟钝. 在其它较高浓度暴露组如100 mg/L暴露组中, 两种实验鱼普遍出现浮于上层水面呼吸、活动的现象, 至暴露12 h稀有鮈鲫出现死亡现象, 而Medaka死亡较晚出现. 在整个急性毒性暴露实验中, 在50 mg/L及以下暴露组两种鱼均没有出现死亡, 也无明显的活动行为改变. 通过上述观察, 可以表明稀有鮈鲫对高浓度污染物暴露在行为学响应上较Medaka 相对灵敏.利用寇氏法Karber法计算48 h半致死浓度, 获得硝基苯对Medaka 和稀有鮈鲫的48 h LC50分别为141.4 mg/L95%置信区间: 137.0~145.8 mg/L与133.0mg/L95%置信区间: 126.7~139.3 mg/L, 该数值与虹鳟110.5 mg/L[7], 黑头软口鲦156 mg/L[21]毒性响应图1 静水体系中硝基苯浓度变化200中国科学 B 辑化学第37卷值相当. 另外, 根据实验获得的LC50值可以发现, 与Medaka 相比, 稀有鮈鲫对于硝基苯毒性暴露略为敏感.3.3 硝基苯在鱼体内的生物富集与消除对各暴露组实验鱼体内硝基苯含量分析结果如图3所示. 显然, 两种鱼类均能以剂量相关方式富集水体硝基苯化合物, 通过线性拟合, 发现在本实验浓度范围内实验鱼富集量与水体硝基苯含量可呈线性相关Medaka: R 2 > 0.98, 稀有鮈鲫: R 2 > 0.99. 计算实验鱼对硝基苯的生物富集因子显示, Medaka与稀有鮈鲫的生物富集因子分布为3.9 ± 0.6,2.8 ± 0.5. 由于硝基苯的lg K ow 为1.83[22]图4 实验鱼对硝基苯的富集与清除研究n =2* 鱼体中浓度/μg ·g ?1, 水体中浓度/mg·L ?1, H c lg亨利常数为?3.02[23], 因此其生物可给性比较低. 不同暴露水平下Medaka 体内硝基苯含量相对较高, 这可能与实验鱼种及鱼体内脂肪含量有关.Medaka 和稀有鮈鲫体内硝基苯基本上完全得到清除. 与对照组相比, 实验鱼活动行为得到有效恢复. 基于上述研究结果, 可以发现本研究所用实验鱼对硝基苯表现出了相似的富集与消除行为. 鱼体可以快速摄入水体硝基苯, 而在清水环境中又可快速清除体内硝基苯, 这说明硝基苯化合物在水生物中可能不具有生物累积效应.3.4 硝基苯暴露对Medaka 和稀有鮈鲫典型分子生物标志物的影响3.4.1 硝基苯对SOD 活性的影响图3 不同暴露浓度下实验鱼体内硝基苯含量n =10超氧化物歧化酶SOD作为抗氧化防御体系中的一个重要成分, 通过监测生物体肝脏SOD 活性可以很好评价受害机体氧化损伤状况. 硝基苯暴露下Medaka 和稀有鮈鲫肝脏SOD 活性变化比较如图5所示. 总体上, 不同浓度硝基苯暴露24或48 h可以引起两种鱼类肝脏SOD 活性抑制. 其中与稀有鮈鲫相比, Medaka肝脏SOD 活性呈较显著的暴露剂量相关式抑制效应P通过不同浓度暴露下两种鱼体内硝基苯含量分析还可以发现, 实验鱼个体间对硝基苯的富集量差别不大图3, 因此在实验鱼对硝基苯富集与消除研究中, 在每个时间点上取两条鱼的平行测定值的平均值来反映其在设定暴露浓度与时间上体内的硝基苯浓度水平, 结果如图4所示. 显然当实验鱼投入50 mg/L硝基苯溶液中后, 可以在2 h内快速摄入硝基苯化合物, 并达到较高的富集水平. 在随后的22h静水式富集实验中, 鱼体内浓度随着水体硝基苯浓度下降而呈下降变化, 没有出现污染物富集剂量的时间累积效应. 暴露状态下的两种实验鱼对外界刺激反应迟钝. 当实验鱼回放入清水后, 在1 h之内鱼体中大部分硝基苯得到排出Medaka和稀有鮈鲫分别排出暴露24 h时的25%和20%. 当回放清水24 h时后,3.4.2 硝基苯对CAT 活性的影响生物体内过氧化氢酶CAT作为一种有效的预警第2期周群芳等: 水体硝基苯对日本青鳉和稀有鮈鲫的亚急性毒理学效应 2013.4.3 硝基苯对AChE 活性的影响乙酰胆碱酯酶AChE活性作为神经毒性的分子生物标志物, 其活性变化可以用于解释硝基苯暴露鱼体行为学的变化. 硝基苯暴露24 h对Medaka 和稀有鮈鲫脑AChE 活性影响如图7所示. 结果表明硝基苯对Medaka 和稀有鮈鲫脑AChE 活性在短期暴露下24 h均表现出剂量相关的诱导作用P图5 硝基苯暴露引起SOD 活性变化n =5M: Medaka, C: 稀有鮈鲫酰胆碱, 从而中止神经冲动传输[24]. AChE活性变化可干扰胆碱能神经传输, 从而影响生物体运动和平衡, 及其正常的摄食、躲避和繁殖等行为[25]. 在本研究中, 硝基苯暴露引起两种鱼脑AChE 活性增强, 这可能是鱼体对损伤性刺激的响应. 动物可通过增强AChE 活性来补偿药物暴露对其产生的胁迫[26]. AChE活性增强表明神经递质胆碱水解增强,由此引起烟碱和毒蕈碱受体活化下降, 正常的胆碱能神经传输受到影响, 因而促进实验动物产生中毒性行为学变化效应, 例如反应迟钝、游泳行为异常等. 另外, 稀有鮈鲫AChE 活性诱导效应相对更为明显, 这说明稀有鮈鲫脑AChE 对于硝基苯暴露表现出更为灵敏的响应变化. 该结果可很好解释急性暴露实验中高浓度硝基苯暴露组实验鱼不正常的活动行为.AChE活性的改变可能说明硝基苯对鱼类具有一定的神经毒性效应.性分子生物标志物在毒理学研究中得到广泛应用. 硝基苯暴露48 h对这两种鱼CAT活性影响出现相反的现象, 即Medaka CAT活性总体呈现显著的诱导现象P.图7 硝基苯暴露24 h对Medaka 和稀有鮈鲫脑AchE活性的影响n =53.5 硝基苯暴露对实验鱼靶器官的组织病理学研究根据实验室长期对Medaka 饲养观察发现,图6 硝基苯暴露48 h对Medaka 和稀有鮈鲫肝脏CAT活性的影响n =5Medaka 体色可因喂养条件、营养状况、污染水质、健康条件等因素的变化而出现非特异的病理性体色发白的现象. 在本研究中, 对照组正常Medaka 体色202中国科学 B 辑化学第37卷呈浅橘红色, 而硝基苯暴露组Medaka 体色明显发白如图8, 表明水中硝基苯化合物可能已经引起实验鱼机体出现病变.在解剖过程中发现, 两种实验鱼均由于硝基苯暴露而出现胆囊充盈肿大, 胆汁颜色呈褐绿色的现象如图9所示, 这种病变出现率高达100%. 与色泽红润质地均匀的正常肝脏相比, 暴露组肝脏色泽发乌, 有些出现溃烂糜散现象. 这些病理学症状的出现可能与鱼体肝胆的解毒功能相关. 实验鱼的肝胆病变可能影响了机体正常的消化代谢功能.到气体交换、渗透调节及其废物排泄等功能的正常运转, 从而危及鱼体的健康. 因此, 研究硝基苯对鱼鳃丝结构和功能的影响, 有助于了解硝基苯对水生生态系统的潜在危害.通过光学显微镜观察可以发现, 与对照组相比, 暴露组鱼鳃出现呼吸上皮细胞及粘液细胞肿大增生、粘液增多, 有些鱼鳃上皮细胞发生坏死、崩解等组织损伤现象如图10所示, 这些病变使得鳃的血－水交换屏障距离加大, 从而影响鱼体正常的呼吸, 导致鳃组织缺氧. 由于一般水体中上层含氧量相对较高, 因此中毒鱼群常出现上浮于水面的现象. 鳃器官功能损伤会引起鱼体衰弱, 最终死亡.图8 硝基苯暴露引起Medaka 体色发白图10 硝基苯暴露引起鱼鳃病变×400M: Medaka, C: 稀有鮈鲫通过扫描电镜观察可以发现, 正常组鳃丝呈长条形. 鳃丝表面可分为非呼吸面和呼吸面. 非呼吸表面的上皮细胞表面布有微嵴与褶皱, 分布在靠鳃小图9 50 mg/L硝基苯暴露7天引起实验鱼肝胆病变M: Medaka, C: 稀有鮈鲫片基部的较大的孔洞为氯细胞的开孔图11. 呼吸面则集中在鳃小片表面, 呼吸面上皮细胞薄, 高度血管化, 具凹陷、高低不平. 鳃丝顶部具有规则或不规则的环形微嵴, 以及一些沟、坑、孔等凹穴结构图12.暴露组实验鱼鳃结构发生明显变化. 非呼吸面由于上皮肿胀而变得较为光滑, 微嵴断裂成碎片并散乱分布, 表面呈松散浮肿状. 呼吸面分泌颗粒物增多图13. 鳃丝顶部规则的微嵴精细结构消失, 变成不规则皱褶状, 并有裂隙图14. 硝基苯对实验鱼鳃组织结构的损伤可能会削弱鳃组织功能.鱼鳃是个多功能的器官, 由鳃弓、鳃丝和鳃小片构成. 鳃丝和鳃小片表面覆盖扁平上皮组织, 含有扁平上皮细胞、泌氯细胞和粘液细胞, 其间分布着错综复杂的血管, 具有大表面积结构的鳃上皮组织有利于气体交换和离子交换的进行, 但同时也成为水体毒物首要的攻击目标. 鱼鳃一旦受到损害, 直接影响第2期周群芳等: 水体硝基苯对日本青鳉和稀有鮈鲫的亚急性毒理学效应 203图11 正常Medaka 鳃丝非呼吸面与呼吸面结构图12 正常Medaka 鳃丝顶部的微嵴结构 SL: 鳃小片, Nrs: 非呼吸面, Rs: 呼吸面, Op: 氯细胞的开孔 Mr: 环形微嵴, Mp: 凹穴, Cv: 沟壑图13 暴露组Medaka 鳃丝呼吸面结构图14 暴露组Medaka 鳃丝顶部结构通过透射电镜观察可以发现鳃小片由单层或数层呼吸上皮组成, 上皮细胞表面有一层粘液. 包括扁平上皮细胞、柱状细胞等在内的各类细胞清晰可见, 泌氯细胞胞质中含有大量线粒体图15a, 微血管中存在丰富的呈扁圆形血红细胞. 暴露组鳃组织中出现核膜肿胀、空泡状细胞图15b, 或者凋亡小体图15c, 这些结果可很好验证了硝基苯对鱼鳃细胞的损伤效应.肝脏是鱼体内最大的消化腺, 也是对有毒物质摄取、代谢与转化的重要场所, 是毒物攻击的主要目标, 因此它在毒理学研究中作为一个关键靶器官具有重要意义.图15a 对照组Medaka 鳃组织泌氯细胞; b暴露组稀有鮈鲫鳃组织中空泡状细胞; c 暴露组Medaka 鳃组织中出现凋亡小体204中国科学 B 辑化学第37卷胞出现显著的肿胀变性现象, 核仁不清晰, 胞浆浊肿, 嗜酸性增强, 细胞间质增生,细胞膜不明显, 出现灶状固缩, 以及细胞空泡变性, 肝窦消失图16. 稀有鮈鲫肝细胞在光学显微镜下观察结果与Medaka 有所不同, 其暴露组与正常肝细胞相比, 胞浆空亮, 许多细胞核染色质着色很浅, 甚至消失, 出现核固缩, 肝窦扩张现象图16.硝基苯暴露引起两种鱼肝细胞形态发生不同的变化, 说明该化合物可能对不同鱼具有不同的作用机制, 这也与上面分析的两种暴露鱼肝脏内SOD 与CAT 活性变化不同的现象吻合.扫描电镜观察结果显示对照组Medaka 肝细胞呈多边形, 相对比较扁平, 表面颗粒物或碎屑状物质较少, 细胞膜孔较小且少, 细胞间隙清晰可见图17a.图16 硝基苯暴露引起鱼肝实质细胞变化×400M: Medaka, C: 稀有鮈鲫而暴露组肝细胞肿胀圆润, 表面粗糙, 分泌颗粒物或碎片类组织较多, 细胞膜孔数目明显增多, 有些膜孔径较大, 细胞间隙消失. 这些现象可能说明硝基苯可引起鱼体肝细胞间质纤维化增生, 膜孔数目的增多可导致细胞内外物质交换失调, 从而引起细胞肿胀图17b.通过扫描电镜观察正常稀有鮈鲫肝细胞表面光滑, 细胞丰润饱满图18a, 而暴露组稀有鮈鲫肝细通过光学显微镜观察, 可以发现对照组Medaka 肝细胞成规则的多边形结构, 胞浆透亮, 细胞核与核仁清晰, 肝细胞间散在分布细小肝窦. 而暴露组肝细图17 Medaka肝细胞形态a 对照组;b 暴露组图18 稀有鮈鲫肝细胞SEMa 对照组;b 暴露组第2期周群芳等: 水体硝基苯对日本青鳉和稀有鮈鲫的亚急性毒理学效应 205图19a对照组稀有鮈鲫肝细胞中有丰富的粗面内质网和线粒体; b 暴露组Medaka 鱼体肝细胞中线粒体肿胀并发生空泡状变性; c 暴露组稀有鮈鲫鱼体肝细胞中线粒体肿胀并发生空泡状变性胞的主要病变表现为其表面颗粒物与纤维或碎片增多图18b, 这与Medaka 肝病变症状相似.根据透射电镜观察结果, 可以发现与对照组图19a相比, 在暴露组鱼体肝细胞中出现了一系列的亚细胞结构形态病变. 其中核结构变化是细胞在衰亡和损伤过程中的重要表征之一. 在本研究中, 硝基苯暴露引起Medaka 肝细胞核变化主要表现为核染色质边集、核浓缩、核碎裂、核溶解以及异型性核等, 这些核结构改变大多是细胞不可复性损伤的标志, 提示活体内细胞死亡或坏死的出现.线粒体是细胞内主要的能量形成所在, 也是极为敏感的细胞器, 所以在生理上或病理上都具有十分重要的意义. 图19b与c分别显示了两种鱼肝细胞线粒体转化为小空泡状结构, 表明线粒体已极度肿胀, 这与光学显微镜下观察到的胞浆浊肿的现象一致. 其肿胀可由多种损伤因子引起, 其中最常见的为缺氧, 各种毒物作用也可引起线粒体肿胀.上述光镜与电镜观察结果显示, 水体中较高浓度的硝基苯化合物可以直接作用于实验鱼鳃、肝脏等靶器官, 并引起显著的病理学变化, 从而扰乱生物体正常的生理机能, 产生显著的中毒症状, 甚至导致死亡.净, 因此该类鱼对外界污染物暴露相当敏感, 本研究结果很好地验证了这两类鱼对污染物耐受力的差别.4 结论。
酵母水解物对大口黑鲈生长性能、血浆生化指标以及肝脏组织健康的影响
酵母水解物对大口黑鲈生长性能、血浆生化指标以及肝脏组织健康的影响时博;薛敏;郁欢欢;梁晓芳;陈沛;陈雪松;卢存仁;郑银桦;吴秀峰;梁旭方【摘要】本试验旨在研究饲料中添加酵母水解物对大口黑鲈生长性能、血浆生化指标以及肝脏组织健康的影响.试验将160尾初始体重为(28.50±0.01)g的大口黑鲈随机分为2组,分别饲喂在基础饲料中添加0(YH0组,作为对照组)和5 g/kg(YH5组)酵母水解物的饲料.每组设置4个重复,每个重复20尾鱼,养殖周期为10周.结果显示:饲料中添加5 g/kg的酵母水解物能显著提高大口黑鲈的蛋白质沉积率(P＜0.05),但对其他生长性能指标没有产生显著影响(P＞0.05).YH5组血浆中碱性磷酸酶(AKP)活性显著高于YH0组(P＜0.05),饲料中添加5 g/kg的酵母水解物对其他血浆生化指标未产生显著影响(P＞0.05).针对大口黑鲈肝脏炎症和凋亡因子相关基因相对表达量的分析表明,YH5组肝脏中转化生长因子-β1(TGF-β1)基因的相对表达量较YH0组有下调的趋势(P＞0.05),肝脏中α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)和半胱天冬酶(caspase)家族基因的相对表达量各组间没有显著差异(P＞0.05).在YH0组鱼体肝脏组织发现脂肪浸润以及纤维化表型,在纤维化组织中显示较多的激活态半胱天冬酶3信号,说明该表型下细胞凋亡严重程度高于脂肪肝和正常肝脏,YH5组鱼体肝脏组织耒见纤维化表型.由此表明,饲料中添加5 g/kg的酵母水解物可促进大口黑鲈鱼体蛋白质沉积,降低肝脏细胞纤维化的风险.【期刊名称】《动物营养学报》【年(卷),期】2018(030)007【总页数】10页(P2772-2781)【关键词】大口黑鲈;酵母水解物;生长;肝病;凋亡【作者】时博;薛敏;郁欢欢;梁晓芳;陈沛;陈雪松;卢存仁;郑银桦;吴秀峰;梁旭方【作者单位】中国农业科学院饲料研究所国家水产饲料安全评价基地,北京100081;中国农业科学院饲料研究所国家水产饲料安全评价基地,北京100081;农业部饲料生物技术重点开放实验室,北京100081;中国农业科学院饲料研究所国家水产饲料安全评价基地,北京100081;中国农业科学院饲料研究所国家水产饲料安全评价基地,北京100081;中国农业科学院饲料研究所国家水产饲料安全评价基地,北京100081;珠海天香苑生物科技发展股份有限公司,珠海519000;珠海天香苑生物科技发展股份有限公司,珠海519000;中国农业科学院饲料研究所国家水产饲料安全评价基地,北京100081;中国农业科学院饲料研究所国家水产饲料安全评价基地,北京100081;华中农业大学水产学院,武汉430070【正文语种】中文【中图分类】S963大口黑鲈(Micropterus salmoides)，又名加州鲈，隶属鲈形目(Perciforme)，太阳鱼科(Ceutrarchidac)，黑鲈属(Micropterus)。
养虾界，一种天然多糖出炉！它或将成为一代养虾利器！
养虾界，一种天然多糖出炉！它或将成为一代养虾利器！栖息在任何生物体的消化道中的微生物（也称为微生物群）的多样性，对宿主的生理学具有深远的影响，包括：从营养代谢和免疫系统发育，到抗感染和提高的生长性能。
多项研究表明微生物群在宿主中的重要性，即使在虾等低等生物中也是如此。
一、一种新型的天然塘（Agavin）南美白对虾的微生物群组成，取决于水体盐度和饲料等环境因素，以及器官和发育阶段等生物因素。
养殖环境强烈影响水体、沉积物和虾之间的微生物交换，这种交换对于维持有益、无害和致病微生物之间的充分平衡至关重要。
有不同的方法可以通过饲料来调节虾的微生物群，提高生长性能、抗病性和生产力。
一种常规的做法是在饲料中添加益生菌，益生菌通过抑制病原体的增殖、刺激免疫反应、促进虾的生长速度、存活率和营养吸收，来发挥其在虾的消化道中的活性。
第二种策略是通过饲料补充益生元来促进生长、存活和积极的免疫性能，同时减少潜在病原体的相对丰度。
龙舌兰植物产生的一种不易消化的天然糖Agavin，对南美白对虾微生物群中有益微生物的影响。
Agavin是一种由龙舌兰植物生产的不易消化的天然糖，其用途广泛，包括生产纤维和食品、饮料和龙舌兰酒等。
但是龙舌兰Agavin促进益生元生长的潜力，几乎没有被研究过，而且之前也没有关于龙舌兰Agavin，对南美白对虾的肝胰腺和肠道微生物群的影响的报告。
今天笔者就跟大家分享一项最新的研究，该研究评估了agavin对南美白对虾的肠道和肝胰腺的微生物群结构，检查有益微生物的富集情况，并验证最终的微生物群生长是否可能依赖于个别器官。
二、研究设置该研究是在墨西哥锡那罗亚州西北太平洋的虾场内进行，该试验遵循传统半精养的养虾模式，每天换水20%，每天手动投喂两次，并使用料台检查饲料的消耗量。
在试验期间，所有虾的所有生物和非生物因素都相同，因为所有试验网箱都放置在同一个池塘中。
根据虾的营养需求，制定了三种等蛋白质和等脂饲料。
科研的成功之路(pathway)上绕不过去的靶点—caspase!
科研的成功之路（pathway）上绕不过去的靶点—caspase！订阅号APExBIO5月1，Nature在线刊登了北京生命科学研究所（NIBS）邵峰院士组的一篇名为“Chemotherapy drugs induce pyro ptosis through caspase-3 cleavage of a Gasdermin”的研究性论文，该研究揭示了化疗药物诱导的细胞焦亡是通过活化的caspase-3对Gasdermin E（GSDME）的切割完成的。
GSDME在很多癌细胞中不表达或低表达而在正常组织中高表达，该研究发现化疗药物通过GSDME介导的细胞焦亡会杀死一些正常的细胞，而Gsdme-/- 基因敲除的小鼠可以免受化疗药物带来的组织损伤和体重减轻，为癌症化疗提出了全新见解。
“中国最年轻院士”邵峰，图片来源于网络细胞焦亡（pyroptosis或pyroptotic cell death）又称细胞炎性坏死，是一种程序性细胞坏死，表现为细胞不断胀大直至细胞膜破裂，导致细胞内容物的释放进而激活强烈的炎症反应。
细胞焦亡的形态学特征、发生及调控机制等均不同于凋亡、坏死等其它细胞死亡方式。
细胞焦亡是机体一种重要的天然免疫反应，在抗击感染中发挥重要作用。
过度的细胞焦亡会诱发包括败血症在内的多种炎症和免疫性疾病。
目前认为，细胞焦亡由包括caspase-1和caspase-4/5/11在内的炎性caspase活化而诱发。
Caspase-1在病原信号诱导形成的炎症小体复合物作用下被激活；邵峰实验组之前的研究证实caspase-4/5/11是细菌脂多糖（LPS，又称内毒素）的胞内受体，在结合LPS后发生寡聚而被活化。
然而，20多年来人们对于炎性caspase如何诱导细胞焦亡的机理一直完全不清楚。
直到2015年，来自邵峰课题组和美国Genentech的研究人员发现了caspase 诱导细胞焦亡的机制，即发现了一个所有炎性caspase1/4/5/11的共同底物蛋白GSDMD，炎性caspase通过切割GSDMD释放其N端结构域而引发细胞焦亡。
不同温度下东海原甲藻的细胞死亡
不同温度下东海原甲藻的细胞死亡*李璞昭 李宇豪 黄晓舟（通讯作者）泉州师范学院 海洋与食品学院 福建 泉州 362000 摘 要 东海原甲藻赤潮是我国最常见的赤潮，已经给我国海洋生态带来了严重后果，研究其赤潮消亡过程非常重要。
本文主要利用流式细胞技术来测定东海原甲藻在不同温度下（16、20、24℃）的细胞生长、死亡率及与死亡相关蛋白caspases-like的活性。
结果表明：20℃下东海原甲藻细胞总数和存活细胞数量最多，但死亡率和其他2个温度没有显著差异，且有caspases-like活性的细胞比例和16℃组也无明显差异。
可见，东海原甲藻caspases-like蛋白在低温条件下不全是执行PCD…的功能，可能有辅助东海原甲藻适应低温的功能。
关键词 赤潮；东海原甲藻；细胞程序性死亡；caspases-likeCell Death of Prorocentrum Donghaiense at Different TemperaturesLi Pu-zhao, Li Yu-hao, Huang Xiao-zhou(corresponding author)College of Oceanology and Food Science, Quanzhou Normal University, Quanzhou 362000, Fujian Province, ChinaAbstract The bloom of Prorocentrum donghaiense is the most common red tide in China, which has brought serious consequences to marine ecology, therefore, it is very important to study its algal bloom extinction process. In this paper, flow cytometry was mainly used to determine the cell growth, death rate and the caspases-like activity of P. donghaiense at different temperatures (16℃, 20℃, 24℃). The results showed that, the number of total cells and surviving cells of P. donghaiense were all highest at 20℃, but there was no significant difference in death rate compared to the other two temperatures. And there was no significant difference in the caspases-like activity at 20℃and 16℃. It concluded that the caspases-like protein of P. donghaiense did not all perform the functions of PCD under low temperature, and might have the function of assisting P. donghaiense to adapt to low temperature.Key words bloom; Prorocentrum donghaiense; programmed cell death; caspases-like引言赤潮是一种严重的全球性海洋灾害，不仅不同程度的破坏海洋生态系统，给海洋生物和人类的健康带来威胁，还会对水产养殖业带来危害，造成重大的经济损失。
壳聚糖的生物活性及其在水产动物中的研究进展
壳聚糖的生物活性及其在水产动物中的研究进展。
壳聚糖是甲壳素脱乙酰基后得到的一种带正电荷的高分子碱性多糖。
甲壳素广泛存在于低等动物尤其是节肢动物（如虾、蟹和昆虫）外壳中，也存在于真菌和藻类细胞壁中。
全世界每年蟹、虾和龙虾等水产品加工后的甲壳废弃物有100 多万t，其中含有10%～30% 甲壳素。
甲壳素溶解性较差，化学性质也不活泼，不溶于水、稀酸、稀碱和一般的有机溶剂，仅能溶于无机浓酸等一些非常规溶剂。
甲壳素经过脱乙酞基后，得到的壳聚糖呈白色至淡黄色，虽然仍不溶于水、碱溶液和有机溶剂中，但可溶于稀酸溶液，包括无机稀酸（盐酸、硝酸等）和有机稀酸（醋酸、乳酸、甲酸、抗坏血酸、苹果酸等）。
在柠檬酸、酒石酸等多价有机酸的水溶液中，壳聚糖只有在加热至高温时才能溶解，而当温度下降后呈凝胶状。
1 壳聚糖的制备壳聚糖来源丰富，提取工艺也较为简单，成本低廉。
其方法是用乳酸菌发酵新鲜虾壳，用发酵过程产生的乳酸脱去虾壳中的矿物质和蛋白质等，发酵产物经过固液分离即得到甲壳素。
此法用葡萄糖作为发酵的限制性底物，当大规模生产甲壳素时，还可以用蔗糖代替葡萄糖，同时也降低了生产成本。
2 壳聚糖的生物活性2.1 对生产性能的影响徐介民（2008）在重约50g草鱼的基础日粮中添加壳聚糖（0.25%、0.50%、1.00%），研究其对草鱼生长性能的影响。
结果表明，壳聚糖能促进草鱼生长，与基础日粮组相比，0.25%、0.50% 和1.00% 壳聚糖组草鱼的增重率分别增加56.6%、72.8%和65.5%。
草鱼饲料中添加不同浓度的壳聚糖也能影响草鱼的投饵系数，与基础日粮组相比，0.25%和0.50%壳聚糖组其投饵系数均下降8.4%，1.00%壳聚糖组其投饵系数显著高于其他各组。
昆虫体壳甲壳素的含量最高，体壁灰分含量少，较虾、蟹壳易于提取甲壳素及减少甲壳素分子链酸降解，相对容易生产。
翟少伟（2009）研究了昆虫源壳聚糖在鲫鱼饲料中适宜的添加水平。
加州鲈Caspase-3_基因克隆及表达分析
安徽农学通报2023年21期动物科学加州鲈Caspase-3基因克隆及表达分析梁富宋长江唐怀庆丘金珠赵天珍郑汉生宋海霞*（中山市农产品质量安全检验所，广东中山528400）摘要从加州鲈（Micropterus salmoides）头肾组织中克隆获得Caspase家族中Caspase-3基因的编码区序列，通过生物信息学分析工具分析Caspase-3基因的蛋白结构，预测其功能并检测其在加州鲈各组织中的表达量。
结果表明，该基因cDNA全长890bp，ORF为852bp，可编码283个氨基酸，蛋白理论分子质量为73.06ku，理论等电点（PI）为5.09；Caspase-3基因含有一个保守信号肽序列，不存在跨膜区；多序列比对结果显示加州鲈Caspase-3与红笛鲷（Lutjanus peru）Caspase-3相似度最高，高达88.38%；系统进化分析发现加州鲈Caspase-3与红笛鲷聚为一支；Caspase-3基因在所取组织中均有表达，在脑组织中表达量最高，在鳃组织中表达量最低。
关键词加州鲈；Caspase-3；生物信息学；组织表达分析中图分类号S917.4；S9-9文献标识码A文章编号1007-7731（2023）21-0073-07Cloning and expression analysis of Caspase-3in Micropterus salmoidesLIANG Fu SONG Changjiang TANG Huaiqing QIU Jinzhu ZHAO TianzhenZHENG Hansheng SONG Haixia*（Zhongshan Institute for Quality and Safety Inspection of Agricultural Products,Zhongshan528400,China）Abstract The sequence of the coding region of Caspase-3gene in Caspase family was obtained from the head and kidney tissue of Micropterus salmoides,and the protein structure and function of Caspase-3gene was analyzed by bioinformatics analysis tools.The results showed that the cDNA of Caspase-3was890bp,ORF was852bp,encoding 283amino acids.The theoretical molecular mass was73.06ku,and the theoretical isoelectric point(PI)was5.09.This gene contained a conserved signal peptide sequence without the transmembrane region.Multiple sequence alignment showed that the M.salmoides Caspase-3met Lutjanus peru Caspase-3up to88.38%.Phylogenetic analysis found that M.salmoides Caspase-3and L.peru cluster together.The Caspase-3gene was expressed in the selected tissues,which was the highest in brain tissues and the lowest in gill tissues.Keywords Micropterus salmoides;Caspase-3;bioinformatics;tissue expression analysis加州鲈（Micropterus salmoides）又称大口黑鲈，原产于美国，目前在我国沿海内陆地区广泛养殖，是近年来我国主要养殖品种之一[1]。
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Caspase在水产动物中的研究进展作者：国超曾繁爽杨旭吴洋磊杨祯来源：《河北渔业》2021年第11期摘要：综述了caspase种类、分类和caspase家族在机体发育、炎症和调节细胞凋亡等方面发挥的重要作用。
总结了不同种类的caspase在鱼类、贝类、甲壳类和棘皮类中的免疫应答、作用机制以及炎症中的阶段性研究进展，并归纳了caspase抑制剂在水产动物中的应用。
关键词：caspase; caspase抑制剂;水产动物Caspase是一类进化保守，具有相似氨基酸序列、结构和特异性底物的蛋白酶家族[1]。
由于caspase具有半胱氨酸蛋白酶活性——其活性位点的半胱氨酸残基仅在天冬氨酸残基之后才会亲核攻击和切割目标蛋白，因此caspase被称为具有天冬氨酸特异性的半胱氨酸蛋白水解酶，又称为半胱天冬酶[2]。
目前已鉴定出14种半胱天冬酶，分别命名为caspase-1—caspase-14，它们都具有一些共同的特性：（1）均为天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶;（2）都有一个保守的五肽活性位点QACXG（X可以是R、Q或D）;（3）前体都是称为前蛋白酶的酵素[3]。
根据半胱天冬酶在氨基酸序列上的同源性，将半胱天冬酶分为三个亚类，第一类是被称为细胞凋亡活化剂的启动caspase，包括caspase-2、caspase-8、caspase-9、caspase-10;第二类是被称为细胞凋亡效应剂的效应caspase，包括caspase-3、caspase-6和caspase-7;第三类是发挥炎症介质作用的caspse，例如caspase-1、caspase-4、caspase-5等[4]。
一般情况下，半胱天冬酶家族可通过两条途径被激活：一是凋亡信号诱导的凋亡受体介导途径;另一种是应激诱导的线粒体介导途径（caspase-9依赖途径）。
一旦凋亡途径被激活，它们就会产生连锁反应，凋亡激活因子caspase-2、caspase-8等将激活其下游凋亡效应因子caspase-3、caspase-6和caspase-7。
半胱天冬酶在生物程序性细胞死亡（例如细胞焦亡和坏死性凋亡）中发挥重要作用，而这些形式的细胞死亡可以保护生物体免受应激信号刺激和病原体攻击。
同时半胱天冬酶在炎症中也有作用，它可以直接处理促炎细胞因子，如pro-IL1β。
由于以上半胱天冬酶在细胞凋亡和免疫中发挥的不可或缺的作用，越来越多有关水产动物半胱天冬酶的研究被报道，因此，本文将综述近年来半胱天冬酶在鱼类、贝类、甲壳类和棘皮类四大类水产动物中的研究进展，以期为研究者了解半胱天冬酶对水产动物细胞凋亡和免疫的影响提供参考。
1 Caspase在鱼类中的研究进展细胞凋亡对所有多细胞生物的发育和稳态具有重要的影响。
因此，所有后生动物物种似乎都拥有凋亡机制的必要组成部分，但总的来说，它们的数量和复杂性在进化过程中不断增加。
几乎所有哺乳动物半胱天蛋白酶的同源鱼类已被鉴定出来，但也有一些鱼类特有的半胱天蛋白酶被认为具有不同的功能[5]。
斑马鱼（Danio rerio）作为常见的模式生物是研究caspase最全面的鱼类之一。
斑马鱼的基因组编码多种凋亡成分，包含多个caspase启动子和效应子，其中至少有6个caspase具有与哺乳动物caspase-8和caspase-10同源的蛋白酶结构域[6]。
同时在斑马鱼中还发现了几种炎性介质的caspase：caspase caspy和caspase caspy2，其催化结构域与人caspase-1和caspase-5的同源性最高，但它们都包含一个n端pyrin结构域[7]。
此外，斑马鱼的基因组包含caspase-C和一种caspase-C样蛋白酶，与人类caspase-4的相似性很高[8]。
关于caspase的研究报道在其他常见鱼类中屡见不鲜。
LPEZ-CASTEJN等[9]首次鉴定鱼类炎症性caspase—金头鲷（Sparus aurata）caspase-1，并发现鲷鱼caspase-1基因在孵化后1天的幼鱼中表达，其mRNA表达水平在整个发育过程中都在增加。
大西洋鲑作为一种原始硬骨鱼，其凋亡受体和线粒体介导途径的许多关键成分被鉴定出来，Takle等[10]从大西洋鲑中克隆了五种编码caspase-3、caspase-6和caspase-7的基因，并在热应激鲑鱼胚胎中研究发现，高温可以诱导启动子caspase激活。
Bi等[11]鉴定小黄鱼的caspase-6和caspase-7基因，并分析了整个caspase家族的进化，进一步描述了鱼类中caspase-6和caspase-7基因的进化选择位点。
结果表明，caspase-6基因在硬骨鱼的物种进化和基因复制方面的出现，早于caspase-7，且caspase-6基因在鱼类进化过程中没有潜在的正选择位点，而caspase-7基因则被发现了两个潜在的正选择位点。
除此之外，其他常见的水产养殖鱼类的部分caspase研究进展见表1。
2 Caspase在贝类和甲壳类中的研究进展相比鱼类，caspase在贝类和甲壳类中的研究较少，主要集中于牡蛎、扇贝、贻贝、鲍、对虾和部分蟹类。
在贝类和甲壳类的caspase的研究中，主要方法有：（1）从转录水平上探究caspase基因在各组织的表达。
（2）通过胁迫等方式激发免疫应答，探究该物种caspase基因对胁迫的响应。
研究表明caspase基因广泛存在于贝类和甲壳类的血细胞、鳃和肝胰腺等组织，例如在太平洋牡蛎（Crassostrea gigas）鳃中观察到较高的caspase-3和caspase-7表达水平[23]，牡蛎先天免疫反应中发现鳃和血细胞中caspase-1表达量较高[24]，香港牡蛎（Crassostrea hongkongensis）体内caspase-8中普遍表达，其在性腺和外套膜中表达水平最高[25];杂色鲍（Haliotis diversicolor）[26]和皱纹盤鲍（Haliotis discus discus）[27]caspase基因在鳃、血液、肝胰腺和肌肉等各组织器官中均有表达，其中在鳃中表达量最高，可能是因为鳃是病原菌入侵的主要部位;caspase基因在中华绒螯蟹（Eriocheir sinensis）[28]和凡纳滨对虾（Litopenaeus vannamei）[29]血细胞、心脏、肝胰腺、鳃、胃、肌肉等组织中广泛表达，其中中华绒螯蟹肝胰腺中表达量最高而凡纳滨对虾血细胞中表达量最高。
3 Caspase在棘皮類中的研究进展Caspase在棘皮类中的研究主要集中于海胆和海参。
海胆作为常见的模式生物通常用来研究caspase在动物细胞凋亡和免疫中发挥的作用。
由于目前已成功鉴别的海胆caspase基因仅数种，包括caspase-3、caspase-7、caspase-8[30]，因此有关海胆caspase实验大多数是研究在一种或数种环境胁迫下海胆体内整个caspase酶家族的变化，这些变化可以用caspase酶活力、免疫细胞化学检测、细胞凋亡数量等评估。
与海胆不同，海参caspase的研究通常与海参特有的生理习性（例如化皮、吐肠、夏眠、再生等）相联系，其中与化皮关联的海参caspase基因研究是最多的，这与海参化皮伴随细胞凋亡、凋亡信号传导等凋亡过程有关[31]。
已有研究表明，海参自溶过程中caspase-3、caspase-9是关键性的内源酶之一[32]。
4 Caspase抑制剂在水产养殖中的应用细胞凋亡是一种在受到适当触发因素刺激时允许细胞自我毁灭的机制，细胞凋亡可以调节机体发育和内环境稳定，但凋亡的失衡会引起机体发生疾病，例如肿瘤的产生、自身免疫疾病、细胞过度凋亡和凋亡衰减等。
由于caspase家族是介导机体细胞凋亡关键性的内源酶，因此caspase抑制剂也被广泛应用于治疗机体的凋亡失衡。
Caspase抑制剂主要分为两类：（1）天然caspase抑制剂，例如细胞因子效应调节剂A（CrmA）、Zn2+等;（2）人工合成caspase 抑制剂，包括合成肽类和合成非肽类。
随着水产动物caspase研究的深入，研究表明caspase抑制剂可用于治疗水产动物凋亡失衡，提高抗病能力。
例如KIM等[33]发现广谱caspase抑制剂Z-VAD-FMK可以延长养殖鱼类感染病毒性出血性败血症病毒（VHSV）的存活时间;YABU等[34]发现caspase抑制剂benzyloxycarbonyl-Asp-Glu-Val-Asp-fluoromethylketone可以明显抑制斑马鱼因caspase-3的过表达而引起的细胞凋亡;Qu等[35]发现凋亡抑制剂（IAP）蛋白可以通过抑制牡蛎（Crassostrea gigas）caspase活性和促进免疫反应来维持细胞增殖和细胞死亡之间的平衡;宋林生等[36]克隆了一种中华绒螯蟹caspase抑制剂基因EsCystatin并在大肠杆菌中实现体外重组表达，研究结果表明当重组蛋白浓度达到350 μg/mg时木瓜蛋白酶（活性中心为半胱氨酸）活性被完全抑制，研究结果为中华绒螯蟹病害防治和防御体制提供了理论基础;杨静峰等[37]发现使用广谱性caspase抑制剂Z-DEVD-FMK及其多肽衍生物AC-DEVD-CHO以及6-氨基-3-甲基嘌呤，通过浸泡或者灌肠的方式用于海参，可以抑制因细胞凋亡而引起的海参化皮，有效延长鲜活海参的存活和运输时间。
5 展望caspase是细胞凋亡的关键性内源酶，与机体的免疫密切相关。
研究caspase在水产动物的种类和作用，有助于了解和掌握水产动物的疾病发生机制，从而进一步发掘潜在的免疫增强剂。
目前有关水产动物caspase的研究处于起步阶段，仅有部分鱼类趋近完善，大部分贝类、甲壳类和棘皮类的报道相对较少。
毋庸置疑，未来Caspase必将是水产免疫研究的重点对象。
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