【实验】测定土壤中微生物的数量共24页文档
【实验】测定土壤中微生物的数量
[三]微生物的培养与观察
不同菌落的鉴定指标：菌落的形状、大小、 隆起程度、颜色等。
（二）统计菌落数目
每克样品中的菌株数致 C：某一稀释度下平板上生长的平均菌落数 V：涂布平板时所用的稀释液的体积（ml) M：稀释倍数
为了测定微生物的数量，接种时应采用_稀__释__涂__布__平__板___ 法，某同学在4个培养基上分别接种稀释倍数为106的土 壤样液0.1 mL，培养后菌落数分别为180、155、176、 129个，则原土壤样液中上述微生物的含量为 __1_.6_×__1_0_9_个__/m__L_______，测定的活菌数比实际活菌数 ____低____(填“低”“高”“基本一致”)。
（1）从土壤中分离出能够分解尿素的细菌； （2）统计每克土壤样品中究竟含有多少这样的细菌。
尿素分子的立体结构
（一）筛选菌株
美国微生物学科布鲁克1966 年发现耐热细菌，从水生耐 热细菌Taq得到耐高温的Taq DNA聚合酶。
一、研究思路
(一)筛选菌种
1 实例：耐高温的DNA聚合酶
PCR技术：要求使用耐高温（930C） 的DNA聚合酶。
稀释度（倍）
106
107
108
平板
1 2 3 12 3 1 2 3
平板菌落数（个） 432 421 445 78 67 74 9 6 8
涂布时应当在酒精灯火焰旁 附近操作，为了保证结果准确，应选 择上述稀释度为 107 倍的平板菌落数作为统计结果，原因是 计数平板的菌落数 ，计算出样品中每毫升乳酸菌数为7.3×。109 量范围为30~300
（1）样品稀释：先将样品稀释10倍，可用无菌移液管吸取25mL 酸奶样品加入盛有 225 mL无菌水的三角瓶中，使样品与水充分混 匀。然后进行系列稀释操作，得到稀释至106、107、108倍的样品。 （2）培养与统计：吸取不同稀释度的样品各1mL，分别置于不同
土壤微生物生物量的测定(滴定法)
1. 土壤微生物生物量的测定(滴定法)一、实验目的和内容土壤微生物生物量是指土壤中体积小于5～10μm3活的微生物总量，是土壤有机质中最活跃的和最易变化的部分。
耕地表层土壤中，土壤微生物量碳（Bc）一般占土壤有机碳总量的3％左右，其变化可直接或间接地反映土壤耕作制度和微生物肥力的变化，并可以反映土壤污染的程度。
近30年来，国外许多学者对土壤微生物生物量的测定方法进行了比较系统的研究，但由于土壤微生物的多样性和复杂性，还没有发现一种简单、快速、准确、适应性广的方法。
目前广泛应用的方法包括：氯仿熏蒸培养法（FI）、氯仿熏蒸浸提法（FE）、基质诱导呼吸法（SIR）、精氨酸诱导氨化法和三磷酸腺苷（A TP）法。
氯仿熏蒸浸提法（FE）的原理是：土壤经氯仿熏蒸处理，微生物被杀死，细胞破裂后，细胞内容物释放到土壤中，导致土壤中的可提取碳、氨基酸、氮、磷和硫等大幅度增加。
通过测定浸提液中全碳的含量可以计算土壤微生物生物量碳。
二、实验材料和用具仪器：培养箱；真空干燥器；真空泵；往复式振荡机（速率200次每min）；1L广口玻璃瓶；定量滤纸；紫外分光光度计；LNK-872型消煮炉（江苏省宜兴市科教仪器研究所）试剂：1.无乙醇氯仿：市售的氯仿都含有乙醇（作为稳定剂），使用前必须除去乙醇。
方法为：量取500ml氯仿于1000ml分液漏斗中，加入50ml硫酸溶液[ρ(H2SO4)=5%]，充分摇匀，弃除下层硫酸溶液，如此进行3次。
再加入50ml去离子水，同上摇匀，弃去上部的水分，如此进行5次。
将下层的氯仿转移存放在棕色瓶中，并加入约20g无水K2CO3，在冰箱的冷藏室中保存备用。
2.硫酸钾溶液[c(K2SO4)=0.5mol·L-1]称取硫酸钾（K2SO4，化学纯）87.10g，先溶于300ml去离子水中，加热，转移溶液至容器中，再加少量去离子水溶解余下的部分，转移溶液至同一容器中，如此反复多次。
最后定容至1L；3.重铬酸钾[c(1/6 K2Cr2O7)=0.4000mol·L-1]：称取经130℃烘干2～3h的重铬酸钾（K2Cr2O7，分析纯）19.622g，溶于1000ml去离子水中；4.邻啡罗啉亚铁指示剂：称取邻啡罗啉（C12H8N2H2O，分析纯）1.49g，溶于含有0.70gFeSO4·7H2O的100ml 去离子水中，密闭保存于棕色瓶中；5.硫酸亚铁溶液[c（FeSO4·7H2O）＝0.0667mol·L-1]：称取硫酸亚铁（FeSO4·7H2O，化学纯）18.52g，溶解于600ml～800ml去离子水中，加浓硫酸（化学纯）15ml，搅拌均匀，定容至1000ml，于棕色瓶中保存。
土壤中微生物培养实验报告
微生物培养实验报告
微生物培养实验是利用微生物及其细胞生长、繁殖和生活规律的实验
方法，用于研究微生物的形态、结构和特性，以及评价微生物对环境
因子的适应性和变革性。
本实验通过对土壤中的微生物进行培养，目的是研究微生物在不同物
质及条件的作用，以及测定其细胞增殖率和形态特征。
本次实验的培
养基为细菌培养液，用于土壤中微生物的培养，细菌培养液添加一定
的氮、磷和其它元素，以及含有大量碳、水分的糖为源，微生物可以
从中摄取所需的营养物质，使微生物培养成功。
实验中，我们首先采集土壤样本，并用70%乙醇完成灭菌，把样品装
入细菌培养液中，将培养瓶置于培养箱中，进行恒温振荡摇床控温培养；每天对培养液中的细菌表型进行观察，以观察细胞形态、形状及
计算增殖率。
进行实验足够的时间之后，我们用光学显微镜对培养液
中的细菌表型进行观察，直观观察细菌的形态和结构变化。
经过本实验后，我们发现土壤中微生物的形态特征与正常的细菌株相似，且增殖率也在一定的区间内，通过本次实验我们对土壤中的微生
物种类有了更深入的了解。
总之，通过本次微生物培养实验，受到很大帮助，我们深刻地感觉到，研究微生物种类及其变化规律是非常重要和有益的，有助于我们理解
生态系统中各组分的作用以及变化。
土壤中微生物实验报告
一、实验目的1. 了解土壤中微生物的种类和数量；2. 掌握土壤微生物的分离和纯化方法；3. 熟悉微生物的形态和生理生化特性；4. 培养无菌操作和实验记录能力。
二、实验原理土壤是微生物生活的良好环境，其中含有大量微生物，包括细菌、放线菌、真菌、藻类、原生动物、噬菌体、病毒和线虫等。
微生物在土壤中发挥着重要作用，如土壤肥力的维持、植物生长的促进、有机物的分解等。
本实验通过分离和纯化土壤微生物，观察其形态和生理生化特性，进一步了解土壤微生物的种类和功能。
三、实验材料与仪器1. 实验材料：土壤样品、牛肉膏蛋白胨培养基、葡萄糖、酵母提取物、琼脂、无菌水、无菌平板、无菌移液器、显微镜、培养箱等。
2. 实验仪器：天平、酒精灯、高压蒸汽灭菌器、恒温培养箱、无菌操作台等。
四、实验方法1. 土壤样品的采集：选取有代表性的土壤样品，注意样品的均匀性和代表性。
2. 土壤微生物的分离和纯化：a. 制备牛肉膏蛋白胨培养基，高压蒸汽灭菌后备用；b. 将土壤样品与无菌水按1:10的比例混合，充分搅拌；c. 将混合液进行系列稀释，取适量稀释液涂布于牛肉膏蛋白胨平板上；d. 将平板倒置放入恒温培养箱中培养，观察菌落生长情况；e. 挑取单个菌落进行纯化，重复以上步骤，直至获得纯菌株。
3. 微生物的形态观察：a. 将纯菌株接种于牛肉膏蛋白胨培养基，培养后进行显微镜观察；b. 观察菌体的形态、大小、排列方式等特征。
4. 微生物的生理生化特性测定：a. 对纯菌株进行革兰氏染色，观察菌体的染色特性；b. 进行糖发酵试验，观察菌株对葡萄糖、乳糖、麦芽糖等糖类的分解能力；c. 进行氧化酶试验，观察菌株的氧化酶活性。
五、实验结果与分析1. 土壤样品的微生物数量：通过平板计数法，估算土壤样品中的微生物数量。
2. 微生物的分离和纯化：成功分离和纯化出多种微生物，如细菌、放线菌、真菌等。
3. 微生物的形态观察：观察到的菌体形态、大小、排列方式等特征与文献报道相符。
土壤微生物数量测定方法
土壤微生物数量测定方法土壤微生物是指生活在土壤中的微小生物，包括细菌、真菌、放线菌、古菌等。
土壤微生物在土壤的生物地球化学循环、有机质分解、养分转换和植物健康等过程中起着重要的作用。
因此，对土壤微生物数量的准确测定具有重要意义。
本文将介绍一些常用的土壤微生物数量测定方法。
1.瓶培法：将适量的土壤样品与适量的培养基混合，在37°C下培养约24小时，然后通过平板计数法或最凼稀释法进行测定。
2.膜过滤法：将土壤提取液通过特定孔径的膜过滤器滤过，然后将膜放置在培养基上进行细菌的生长，最后进行计数。
3.间接法：通过测定土壤样品的可培养细菌指标，如氧化还原酶、脱氢酶等的活性，从而推算出土壤中的细菌数量。
4.分子生物学方法：通过PCR扩增土壤DNA中的细菌基因，如16SrRNA基因，再通过测定PCR产物进行细菌数量的测定。
1.直接镜检法：直接在显微镜下观察土壤样品中的真菌，通过计数来估算真菌的数量。
2.平板计数法：将土壤样品均匀撒在培养基上，通过培养方法使真菌生长形成菌落，最后进行计数。
3.膜过滤法：与细菌数量测定相似，将土壤提取液通过膜过滤器滤过，然后将膜放置在适当的培养基上进行真菌的生长，最后进行计数。
4.分子生物学方法：通过PCR扩增土壤DNA中的真菌基因，如18SrRNA基因，再通过测定PCR产物进行真菌数量的测定。
1.直接镜检法：直接在显微镜下观察土壤样品中的放线菌，通过计数来估算放线菌的数量。
2.平板计数法：将土壤样品均匀撒在培养基上，通过培养方法使放线菌生长形成菌落，最后进行计数。
3.膜过滤法：与细菌和真菌数量测定类似，将土壤提取液通过膜过滤器滤过，然后将膜放置在适当的培养基上进行放线菌的生长，最后进行计数。
4.分子生物学方法：通过PCR扩增土壤DNA中的放线菌基因，如16SrRNA基因，再通过测定PCR产物进行放线菌数量的测定。
通过上述方法测定土壤中微生物的数量，可以了解土壤微生物对土壤生态系统功能的影响，并为土壤质量评价和科学合理利用提供依据。
土壤微生物生物量的测定方法
土壤微生物生物量的测定方法1.直接计数法：直接计数法是通过显微镜观察土壤样品中微生物数量来测定土壤微生物生物量。
常用的直接计数法包括滴定法、薄层计数法和电镜计数法。
滴定法是将土壤样品溶解后，通过滴定法来计数微生物细胞的数量。
滴定法主要包括用荧光假单胞菌（Pseudomonas fluorescens）作为参比菌，将细菌与土壤样品混合，经一系列稀释后进行滴定。
通过观察滴定液中菌落的数量，可以推算出原始土壤样品中微生物的生物量。
薄层计数法是将土壤样品制成薄层，然后在显微镜下进行计数。
这种方法可以直接观察微生物的形态特征，通过计算单位面积上微生物的数量来估算微生物生物量。
电镜计数法是利用电镜的高分辨率特性，观察土壤样品中微生物的形态和数量。
这种方法可以观察到更小的微生物和微生物的形态细节，但是操作复杂，成本较高。
2.间接测定法：间接测定法通过测定土壤中微生物活性代谢产物来估算微生物生物量。
常用的间接测定法包括ATP测定法、细胞膜脂肪酸测定法和氮素代谢产物测定法等。
ATP测定法是通过测定土壤中的三磷酸腺苷(ATP)含量来估算微生物生物量。
微生物的ATP含量与其生物量有一定的关系，因此可以通过测定ATP含量来间接估算土壤微生物生物量。
细胞膜脂肪酸测定法是通过测定土壤样品中微生物细胞膜中的脂肪酸含量来估算微生物生物量。
微生物细胞膜中的脂肪酸种类和含量与微生物群落的组成和数量有关，因此可以通过测定脂肪酸的含量来间接估算微生物生物量。
氮素代谢产物测定法是通过测定土壤样品中微生物氮素代谢产物的含量来估算微生物生物量。
微生物的氮素代谢活动与其生物量有关，因此可以通过测定氮素代谢产物的含量来间接估算微生物生物量。
3.分子生物学方法：分子生物学方法是利用PCR技术对土壤样品中微生物的DNA或RNA进行扩增和测定来估算微生物生物量。
常用的分子生物学方法包括引物扩增法、荧光原位杂交法和高通量测序法等。
引物扩增法是通过设计特定的引物对微生物的DNA或RNA进行扩增，并通过PCR反应的产物数量来估算微生物生物量。
【实验】测定土壤中微生物的数量
实例：在做该实验时，A同学从对应的106倍稀释 的培养基中筛选出大约150个菌落，但是其他同 学在同样的稀释度下只选择出大约50个菌落。分 析其原因。
原因：⑴土样不同；⑵培养基污染(混入了其他的 含氮物质)；（3）杂菌污染
设置对照
作用：排除任何其他非测试因素的干扰，证明确 实是所测试的条件引起相应的结果。
尿素是一种重要的农业氮肥。尿素不能直接被农 作物吸收。
2、细菌为什么能够分解尿素？
土壤中的细菌分解尿素是因为它们能合成脲酶
脲酶 CO(NH2ห้องสมุดไป่ตู้ + H2O
NH3 + CO2
常见的分解尿素的微生物
芽孢杆菌、小球菌、假单胞杆菌、克氏杆菌、 棒状杆菌、梭状芽孢杆菌，某些真菌和放线菌 也能分解尿素。
土壤中各类微生物的数量（单位：株/kg） 是不同的。例如在干旱土壤中的上层样本中： 好氧及兼性厌氧细菌数约为2 185万，放线菌 数约为477万，霉菌数约为23.1万。
菌种鉴定——鉴别培养基
在以尿素为唯一氮源的培养基中加入 酚红指示剂。
大肠杆菌在伊 红美蓝琼脂 (EMB)上典型 特征
大肠杆菌呈黑色中心 ,有或无金属光泽
本课题知识小结:
课题2.2 土壤中分解尿素的细菌的
分离与计数
①从土壤中分离出能够分解尿素的细菌 ②统计每克土壤样品中究竟含有多少这样的细菌
如何筛选出能够分解尿素的微生物呢？ 如何统计样品中分解尿素的细菌数目？
二.实验的具体操作
参考教材本节内容，小组讨论出具体的实 验方案
三.结果分析与评价
1. 同一稀释倍数的三个重复的菌落数相 差较大，怎么办？
土壤微生物检测实验报告
土壤微生物检测实验报告实验目的：1.了解土壤微生物检测的原理和方法。
2.掌握土壤微生物检测的实验操作步骤。
3.探究不同土壤样品中微生物数量的差异。
实验原理：土壤微生物检测主要是通过分离、培养和计数来估计土壤微生物的数量。
主要方法包括稀释平板法、滴定法、过滤膜法等。
其中，稀释平板法是应用最广泛的方法之一，它是将土壤样品稀释后，在琼脂胶平板上培养并计数微生物菌落形成的数量来得到微生物数量。
实验材料和仪器：1.土壤样品；2.琼脂胶平板；3.微量移液器；4.灭菌的乙醇；5.灭菌的酒精灯；6.培养箱；7.可移动反应仪；8.移液管；实验步骤：1.准备土壤样品，从不同的地点取样，混合均匀后，取一定量的土壤样品（如10g）。
2.加入一定量的蒸馏水（如90ml），混合均匀。
3.取1ml土壤液体，加入到10ml的蒸馏水中稀释，得到1:10的稀释液。
4.取1ml稀释液，加入到9ml的蒸馏水中稀释，得到1:100的稀释液。
5.重复第4步，得到1:1000的稀释液。
6.从1:10、1:100和1:1000的稀释液中，每个稀释液中各取1ml，分别塗于琼脂胶平板上。
7.将琼脂胶平板在培养箱内培养24-48小时。
8.取出琼脂胶平板，观察并计数每个平板上的微生物菌落。
由于每个样品含有不同数量的微生物，可能需要在某些平板上进行稀释，以避免过于密集菌落的计数误差。
9.计算样品中的微生物数量。
实验结果：通过实验，我们发现来自不同土壤样品的微生物数量是有明显差异的。
同一种土壤类型，在不同的采样地点也会有不同的微生物数量。
例如，采自沿海地区和山区的土壤样品，发现前者的微生物数量要高于后者。
这可能与气候、植被和土壤性质等因素有关。
实验结论：通过本次实验，我们进一步了解了土壤微生物检测的原理和方法，掌握了土壤微生物检测的实验操作步骤，并且发现了不同土壤样品中微生物数量的差异。
本实验提醒我们要在保护环境的前提下，科学利用土地资源，研究土壤微生物的分布、多样性和生态功能，推动生态环境的改善和可持续土地利用。