北师大版选修1生物技术实践《测定土壤中微生物的数量》说课稿
2017-2018学年高中生物第1章微生物技术第3课时微生物数量的测定同步备课教学案北师大版选修1
第3课时微生物数量的测定[学习导航] 1.阅读教材P17内容，概述测定某种微生物数量的方法和步骤。
2.结合教材P15～17“测定土壤中微生物的数量”实验，掌握使用平板菌落计数法测定土壤中微生物的数量。
[重难点击] 1.掌握测定某种微生物数量的方法和步骤。
2.学会使用平板菌落计数法测定土壤中微生物的数量。
一、微生物数量测定的方法和原理微生物数量的测定也是重要的微生物技术之一，平板菌落计数法是一种应用广泛的微生物数量测定方法。
1.平板菌落计数法的原理：根据微生物在高度稀释的条件下，固体培养基上所形成的单个菌落，是由一个单细胞繁殖而成的，即一个菌落代表一个单细胞。
2.计算方法：从平板上的菌落数推测出每克样品中的菌落数的计算方法是：同一稀释度的菌落平均数÷0.2÷稀释度×10。
3.优缺点(1)优点：能测出样品的活菌数，可用于微生物的选种与育种、分离纯化及其他方面的测定。
(2)缺点：操作烦琐、时间较长、测定值常受各种因素的影响。
4.该方法统计的菌落数比活菌的实际数目低，这是因为当两个或多个细胞在一起时，平板上观察到的只是一个菌落。
1.为什么分离不同的微生物要采用不同的稀释度？答案土壤中各种微生物的数量是不同的，为获得不同类型的微生物，就需要按不同的稀释度进行分离。
2.平板菌落计数法(1)平板菌落计数法根据操作步骤的不同可分为哪两种？答案①涂布平板法：用灭过菌的涂布器将一定量(一般为0.1 mL)的适当稀释过的菌液涂布在琼脂培养基的表面，然后保温培养直到菌落的出现。
记录菌落的数目并换算成每毫升样品中的活细胞的数量。
②倒平板法：将已知体积(0.1～1 mL)的适当稀释过的菌液加到灭过菌的培养皿内，然后倒入溶化后冷却至45 ℃的琼脂培养基，水平晃动混匀，待凝固后保温培养到出现菌落，然后与涂布平板法同样计数。
(2)平板菌落计数法中换算样品的含菌数依据什么数据换算？答案依据稀释倍数、取样接种量和菌落数。
高中生物第1章微生物培养技术第3节测定微生物的数量学案中图版选修1
第三节测定微生物的数量一、测定微生物数量的方法测定微生物数量的方法可分为两类：直接计数法和间接计数法.前者常用的是显微镜直接计数法，这种方法是先将待测样品制成悬液，然后取一定量的悬液放在显微镜下进行计数。
该方法适用于纯培养悬浮液中各种单细胞菌体的计数。
后者最常用的是稀释平板计数法，需要将待测样品配制成均匀的系列稀释液并使其均匀分布于平板中的培养基内，经培养后统计培养基中出现的菌落数，从而推算出样品中的活菌数。
利用血球计数板测出的菌体数与平板计数法相比哪个多些？【提示】血球计数板测出的是全部菌体数,而平板计数法只能测出活菌数，而且比实际数偏少。
二、间接计数法的实验设计1．制备土壤稀释液取土壤表层5~10 cm处的土样.准确称取1 g土样，放入盛有99 mL无菌水的锥形瓶中，振荡20 min后制成102倍的稀释液.然后进行系列稀释,得到103、104、105、106倍的系列稀释菌液。
2．取样及倒平板3．培养4．观察记录（1）计数时对于细菌、放线菌以每个培养皿内有30～300个菌落为宜，霉菌以每个培养皿内有10～100个菌落为宜。
（2）计算每克样品菌数公式为：每克土壤样品菌数＝错误!×稀释倍数.预习完成后，请把你认为难以解决的问题记录在下面的表格中问题1问题2问题3问题4一、微生物生长量的测定1.测重量法干重法：将单位体积待测的培养液离心后，用清水洗涤1～5次，放入干燥器中加热干燥，加热温度一般在100～105 ℃之间,再称重。
以细菌为例,一个细胞一般重约10－12～10－13g，也可在较低温度（如40 ℃)下进行真空干燥。
湿重法：将一定量的菌悬液离心或过滤，得到菌体，反复洗涤后称湿重，干重一般为湿重的20%~25％。
2．计数法(1)直接计数法这种方法是利用特定细菌计数板或血球计数板，在显微镜下计算一定容积里样品中微生物的数量。
此法的缺点是不能区分死菌与活菌。
计数板是一块特制的载玻片，上面有一个特定的面积1 mm2和高0。
土壤微生物测定方法
精心整理土壤微生物测定土壤微生物活性表示土壤中整个微生物群落或其中的一些特殊种群状态，可以反映自然或农田生态系统的微小变化。
土壤微生物活性的表征量有:微生物量、C/N 、土壤呼吸强度和纤维呼吸强度、微生物区系、磷酸酶活性、酶活性等。
测定指标：1、物分解物量。
（1（2）提取将熏蒸土壤无损地转移到200mL 聚乙烯塑料瓶中，加入100mL0.5mol ·L -1 K 2SO 4（图水比为1:4；w ：v ），振荡30min （300rev ·min -1），用中速定量滤纸过滤于125mL 塑料瓶中。
熏蒸开始的同时，另称取等量的3份土壤于200mL 聚乙烯塑料瓶中，直接加入100mlL0.5mol ·L -1 K 2SO 4提取；另作3个无土壤空白。
提取液应立即分析。
（3）测定吸取10mL上述土壤提取液于150mL消化管（24mmх295mm）中，准确加入10mL0.018 mol·L-1K2Cr2O7—12 mol·L-1H2SO4溶液，加入2~3玻璃珠或瓷片，混匀后置于175±1℃磷酸浴中煮沸10min（放入消化管前，磷酸浴温度应调至179℃，放入后温度恰好为175℃）。
冷却后无损地转移至150mL三角瓶中，用去离子水洗涤消化管3~5次使溶液体积约为80mL，加入一滴邻菲罗啉指示剂，用0.05 mol·L-1硫酸亚铁标准溶液滴（4（mL），f23、土壤呼吸强度和纤维分解强度土壤呼吸强度和纤维分解强度是土壤微生物活性的重要标志，反映了土壤中微生物活性及对有机质残体分解的速度和强度。
纤维素分解强度采用埋片法；呼吸强度采用碱吸收滴定法。
土壤微生物活性用土壤呼吸CO2测定法（5g鲜土于310mL试剂瓶中，22℃24h测CO2释放量(用exH23os红外CO:分析仪测定)）。
直接测定土壤呼吸的方法基本可分为静态气室法、动态气室法和微气象法三种。
【实验】测定土壤中微生物的数量
[三]微生物的培养与观察
不同菌落的鉴定指标：菌落的形状、大小、 隆起程度、颜色等。
（二）统计菌落数目
每克样品中的菌株数致 C：某一稀释度下平板上生长的平均菌落数 V：涂布平板时所用的稀释液的体积（ml) M：稀释倍数
为了测定微生物的数量，接种时应采用_稀__释__涂__布__平__板___ 法，某同学在4个培养基上分别接种稀释倍数为106的土 壤样液0.1 mL，培养后菌落数分别为180、155、176、 129个，则原土壤样液中上述微生物的含量为 __1_.6_×__1_0_9_个__/m__L_______，测定的活菌数比实际活菌数 ____低____(填“低”“高”“基本一致”)。
（1）从土壤中分离出能够分解尿素的细菌； （2）统计每克土壤样品中究竟含有多少这样的细菌。
尿素分子的立体结构
（一）筛选菌株
美国微生物学科布鲁克1966 年发现耐热细菌，从水生耐 热细菌Taq得到耐高温的Taq DNA聚合酶。
一、研究思路
(一)筛选菌种
1 实例：耐高温的DNA聚合酶
PCR技术：要求使用耐高温（930C） 的DNA聚合酶。
稀释度（倍）
106
107
108
平板
1 2 3 12 3 1 2 3
平板菌落数（个） 432 421 445 78 67 74 9 6 8
涂布时应当在酒精灯火焰旁 附近操作，为了保证结果准确，应选 择上述稀释度为 107 倍的平板菌落数作为统计结果，原因是 计数平板的菌落数 ，计算出样品中每毫升乳酸菌数为7.3×。109 量范围为30~300
（1）样品稀释：先将样品稀释10倍，可用无菌移液管吸取25mL 酸奶样品加入盛有 225 mL无菌水的三角瓶中，使样品与水充分混 匀。然后进行系列稀释操作，得到稀释至106、107、108倍的样品。 （2）培养与统计：吸取不同稀释度的样品各1mL，分别置于不同
土壤微生物生物量的测定(滴定法)
1. 土壤微生物生物量的测定(滴定法)一、实验目的和内容土壤微生物生物量是指土壤中体积小于5～10μm3活的微生物总量，是土壤有机质中最活跃的和最易变化的部分。
耕地表层土壤中，土壤微生物量碳（Bc）一般占土壤有机碳总量的3％左右，其变化可直接或间接地反映土壤耕作制度和微生物肥力的变化，并可以反映土壤污染的程度。
近30年来，国外许多学者对土壤微生物生物量的测定方法进行了比较系统的研究，但由于土壤微生物的多样性和复杂性，还没有发现一种简单、快速、准确、适应性广的方法。
目前广泛应用的方法包括：氯仿熏蒸培养法（FI）、氯仿熏蒸浸提法（FE）、基质诱导呼吸法（SIR）、精氨酸诱导氨化法和三磷酸腺苷（A TP）法。
氯仿熏蒸浸提法（FE）的原理是：土壤经氯仿熏蒸处理，微生物被杀死，细胞破裂后，细胞内容物释放到土壤中，导致土壤中的可提取碳、氨基酸、氮、磷和硫等大幅度增加。
通过测定浸提液中全碳的含量可以计算土壤微生物生物量碳。
二、实验材料和用具仪器：培养箱；真空干燥器；真空泵；往复式振荡机（速率200次每min）；1L广口玻璃瓶；定量滤纸；紫外分光光度计；LNK-872型消煮炉（江苏省宜兴市科教仪器研究所）试剂：1.无乙醇氯仿：市售的氯仿都含有乙醇（作为稳定剂），使用前必须除去乙醇。
方法为：量取500ml氯仿于1000ml分液漏斗中，加入50ml硫酸溶液[ρ(H2SO4)=5%]，充分摇匀，弃除下层硫酸溶液，如此进行3次。
再加入50ml去离子水，同上摇匀，弃去上部的水分，如此进行5次。
将下层的氯仿转移存放在棕色瓶中，并加入约20g无水K2CO3，在冰箱的冷藏室中保存备用。
2.硫酸钾溶液[c(K2SO4)=0.5mol·L-1]称取硫酸钾（K2SO4，化学纯）87.10g，先溶于300ml去离子水中，加热，转移溶液至容器中，再加少量去离子水溶解余下的部分，转移溶液至同一容器中，如此反复多次。
最后定容至1L；3.重铬酸钾[c(1/6 K2Cr2O7)=0.4000mol·L-1]：称取经130℃烘干2～3h的重铬酸钾（K2Cr2O7，分析纯）19.622g，溶于1000ml去离子水中；4.邻啡罗啉亚铁指示剂：称取邻啡罗啉（C12H8N2H2O，分析纯）1.49g，溶于含有0.70gFeSO4·7H2O的100ml 去离子水中，密闭保存于棕色瓶中；5.硫酸亚铁溶液[c（FeSO4·7H2O）＝0.0667mol·L-1]：称取硫酸亚铁（FeSO4·7H2O，化学纯）18.52g，溶解于600ml～800ml去离子水中，加浓硫酸（化学纯）15ml，搅拌均匀，定容至1000ml，于棕色瓶中保存。
土壤中微生物实验报告
一、实验目的1. 了解土壤中微生物的种类和数量；2. 掌握土壤微生物的分离和纯化方法；3. 熟悉微生物的形态和生理生化特性；4. 培养无菌操作和实验记录能力。
二、实验原理土壤是微生物生活的良好环境，其中含有大量微生物，包括细菌、放线菌、真菌、藻类、原生动物、噬菌体、病毒和线虫等。
微生物在土壤中发挥着重要作用，如土壤肥力的维持、植物生长的促进、有机物的分解等。
本实验通过分离和纯化土壤微生物，观察其形态和生理生化特性，进一步了解土壤微生物的种类和功能。
三、实验材料与仪器1. 实验材料：土壤样品、牛肉膏蛋白胨培养基、葡萄糖、酵母提取物、琼脂、无菌水、无菌平板、无菌移液器、显微镜、培养箱等。
2. 实验仪器：天平、酒精灯、高压蒸汽灭菌器、恒温培养箱、无菌操作台等。
四、实验方法1. 土壤样品的采集：选取有代表性的土壤样品，注意样品的均匀性和代表性。
2. 土壤微生物的分离和纯化：a. 制备牛肉膏蛋白胨培养基，高压蒸汽灭菌后备用；b. 将土壤样品与无菌水按1:10的比例混合，充分搅拌；c. 将混合液进行系列稀释，取适量稀释液涂布于牛肉膏蛋白胨平板上；d. 将平板倒置放入恒温培养箱中培养，观察菌落生长情况；e. 挑取单个菌落进行纯化，重复以上步骤，直至获得纯菌株。
3. 微生物的形态观察：a. 将纯菌株接种于牛肉膏蛋白胨培养基，培养后进行显微镜观察；b. 观察菌体的形态、大小、排列方式等特征。
4. 微生物的生理生化特性测定：a. 对纯菌株进行革兰氏染色，观察菌体的染色特性；b. 进行糖发酵试验，观察菌株对葡萄糖、乳糖、麦芽糖等糖类的分解能力；c. 进行氧化酶试验，观察菌株的氧化酶活性。
五、实验结果与分析1. 土壤样品的微生物数量：通过平板计数法，估算土壤样品中的微生物数量。
2. 微生物的分离和纯化：成功分离和纯化出多种微生物，如细菌、放线菌、真菌等。
3. 微生物的形态观察：观察到的菌体形态、大小、排列方式等特征与文献报道相符。
熏蒸培养法测量土壤微生物生物量碳
熏蒸培养法测量土壤微生物生物量碳一、实验原理：用氯仿杀死土壤中的微生物，并接种新的土壤，培养微生物使之释放二氧化碳。
测量一定时间内熏蒸土壤与为熏蒸土壤中微生物释放的二氧化碳量来估算土壤中微生物的生物量碳。
二、实验步骤：1.氯仿去乙醇。
用锡箔纸包裹分液漏斗（纵向留出一条细缝，以便观察分层情况）。
向分液漏斗中加入氯仿和氯仿一半体积的蒸馏水，盖上分液漏斗的盖子，上下摇晃数次。
静置片刻，放出分液漏斗下层的氯仿。
2.抽气。
用细筛筛选250g土壤于500mL烧杯中，并将烧杯至于干燥器中。
干燥器内放入盛有少量蒸馏水的小烧杯。
另取100mL干燥的烧杯一个，向其中加入50mL去乙醇氯仿和干燥的玻璃珠（防止氯仿爆沸，且要铺满整个烧杯底部）后，将之放入干燥器中。
在盖子内侧贴上一条蒸馏水润湿的滤纸条。
盖好干燥器的盖子，用真空泵抽气至氯仿沸腾，关闭干燥器的活塞。
把干燥器放入遮光恒温（25℃）的条件下培养24小时。
3.排出氯仿。
取出干燥器内的氯仿和湿润的滤纸条，在次抽气三分钟后打开盖子散发土壤中的氯仿，如此连续反复三次，就能排出土壤中的氯仿。
4.另筛取250g土壤，不熏蒸。
分别在熏蒸土壤和未熏蒸土壤中加入1g新鲜土壤且充分混匀。
调节土壤水分至罪大含水量的55％。
将两份土壤各放入一个未放干燥剂的干燥器中。
在干燥器中放入盛有20mL蒸馏水的烧杯盛有100mL 1mol/L NaOH溶液，盖好盖子，培养十天。
5.滴定。
取出NaOH溶液，取25mL于250mL容量瓶中，定溶。
从容量瓶中取出20mL于150mL三角瓶中，用1mol/L的HCl溶液调节Ph至10。
再用0.05mol/L的HCl溶液滴定至Ph为8.3，继续滴定至Ph为3.7，记录Ph从8.3到3.7所消耗HCl溶液的体积。
.三、计算K YX B -=土壤微生物生物量碳其中，X为熏蒸土壤释放的CO2量，Y为未熏蒸土壤释放的CO2量，由滴定所消耗的HCl溶液的体积计算得出。
土壤微生物生物量的测定方法
土壤微生物生物量的测定方法1.直接计数法：直接计数法是通过显微镜观察土壤样品中微生物数量来测定土壤微生物生物量。
常用的直接计数法包括滴定法、薄层计数法和电镜计数法。
滴定法是将土壤样品溶解后，通过滴定法来计数微生物细胞的数量。
滴定法主要包括用荧光假单胞菌（Pseudomonas fluorescens）作为参比菌，将细菌与土壤样品混合，经一系列稀释后进行滴定。
通过观察滴定液中菌落的数量，可以推算出原始土壤样品中微生物的生物量。
薄层计数法是将土壤样品制成薄层，然后在显微镜下进行计数。
这种方法可以直接观察微生物的形态特征，通过计算单位面积上微生物的数量来估算微生物生物量。
电镜计数法是利用电镜的高分辨率特性，观察土壤样品中微生物的形态和数量。
这种方法可以观察到更小的微生物和微生物的形态细节，但是操作复杂，成本较高。
2.间接测定法：间接测定法通过测定土壤中微生物活性代谢产物来估算微生物生物量。
常用的间接测定法包括ATP测定法、细胞膜脂肪酸测定法和氮素代谢产物测定法等。
ATP测定法是通过测定土壤中的三磷酸腺苷(ATP)含量来估算微生物生物量。
微生物的ATP含量与其生物量有一定的关系，因此可以通过测定ATP含量来间接估算土壤微生物生物量。
细胞膜脂肪酸测定法是通过测定土壤样品中微生物细胞膜中的脂肪酸含量来估算微生物生物量。
微生物细胞膜中的脂肪酸种类和含量与微生物群落的组成和数量有关，因此可以通过测定脂肪酸的含量来间接估算微生物生物量。
氮素代谢产物测定法是通过测定土壤样品中微生物氮素代谢产物的含量来估算微生物生物量。
微生物的氮素代谢活动与其生物量有关，因此可以通过测定氮素代谢产物的含量来间接估算微生物生物量。
3.分子生物学方法：分子生物学方法是利用PCR技术对土壤样品中微生物的DNA或RNA进行扩增和测定来估算微生物生物量。
常用的分子生物学方法包括引物扩增法、荧光原位杂交法和高通量测序法等。
引物扩增法是通过设计特定的引物对微生物的DNA或RNA进行扩增，并通过PCR反应的产物数量来估算微生物生物量。
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北师大版选修1生物技术实践《测定土壤中微生物的数量》
说课稿
一、引言
本文档是针对北师大版选修1生物技术实践课程中的实验
项目《测定土壤中微生物的数量》的说课稿。
通过这个实验，学生可以学习到如何利用生物技术手段来测定土壤中微生物的数量。
本实验旨在培养学生的实验操作能力和科学思维能力，同时提供实践环境，让学生亲身体验科学研究的过程。
二、教学目标
1.能够理解微生物在土壤中的重要性，以及测定土壤
中微生物数量的意义；
2.掌握使用平板计数法和浑浊度法测定土壤中微生物
数量的方法和步骤；
3.能够正确进行实验操作，获取准确的实验数据；
4.培养学生的科学观察力和数据处理能力。
三、教学重点和难点
3.1 教学重点
•掌握使用平板计数法测定土壤中微生物数量的方法；
•掌握使用浑浊度法测定土壤中微生物数量的方法；
•培养学生对实验数据的准确记录和处理能力。
3.2 教学难点
•理解微生物在土壤中的重要性和测定其数量的意义；
•掌握测定微生物数量的实验步骤和技巧；
•学会对实验数据进行分析和处理。
四、教学准备
1.实验室和实验所需设备的准备：包括平板计数法所
需的琼脂培养基和平板计数器，以及浑浊度法所需的浊度
计等；
2.实验材料的准备：土壤样品、稀释液等；
3.准备好相关教学PPT和实验操作指导书。
五、教学过程
5.1 实验背景介绍
在开展实验前，首先向学生介绍微生物在土壤中的重要性，以及测定土壤中微生物数量的意义。
微生物是土壤中一个不可或缺的组成部分，对土壤质量和生态环境有着重要影响。
通过测定土壤中微生物的数量，可以评估土壤的肥力、健康状况和生物活性。
5.2 实验步骤与方法
5.2.1 平板计数法
1.准备工作：准备好琼脂培养基、稀释液和土壤样品；
2.稀释土壤样品：将土壤样品与稀释液按一定比例混
合，获得一系列不同浓度的土壤悬浮液；
3.接种涂平板：将不同浓度的土壤悬浮液分别接种在
琼脂培养基平板上，使用铲子均匀涂布；
4.培养菌落：将接种后的琼脂培养基平板分别密封培
养，在适合的温度下孵育一段时间；
5.统计菌落数量：根据培养结果，统计并记录每个平
板上的菌落数量。
5.2.2 浑浊度法
1.准备工作：准备好浊度计、土壤样品和浑浊度法所
需的稀释液；
2.稀释土壤样品：将土壤样品与稀释液按一定比例混
合，获得一系列不同浓度的土壤悬浮液；
3.测定浑浊度：使用浊度计分别测量不同浓度的土壤
悬浮液的浑浊度；
4.统计浑浊度数据：根据浑浊度测量结果，统计并记
录每个浓度的土壤悬浮液的浑浊度数值。
5.3 实验数据记录与分析
学生需要在实验过程中准确记录实验数据，并按要求绘制
相关图表，比如菌落计数结果图、浑浊度测量结果图等。
学生应通过数据分析，对实验结果进行合理的解释，并得出结论。
5.4 实验总结与讨论
在实验结束后，学生需要对实验结果进行总结与讨论，包
括对实验过程中出现的问题进行分析与反思。
同时，学生还可以进一步探讨土壤微生物数量的影响因素及其对土壤和植物生长的意义。
六、教学评价
在本次实验中，学生的评价主要包括实验操作能力、数据
处理和分析能力以及实验总结能力。
教师可以通过观察学生的实验操作、检查学生的实验记录和图表制作情况，以及听取学生对实验结果的解释和总结等方式进行评价。
七、拓展与延伸
教师可以引导学生进一步了解其他测定土壤微生物数量的
方法，如酶活性法、PCR法等。
同时，还可以扩展相关的知识，介绍微生物的分类、功能以及在环境保护、农业和医药等领域的应用。
八、参考资料
1.高明华. 生物技术实践与综合教程[M]. 华东师范大
学出版社, 2017.
2.黄燕芳, 姚秀泉, 于海霞. 选修1生物技术实践[M].
河南人民出版社, 2018.
以上就是《测定土壤中微生物的数量》实验的说课稿，希
望通过这个实验能够培养学生的实验操作能力和科学思维能力，提高学生对微生物在土壤中的重要性的认识，并锻炼学生对实验数据的准确记录和处理能力，为培养学生的科学素养打下坚实的基础。