苏云金杆菌几丁质酶新基因的筛选和全长基因的扩增
抗稻瘟病几丁质酶产生菌的筛选及产酶条件的研究
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图 ４ 温 度 对 菌 株 产 酶 活 力 的 影 响
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第２ １卷 第 １ 期
２１ ０ １年 ３月
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抗 稻 瘟 病 几 丁 质 酶 产 生 菌 的 筛 选 及 产 酶 条 件 的研 究
参照 中国科学 院上海植 物生理研 究所和 上海市 植 物 生 理 学 会 主 编 的 《 代 植 物 生 理 学 实 验 指 现
南》 ［ ．
１ ３ 稻 瘟 病 病 原 茵 细 胞 壁 悬 浮 物 制 备及 菌 株 筛选 ．
质 的降解 产物 一几丁寡糖 能诱导启 动植 物的 防御 系 统， 刺激植 物生 长发育Ｌ ． 丁质酶 产生菌是 一类 能 ２几 ］ 够 利用几 丁质为碳 源 而 生长 的 微生 物 ， 其共 同特征
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微生物杀虫剂苏云金芽孢杆菌(Bt)的研究现状及应用
微生物杀虫剂苏云金芽孢杆菌（Bt）的研究现状及应用作者：高成华来源：《农业工程技术·温室园艺》2015年第06期苏云金杆菌又称苏云金芽胞杆菌，简称Bt。
苏云金杆菌的发现，为人们利用微生物消灭植物病虫害提供了美好的前景。
化学杀虫剂的长期使用对生态环境产生了严重的破坏，而害虫种群的抗药性也日益提高，因此生物杀虫剂因为其“绿色环保”的特点日益引起人们的广泛关注。
现在，人们已经用发酵罐大规模地生产苏云金杆菌并制成粉剂或可湿剂、液剂，应用于农业，对100多种害虫有不同的致病和毒杀作用。
苏云金芽孢杆菌是目前世界上产量最大、应用最广的生物杀虫剂。
本文简要介绍作为生物杀虫剂的Bt的发展历史、研究现状和应用情况。
研究历史[1]1901年，日本学者石渡繁胤（Ishiwata Shigetane）从虫尸体液中分离出苏云金杆菌猝倒变种（Bacillus.thuringiensis var.sott）成为苏云金杆菌研究的起点[2]。
1911年，Berliner发现一杆菌，并详细描述了该菌的形态和培养特征，定名为苏云金杆菌（Bacil-lus.thuringiensis），指明苏云金杆菌含伴孢晶体（Paraspora crystl）[3]。
1938年，苏云金杆菌商品化，用于防治地中海粉螟。
20世纪50年代许多国家进行了商业性生产。
1953年，Hannay第一次发现苏云金杆菌的杀虫活性与伴孢晶体有关，并和Fitz-James于1955年证实，伴孢晶体是一种蛋白质。
1981年，Schnept和Whiteley首次将HD21菌株伴孢晶体的基因克隆到大肠杆菌中，并得到表达。
20世纪60年代用血清学技术进行Bt的鉴定和分类。
自二次世界大战后，苏云金芽孢杆菌被广泛使用，至今已有60多年[4]。
由于其推广力度以及人们的农药使用意识的传统观念限制，目前生物农药仅占全部农药市场份额很少一部分，从此可看出，苏云金芽孢杆菌杀虫剂任然具有较大的发展潜力。
从崖城农田土壤中发现一种具有杀死植物害虫功能的细菌——苏云金解析
从崖城农田土壤中发现一种具有杀死植物害虫功能的细菌——苏云金芽孢杆菌崖城高级中学高一（1）班龚彩秀指导老师：翟鸿武一次偶然的机会让我在一本生物杂志上接触到苏云金芽孢杆菌（Bacillus Thuringiensis ,Bt）当时的我觉得很神奇——它能杀死农作物害虫。
人类从刀耕火种以来，一直备受害虫的威胁，给人类的生活造成了多种危害，其中虫害是威胁农作物高产的主要原因之一，全世界每年因此损失约数千亿美元，每年世界上因虫害而造成的农产品损失估计为13％。
在我国，水稻每年因虫害减产10％以上，小麦减产近20％，棉花产量损失达20％～30％。
为了控制农林病虫害，人们不得不大量使用化学农药，但长期大剂量地使用化学合成的农药，致使多种害虫对化学杀虫剂产生了一定的抗性，因此不但不能有效地控制害虫，结果还面临着三大难题无法解决，①环境污染，残毒上升，人畜均遭毒害；②用药浓度不断提高，防治费用不断增加，不得不无休止地研制新农药；③杀伤天敌，破坏了生态平衡，引起害虫再猖獗和次虫害虫大爆发，导致自然界中恶性循环。
苏云金芽孢杆菌由于能在生长代谢过程中产生对多种农林害虫具有特异性杀虫毒力的生物活性蛋白，并能由此生产相应的微生物杀虫剂来用于害虫生物防治而受到国内外的广泛重视。
广泛的研究与应用实践证明，与化学农药等其他类型的杀虫剂相比，Bt杀虫剂具有杀虫特异性强，对人、畜及非目标昆虫无毒副作用；安全性能好，不污染环境，由于具有多种类型的杀虫晶体蛋白，昆虫难以产生抗性或产生抗性较缓慢；具较低的生产成本等优点。
目前已推广使用的表达Bt毒素基因的转基因植物都有较为显著的抗虫性能，在大田栽培中无需或只需喷洒少许化学杀虫剂，从而大大减少了对环境的污染。
因此苏云金芽孢杆菌作为新型生物农药解决了一个长期以来让无数劳动农民头痛的问题。
而对生物有着浓厚兴趣的我对它有种相识恨晚的感觉，而这次的“科技创新”活动让我坚定了对它认识的决心，在老师和同学们的帮助下，我开始了我的创新实验。
从土壤里筛选产纤维素酶细菌的步骤
从土壤中分离产几丁质酶的真菌作者：王春学号:11101680摘要：几丁质是自然界中储量仅次于纤维素的生物多聚体,它广泛存在于真菌、硅藻、节肢动物和原生动物等生物体中,是绝大多数真菌细胞壁的结构物质,同时还是昆虫中肠围食膜的主要成分[1].几丁质酶(Chitinase,EC3.4.1.14)[2]可催化水解几丁质的β21,4糖苷键生成N2乙酰2D2氨基葡萄糖(NAG),它在植物病虫害,尤其是对真菌病的防治方面,以及在几丁质废物的转化和利用等方面都具有重要作用,其研究受到人们的广泛重视.通过几丁质作为碳源,从土壤中筛选产几丁质酶菌株.1 材料与方法1.1 培养基1.1.1 平板培养基 (1)细菌几丁质培养基(分离用):蛋白胨10g,K2HPO40.7g,MgSO40.5g,KH2PO40.3g,胶体几丁质5.0g,琼脂15～20g,蒸馏水1L,pH值为7.2.(2)纯几丁质培养基:胶体几丁质 5.0g,KNO31.0g,NaCl0.5g,K2HPO40.5g,MgSO40.5g,FeSO40.01g,琼脂20g,蒸馏水1L,pH值为7.2.1.1.2 摇瓶培养基 (1)种子培养基(LB培养基):蛋白胨10g,酵母膏5g,NaCl10g,蒸馏水1L,pH值为7.0.(2)发酵培养基:用细菌几丁质培养基(分离用),但不加琼脂1.2 菌株的分离1.2.1 菌株初步分离从生产几丁质的工厂排污沟附近土壤采集土样,经过烘干及风化干燥,置于60目分样筛过筛,备用.称取1g土样放入加有9mL无菌水的离心管,分别稀释制成10-1,10-2,10-3,10-4,10-5,10-6不同稀释倍数的土壤溶液.从10-3,10-4,10-5,10-6不同稀度倍数的4管土壤稀释液中各吸取0.1mL,接种在纯几丁质培养基和细菌几丁质培养基的平板上,用涂布棒涂布均匀,在30℃下培养72h.1.2.2 菌种的二次筛选从第1次稀释涂布的平板中挑取可以产生透明圈的菌落,再一次通过稀释涂布的方法,将其接种于纯几丁质平板和细菌几丁质平板上,培养72h,以取得纯菌落平板.从第2次筛选的纯菌平板上选取水解圈直径与菌落直径比最大的菌种,将其接种于50mL的LB种子培养基上,12h后以2%的接种量接于100mL的细菌几丁质发酵培养基中,在30℃下进行扩大培养.1.3 菌种的鉴定1.3.1 细菌染色体DNA提取从新培养产几个质酶活性高的革兰氏阴性细菌平板上,挑取一环菌落至加有500μLTE缓冲液的1.5mL微量离心管中,混匀后沸水浴1.5min,迅速低温离心(12000r・min-1)10min,取上层清液分装后,置4℃下保存备用.1.3.2 16SrDNA引物根据16SrDNA的结构,应用B2/B3做引物,该引物扩增片段包含V8和V9两个高变区,扩增产物大小为1050bp(basepair,碱基对)左右.这两个引物序列为B2:5’2ACGGGCGGTGTGTAC23’;B3:5’2CCTACGGGAGGCAGCAG23’.1.3.3 聚合酶链反应(PCR)检测 PCR反应体系为20μL,二次蒸馏水12.6μL,10倍扩增缓冲液2.0μL,25mmol・L-1Mg2+1.6μL,各2.5mmol・L-1的脱氧核苷三磷酸(dNTP)0.4μL,20μmol・L-1引物各1.0μL,DNA模板1.0μL,5GU・L-1Taq酶0.4μL.PCR循环:94℃预变性5min,94℃变性60s,50℃退火60s,72℃延伸90s,循环30次,并在72℃后延伸15min.1.3.4 扩增产物的电泳分析用1倍的TAE缓冲液配制质量分数为1%琼脂糖凝胶.取PCR 扩增产物10μL,加2μL溴酚蓝指示剂,混匀后加样,于100V下电泳1.5h,紫外灯下观察电泳结果.1.3.5 序列测定与分析将观察到的PCR产物切胶,用胶回收试剂盒回收后,连接到pMD182T上,送北京奥科生物公司进行测序.然后,将测序结果通过GeneBank进行BLAST序列比对,得出结果参考文献[1] BROGLIEKE.Chitinaseandplantprotection[J].RevPlantPathol,1993,2:4112421.[2] 李力,黄胜元,关雄.产几丁质酶的苏云金杆菌菌株筛选及酶合成条件研究[J].中国病毒学,2000,15(51):94297.[3] CHANGYu2cheng,YANGChiyea,LIChin,etal.IdentificationofBacillussp,Escherichiacoli,Salmonellasp,StaphylococcusspandVibriospwith16SribosomalDNA2basedoligonucleotidearrayhybridization[J].Internation2 alJournalofFoodMicrobiology,2006,107:1312137.[4] 张龙翔,张庭芳,李令媛.生化实验技术[M].北京:高教出版社,1997:1112116.[5] MOOREER,KRUGERAS,HAUBENL,etal.16SrRNAgenesequenceanalysesandinter2andintragenericre2lationshipsofXanthomonasspeciesandStenotrophomonasmaltophilia[J].FEMSMicrobiolLett,1997,151(2):1452 153.[6] MIYAJIT,OTTAY,SHIBATAT,etal.PurificationandcharacterizationofextracellularalkalineserineproteasefromStenotrophomonasmaltophiliastrainS21[J].LettApplMicrobiol,2005,41(3):2532257.[7] MADHA VAPNK,BAIJUTV,SANDHYAC,etal.ProcessoptimizationforantifungalchitinaseproductionbyTrichodermaharzianum[J].ProcessBiochem,2004,39:158321590.[8] NAWANINN,KAPADNISBP.Optimizationofchitinaseproductionusingstatisticsbasedexperimentaldesigns[J].ProcessBiochem,2005,40:6512660。
苏云金杆菌cry1aa基因的表达和定点突变
ＡＢＳＴＲＡＣＴＩｎｓｅｃｔｓｗｏｕｌｄｄｅｖｅｌｏｐｒｅｓｉｓｔａｎｃｅｗｈｉｃｈｃｏｒｒｅｌａｔｅｄｗｉｔｈｔｈｅＢ口ｃｆ盯淞历“ｒｆ愕ｆＰ珊括ｔｏｘｉｎｓ，ａＩｌｄｄｅｃｒｅａｓｉｎｇｏｆｐＨｏｆｉｔｓｍｉｄｇｕｔｊｕｉｃｅｔｏｔｈｅｍｅｃｈａｎｉｓｍｉｓｕｎｋｎｏｗｎ．ＡｍｏｄｉｆｉｅｄＳＤＳ—ａｌｋａｌｉｎｅｍｅｔｈｏｄｗａｓｕｓｅｄｔｏｅｘｔｒａｃｔｐｌａｓｍｉｄｓｏｆＢｔ４．０７１８ｓｔｒａｉｎ，ａｎｄＰＣＲａｎａｌｙｓｉｓｄｅｍｏｎｓｔｒａｔｅｄｔｈａｔＰ３ｐｌａｓｍｉｄｃｏｎｔａｉｎｃ，），１Ａａｇｅｎｅ．Ｂｙａｎａｌｙｚｅｔｈｅｃｏｎｓｅｎｓｕｓｒｅｇｉｏｎｏｆ１３ｋｉｎｄｓｏｆｃＷｌＡａｇｅｎｅｗｉｔｈｍｅＮａｔｉｏｎａｌＣｅｎｔｅｒｆｏｒＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙｉｎｆｂｎｎａｔｉｏｎ’ｓＢＬＡＳＴＷＷＷｓｅｒｖｅｒ’ｐｒｉｍｅｒｓＨ０１ａｎｄＨ０２ｗｅｒｅｄｅｓｉｇｎｅｄｔｏａｍｐｌｉ６ｅｄｆＷｌＡａｇｅｎｅｆｒｏｍＰ３ｐｌａｓｍｉｄ，ｔｈｅｎｔｈｅＰＣＲＤｍｄｕｃｔｓｓｕｂｃｌｏｎｅｄｔｏｏｂｔａｉｎｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔＭＤＡａｓｔｒａｉｎ．Ｔｈｅ３．５一ｋｂＢ日历ＨＩａｎｄＳ口ｆＩｉｎｓｅｒｔｏｆｐＭＤｌ８一ＴｗａｓｉｎｓｅｒｔｅｄｉｎｔｏｔｈｅｐＥＴ３０ａｖｅｃｔｏｒ，ｔｈｅｎｔｒａｎｓｆｏⅡｎｅｄＥ∞，ｆｓｔｒａｉｎＢＬ２ｌ（ＤＥ３）ｔｏｇｉＶｉｎｇＥＴＡａｓｔｒａｉｎ，ａｎｄａ１４１－ｋＤｆｕｓｉｏｎｐｒｏｔｅｉｎｗａｓｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｅｄａｓｉｎｃｌｕｓｉｏｎｂｏｄｙｂｙｉｎｄｕｃｅｄｗｉｔｈＩＰＴＧＳｉｔｅ—ｄｉｒｅｃｔｅｄｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓｗａｓｐｅｒｆｏｍｅｄｉｎａｔ、Ｖｏ－ｓｔ印ＰＣＲｗｉｔｈｔｈｒｅｅｐｒｉｍｅｒｓ．Ｔｈｅｆｒａｇｍｅｎｔｓｐｒｏｄｕｃｅｄｉｎｍｅｆｉｒｓｔｓｔｅｐｗｅｒｅｕｓｅｄａｓｔｈｅ“ｂｉｇｐｒｉｍｅｒ＂ｉｎｔｈｅｓｅｃｏｎｄＰＣＲｔｏａｒｎｐｌｉｆｉｅｄｔｈｅｌ０４８－ｂｐｆｒａｇｍｅｎｔｓａｎｄｓｕｂｃｌｏｎｅｄ．Ａ２２４－ｂｐｍｕｔａｔｅｄｆ｝ａｇｍｅｎｔｏｂｔａｉｎｅｄｂｙｄｉｇｅＳｔｉｎｇｐＭＤＭＸｗｉｔｈ砌ＰＩａｎｄ丑ｆｓＨＩＩａｎｄｓｕｂｓｔｉｔｕｔｅｄｍｅｆｈｇｍｅｎｔｉｎｐＭＤＡａａｔｔｈｅｓａｒｎｅｐｏｓｉｔｉｏｎｔｏｇｅｔｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｐｌａｓｍｉｄｐＭＤＭａ．ｐＭＤＭａｄｉｇｅｓｔｅｄｗｉｔｈＢ日ｍＨＩａｎｄＳｂ，Ｉ，ｔｈｅ３．５－ｋｂｍｕｔａｔｅｄ矗ａｇｍｅｎｔｗａｓｉｎｓｅｒｔｅｄｉｎｔｏｔｈｅｐＥＴ３０ａＶｅｃｔｏｒｔｏｏｂｔａｉｎｔｈｅｍｕｔａｇｅｎｉｃｓｔｒａｉｎＥＴＭａＣ８１２ＡａｎｄＣ８１４Ａ．ＳＤＳ—ＰＡＧＥｓｈｏｗｅｄｔｈａｔｔｈｅｍｕｔａｍｃ，），１ＡａｇｅｎｅｗａｓａｌｓｏｏＶｅｒｅｘｐｒｅｓｓｅｄ．Ｉｎｃｌｕｓｉｏｎｂｏｄｉｅｓ舶ｍＥＴＡａｓｔｒａｊｎａ１１ｄｍｕｔａｔｅｄＥＴＭａｓｔｒａｉｎｄｉｓｓｏｌＶｅｄｕｎｄｅｒｄｉｆｆｅｒｅｎｔｐＨｏｒｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓｏｆ２一Ｍ［ｅｒｃａｐｔｏｅｍａｎｏｌｓ锄ｅｐＨｏｒｉｎｄｉＶｉｄｕａｌｌｙ．ＳＤＳ－ＰＡＧＥｓｈｏｗｅｄｔ１１ａｔ，ｕｎｄｅｒｔｈｅｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｏｆ２－Ｍｅｒｃａｍｏｅｔｈａｎｏｌ，ｉｎｃｌｕｓｉｏｎｂｏｄｉｅｓ疔ｏｍｍｕｔａｔｅｄＥＴＭａｓｔｒａｉｎｗｅｒｅｍｏｒｅｅａｓｙｔｏｄｉｓｓｏｌｖｅ，ａｎｄｃｏｕｌｄｄｉｓｓｏｌｖｅｂｅｔｔｅｒｉｎ１０ｗｐＨｏｒｌｏｗｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｏｆ２一ＭｅｒｃａｐｔｏｅｔｈａｎｏｌｔｈａＪｌｉｎｃｌｕｓｉｏｎｂｏｄｉｅｓｆ＿ｒｏｍＥＴＡａｓｔｒａｉｎ．ＩｔｄｅｍｏｎｓｔｒａｔｅｄｔｈａｔｔｈｅｒｎｕｔａｇｅｎｅｓｉｓｏｆＣ８ｌ２ＡａｎｄＣ８１４Ａｃｏｕｌｄｓｉｇｎａｌｌｙｃｈａｎｇｅｔｈｅｄｉｓｓｏｌｖａｂｉｌｉｔｙｏｆｊｎｃｌｕｓｊｏｎｂｏｄｉｅｓ．ＴｈｅｓｔｕｄｙｐｒＤＶｉｄｅａＶａｌｕａｂｌｅｏｐｔｉｏｎｆｌｏｒｒｅｓｉｓｔａｎｃｅｍａｎａｇｅｍｅｎｔ，ａｎｄｏｎｓｕｃｈａｂａｓｅ，出ｅｒｏｌｅｏｆｄｉｓｕｌｐｈｉｄｅｉｎｔｈｅｐｒｏｔｏｘｉｎｓｔａｂｉＩｉｔｙａ１１ｄｔｏｘｉｃｉｔｙｃａｎｂｅｍｒ出ｅｒａｃｈｉｅｖｅｄＫｌｅｙｗｏｒｄｓ：８口ｃ“，￡岱ｆ是“ｒ豫ｉｌ拿挖ｓ扭，ｃ，ｙｌＡａｇｅｎｅ，ｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，Ｓｉｔｅ—ｄｉｒｅｃｔｅｄｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ，ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ前言１．苏云金芽孢杆菌１．１苏云金芽孢杆菌（Ｂｔ）概论苏云金芽孢杆菌（肋ｃｆ，，“ｓ胁“ｒｆ娼招瑚如，简称Ｂｔ）是一种在自然界广泛分布的革兰氏阳性细菌，按照《伯杰氏细菌鉴定手册》第九版可将其归属为第二类第十八群芽孢杆菌属（口口ｃ讲珊）中的一种【ｌＪ。
嗜热真菌热稳定几丁质酶基因的克隆、表达与分子改造
嗜热真菌热稳定几丁质酶基因的克隆、表达与分子改造几丁质(chitin)是由N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖通过β-1,4-糖苷键连接起来的直链多聚物,是最丰富的天然高分子化合物之一,广泛分布于动物、植物及微生物体内。
几丁质酶可以水解几丁质产生几丁寡糖和N-乙酰氨基葡萄糖,且广泛存在于自然界的生物中。
近年来,随着几丁质酶的降解产物在医药、食品、农业、环保、造纸、化工等领域的应用越来越深入,几丁质酶作为制备几丁寡糖的重要工具越来越受到人们的重视。
国内外已筛选出多种几丁质酶生产菌,并将其分离提纯。
但是,直接由真菌发酵产生几丁质酶在工业化生产中受多方面因素的限制,随着分子生物学技术的发展,人们已不满足于从原始产生生物中提取和利用几丁质酶,而是希望得到编码这种酶的基因并转入宿主进行高效低成本的表达。
因此利用重组微生物实现几丁质酶的工业化生产、提高几丁质酶活性和产量,是目前较为理想的方法。
嗜热子囊菌原变种(Thermoascus aurantiacus var. aurantiacus)是一种广泛分布的,生长上限温度较高的嗜热真菌,能够在45℃～50℃的高温下很好的繁殖生长。
本研究根据真菌几丁质酶的同源保守序列设计兼并引物,通过RT-PCR 和Tail-PCR等技术首次从嗜热子囊菌原变种中分离得到了一种几丁质酶基因Chit-TAA,全长DNA为1826bp,在包含一个由1191个核苷酸构成的开放阅读框,编码396个氨基酸,该基因cDNA在GenBank中的登录号为GU338053。
序列比对分析表明,该蛋白属于糖苷水解酶18家族几丁质酶,其中两个序列S-GGW和DG-D-DWE非常保守。
这两段保守氨基酸序列与糖基水解酶(glycosylhydrolases)18家族催化活性有关。
其中不变氨基酸残基Asp和Glu为几丁质酶的催化活性位点。
利用基因重组的方法构建酵母分泌型表达载体,并转化到毕赤酵母中。
于MD/MM平板上筛选His+Mut+表型的酵母转化子,经过PCR检测及G418抗性筛选得到多拷贝整合子,进行甲醇诱导培养。
微生物杀虫剂苏云金芽孢杆菌(Bt)的研究现状及应用
《微生物杀虫剂苏云金芽孢杆菌（Bt）的研究现状及应用》苏云金杆菌又称苏云金芽胞杆菌，简称Bt。
苏云金杆菌的发现，为人们利用微生物消灭植物病虫害提供了美好的前景。
化学杀虫剂的长期使用对生态环境产生了严重的破坏，而害虫种群的抗药性也日益提高，因此生物杀虫剂因为其“绿色环保”的特点日益引起人们的广泛关注。
现在，人们已经用发酵罐大规模地生产苏云金杆菌并制成粉剂或可湿剂、液剂，应用于农业，对100多种害虫有不同的致病和毒杀作用。
苏云金芽孢杆菌是目前世界上产量最大、应用最广的生物杀虫剂。
本文简要介绍作为生物杀虫剂的Bt的发展历史、研究现状和应用情况。
研究历史[1]1901年，日本学者石渡繁胤（Ishiwata Shigetane）从虫尸体液中分离出苏云金杆菌猝倒变种（Bacillus.thuringiensis var.sott）成为苏云金杆菌研究的起点[2]。
1911年，Berliner发现一杆菌，并详细描述了该菌的形态和培养特征，定名为苏云金杆菌（Bacil-lus.thuringiensis），指明苏云金杆菌含伴孢晶体（Paraspora crystl）[3]。
1938年，苏云金杆菌商品化，用于防治地中海粉螟。
20世纪50年代许多国家进行了商业性生产。
1953年，Hannay第一次发现苏云金杆菌的杀虫活性与伴孢晶体有关，并和Fitz-James于1955年证实，伴孢晶体是一种蛋白质。
1981年，Schnept和Whiteley首次将HD21菌株伴孢晶体的基因克隆到大肠杆菌中，并得到表达。
20世纪60年代用血清学技术进行Bt的鉴定和分类。
自二次世界大战后，苏云金芽孢杆菌被广泛使用，至今已有60多年[4]。
由于其推广力度以及人们的农药使用意识的传统观念限制，目前生物农药仅占全部农药市场份额很少一部分，从此可看出，苏云金芽孢杆菌杀虫剂任然具有较大的发展潜力。
简介Bt是一种革兰氏阳性芽孢杆菌，为昆虫病原细菌，其菌体为短杆状、有鞭毛，一般单生或形成短链。
苏云金芽孢杆菌生物杀虫剂概述
苏云金芽孢杆菌生物杀虫剂概述[摘要]苏云金杆菌是一种在自然界中广泛分布的好气芽孢杆菌，它能产生特异性的杀虫结晶蛋白, 对鳞翅目、双翅目、鞘翅目、膜翅目、螨类和线虫等许多有害的昆虫有毒杀作用。
[关键词]苏云金芽孢杆菌历史杀虫机理苏云金杆菌(Bacillus.thuringiensis.简称Bt)从自然界分离出来的昆虫病原细菌，革兰氏染色阳性，在芽孢形成期间能产生伴胞晶体。
它是一类发展时间最早的生物杀虫剂，在害虫的综合防治中已经成为一种占主导地位的生物农药。
自商品化以来，Bt 产品就以其高效安全、对目标害虫的特异性、生物降解无残毒等优点而倍受亲睐，并逐渐成为研究最深入、应用最广泛的生物杀虫剂。
然而Bt 目前仍然不能完全替代化学农药，因为它在具有绿色、环保等优势的同时也具有一些重大缺陷，主要是产品的稳定性较差、残效期短、杀虫速度慢等，另外货架寿命短也是限制其发展的重要因素。
为此人们不断地对它进行改造。
一、苏云金芽孢杆菌的研究历史1901年，日本学者石渡繁胤(S.Ishiwata)从虫尸体液中分离出一所谓的猝倒细菌(Sott bacteria)。
按现在的分类系统，该菌就是现在苏云金杆菌猝倒变种(Bacillus.thuringiensis var.sott)。
石渡繁胤的发现，成为苏云金杆菌研究的起点[6]。
1911年，Berliner分离出一种杆菌，他详细描述了该菌的形态和培养特征，并定名为苏云金杆菌(Bacillus.thuringiensis)。
他指明苏云金杆菌含伴孢晶体(Paraspora crystl)，但不曾说明伴孢晶体有杀虫的作用。
Berliner所定名的苏云金杆菌按现在的分类系统，应该是苏云金杆菌苏云金变种(Bacillus thuringiensis var. thuringiensis)。
1938年，第一个苏云金杆菌商品制剂Sporeine，在法国问世，并用于防治地中海粉螟。
1953年，Hannay第一次发现苏云金杆菌的杀虫活性与伴孢晶体有关。
苏云金芽孢杆菌
本文对农业上研究最多、用量最大的两类微生物杀虫剂苏云金芽孢杆菌（Bacillus thuringiensis, Bt）和昆虫杆状病毒（baculovirus）进行了综述，分别论述了它们的杀虫优势、杀虫的分子机理、目前的研究状况，并对它们的基因工程技术改良路线以及在农业上的应用，提出了一些建议。
由病虫害引起的农作物的减产减收已成为制约农业生产进一步发展的限制因素，全球每年农作物因虫害造成的损失约占总产量的13％，而目前对农作物害虫的防治主要依赖于化学农药。
完全依赖化学杀虫剂存在许多弊端，其中最主要的问题是，一种化学物质的广泛使用会使害虫的后代产生选择性进化优势，从而对该化学物质产生抗性。
例如，世界各地的家蝇品系对杀灭它们的每种杀虫剂都产生了抗性。
第二个问题是，有的杀虫剂影响非靶目标品种，产生灾难性后果，某些益虫被无意中消灭，导致其次要害虫急剧增长。
第三问题是在于环境的耐受性和许多杀虫剂的毒性，不仅造成了严重的环境污染，而且给人类的健康带来巨大的威胁。
上述不利因素促使人们急欲寻求控制害虫的替代方案。
在对农业害虫进行的长期防治实践中，人们逐渐认识到必须采取综合治理的措施，才能有效的控制害虫的危害。
基因工程技术的发展，为防治农林害虫提供了一种有效、减污的新技术手段，微生物农药也因此在世界范围内受到广泛重视。
微生物农药是指非化学合成、具有杀虫防病作用的微生物制剂，如微生物杀虫剂、杀菌剂、农用抗生素，等等。
这一类微生物包括杀虫防病的细菌、真菌和病毒。
杀虫微生物是指其代谢产物或微生物本身对宿主昆虫有致死效应或致病的微生物类群，通常也称为昆虫病原微生物。
目前已知的杀虫防病微生物主要有芽孢杆菌科、假单胞菌科、肠杆菌科、链球菌科和杆状病毒科等类群。
尽管不同杀虫微生物引起昆虫致病的症状不尽相同，但杀虫微生物对害虫的作用方式主要是通过产生特异性的杀虫毒素来破坏害虫的代谢平衡，或者是通过营养体在虫体内的繁殖复制而引起昆虫死亡和发生流行病。
苏云金杆菌增效细菌研究进展
苏云金杆菌增效细菌研究进展杨庆仙(河北政法职业学院园林系,河北石家庄050061) 摘 要:苏云金芽孢杆菌Bt制剂是当前应用最广、最有效的一种细菌杀虫剂,因其对鳞翅目、鞘翅目、双翅目、膜翅目、同翅目等昆虫以及动植物线虫、蜱螨等节肢动物都显示杀虫活性而倍受人们关注。
综述对苏云金杆菌具有增效作用的细菌的研究进展。
目前,环境微生物中Bt增效细菌主要有苏云金杆菌、蜡状芽孢杆菌,其发酵上清液或芽孢不同程度地提高了苏云金杆菌防治害虫的效果。
关键词:苏云金杆菌;增效;细菌;研究进展中图分类号:S482.2+92 文献标识码:A 文章编号:1001-0009(2008)01-0055-04 苏云金杆菌(Bacillus thuringiensis,简称Bt)是目前产量最大、使用最广的生物杀虫剂。
它的主要活性成分是一种或数种杀虫晶体蛋白(insecticidal crystal pro2 teins,ICPs),又称δ2内毒素[1],对鳞翅目、鞘翅目、双翅目、膜翅目、同翅目等昆虫,以及动植物线虫、蜱螨等节肢动物都有特异性的毒杀活性,而对非目标生物安全,因此,Bt杀虫剂具有专一、高效和对人畜安全等优点。
目前苏云金杆菌商品制剂已达100多种,是世界上应用最为广泛、用量最大、效果最好的微生物杀虫剂,因而倍受人们关注。
但是,商品Bt制剂在生产防治中也显示出某些局限性,如速效性差、对高龄幼虫不敏感、田间迟效期短以及重组工程菌株遗传性状不稳定等都已成为作者简介:杨庆仙(19672),女,河北安新人,副教授,主要从事病虫害防治教学工作。
收稿日期:2007-07-05影响Bt进一步成功推广使用的制约因素。
因此,为了提高Bt制剂的杀虫效果,对其增效途径的研究已成为世界性的研究热点,主要包括:筛选增效菌株[2];利用化学添加剂[328]、植物它感素[9212]、几丁质酶[13]作为增效物质;昆虫病原微生物间的互作增效[14218]等。
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苏云金杆菌几丁质酶新基因的筛选和全长基因的扩增林毅1,关雄23(1.华侨大学生物工程与技术系,福建泉州362011;2.福建农林大学生物农药研究中心,福建福州350002)摘要:以煮沸冻融法制备PCR 扩增模板,利用苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis ,Bt )几丁质酶基因特异引物进行15个Bt 血清变种的扩增分析,获得9个几丁质酶全长基因扩增产物。
经克隆和序列测定,从Bt serovar.entomocidus H D109、Bt serovar.canadensis H D224、Bt serovar.alesti H D16和Bt serovar.toumano ffi H D201等4个菌株中分离了几丁质酶新基因。
关键词:几丁质酶基因;苏云金芽孢杆菌;筛选;血清变种中图分类号:S482.292 文献标识码:A 文章编号:1004-311X (2004)03-0001-02Screening and Full -length Amplification of N ovel ChitinaseG enes from 15Serovars of Bacillus thuringiensisLI N Y i 1,G UAN X iong 23(1.Departm ent o f Biotechn ology ,H uaqia o University ,Quanzh ou 362011;2.Biocide R esearch C enter ,Fujian Agriculture and F orestry University ,Fuzh ou 350002,P 1R 1C hina )Abstract :Using boiling and thawing the thalli to prepare PCR tem plate ,the distribution of chitinase genes am ong the 15serovars of Bacillusthuringiensis were detected by specific primers.And 4novel full -length chitinase genes were is olated from Bt serovar .entomocidus H D109,Bt serovar.canadensis H D224,Bt serovar.alesti H D16,and Bt serovar.toumano ffi H D201.K ey w ords :chitinase gene ;Bacillus thuringiensis ;screening ;serovar 收稿日期:2003-10-18;修回日期:2003-12-27基金项目:国家“863”项目(2002A A245011);福建省重大项目(2002N004,2001Z 026);福建省青年科技人才创新项目(2003J024)作者简介:林毅(1976-),男,博士,讲师,从事资源生物及其基因工程研究,E -mail :lyhxm @ ;联系作者:关雄(1957-),男,博士,教授,从事生物农药研究,E -mail :gx @ 。
几丁质广泛存在于甲壳纲动物、软体动物、昆虫、真菌、高等植物以及海藻、动物关节、蹄、足等处,自然界每年生成的几丁质约有100亿吨,是地球上除纤维素外数量最多、除蛋白质外含氮量最高的天然有机化合物[1,2]。
近年来,随着几丁低聚糖、几丁寡糖等抗菌作用、抗肿瘤和增强机体免疫功能研究的深入,几丁质酶(EC31211114)作为制备几丁质低聚糖的重要工具而受到相当的关注[2]。
同时,几丁质酶在作物病虫害防治方面的作用也陆续见诸报道[3]。
苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis ,Bt )是一种重要的环境微生物,广泛应用于农业和卫生害虫的防治,其作用因子主要是杀虫晶体蛋白[4]。
几丁质酶往往作为添加剂,以缓解害虫对Bt 杀虫晶体蛋白的抗性[5]。
近年来,苏云金芽孢杆菌自身的几丁质酶及其编码基因受到格外重视[6-9]。
本文通过苏云金芽孢杆菌不同血清变种的几丁质酶全长基因的扩增分析,旨在快速获得Bt 几丁质酶新基因,促进Bt的研究和应用。
图1 苏云金芽孢杆菌全长几丁质酶基因的扩增产物Lane M:λDNA d ouble digested by EcoR Ⅰand Hind Ⅲ;Lane 1:Bt serovar.entomocidus H D109;Lane 2:Bt serovar.pakistani H D395;Lane 3:Bt serovar.dakota H D511;Lane 4:Bt serovar.kenyae H D560;Lane 5:Bt serovar.canadensis H D224;Lane 6:Bt serovar.alesti H D16;Lane 7:Bt serovar.israelensis ONR60A ;Lane 8:Bt serovar.galleriae H D1611 材料和方法1.1 菌株和载体15个苏云金芽孢杆菌血清变种的菌株来自美国芽孢杆菌遗传保藏中心(Bacillus G enetic S tock Center ,BG SC ),分别是:Bt serovar.finitimus H D19,B t serovar.alesti H D16,Bt serovar.kur staki 2,Bt serovar.kenyae H D560,Bt serovar.galleriae H D161,Bt serovar.canadensis H D224,Bt serovar.entomocidus H D109、Bt serovar.aizawai H D11,Bt serovar.tolworthi H D537,Bt serovar.toumano ffi H D201,Bt serovar.thompsoni H D542,Bt serovar.pak 2istani H D395,Bt serovar.israelensis ONR60A ,Bt serovar.dakotaH D511,Bt serovar.indiana H D521。
大肠杆菌DH5α菌株来自福建农林大学植物病毒研究所。
1.2 引物根据NC BI 中收录的Bt 几丁质酶基因序列设计合成一对特异引物chi -A 和chi -B ,扩增产物为全长的几丁质酶基因,大小为2.0～2.1kb 。
序列如下:chi -A :5’-ATGG T C ATG AGG T CT C -3’chi -B :5’-CT ATTT CG CT AATG ACG-3’1.3 载体和试剂克隆载体pM D18-T (约2.7kb )购自大连宝生物。
T aq DNA 聚合酶和DNA 限制性内切酶为大连宝生物产品,PCR 产物回收试剂盒Ultraclean T M 15DNA Purification K it 购自上海博亚,其它试剂均为分析纯。
1.4 模板的制备采用煮沸冻融裂解法制备PCR 模板。
取50μL 对数生长期Bt 菌液,离心收集菌体,加入100μL 超纯水,涡旋使菌体均匀扩散,于沸水中煮5min ,-20℃冻3min ,沸水中再煮5min ,-20℃再冻3min ,12000r/min 离心3min ,所得上清即可作为PCR 模板。
1.5 PCR 扩增和分析以制备的菌体裂解液上清为模板,在T 3Therm ocycler (Biometra R )基因扩增仪上进行PCR 扩增,反应程序为:94℃变性60s ,55～50℃退火60s (每3个循环降1℃,50℃时20个循环),72℃延伸2min 。
PCR 产物经1%琼脂糖凝胶电泳,E B 染色后经凝胶成像系统成像。
1.6 大肠杆菌感受态细胞的简易制备收集对数生长期的大肠杆菌DH5α菌体,加入预冷的0.1M CaCl 2溶液悬浮,离心20s ,加入适量预冷的0.1M CaCl 2溶液悬浮,4℃保存备用,10h 后7d 内可用。
1.7 克隆和序列测定PCR 产物回收纯化后,与pM D18-T 载体连接,转化 E.coli DH5α,酶切鉴定后进行序列测定,先各测定一个反应。
序列分析利用NC BI 上的BLAST 软件进行T ranslated query vs.pro 2tein database (blastx )分析。
2 结果表1 15个苏云金芽孢杆菌血清变种的几丁质酶基因检测结果Bt serovar S train Presence of chitinase gene indiana HD521-finitimus HD19-entomocidus HD109+pakistani HD395+kenyae HD560+tolworthi HD537-canadensis HD224+dakota HD511-aizawa HD11+alesti HD16+thompsoniHD542-israelensis ONR60A+kur staki 2+toumano ffi HD201+galleriaeHD161-对15个血清变种的苏云金芽孢杆菌菌体裂解液进行的PCR扩增结果表明,9个亚种产生约2.0kb 大小的几丁质酶基因扩增产物(图1示部分扩增产物)。
其中kenyae 、israelensis 、aiza 2wa 、kur staki 和pakistani 5个血清变种的几丁质酶基因已经报导过,Bt serovar.entomocidus H D109,Bt serovar.canadensis H D224、Bt serovar.alesti H D16和Bt serovar.toumano ffi H D201等4个血清变种的几丁质酶基因为新报导,对其扩增产物进行克隆和序列测定的结果表明它们均为新的几丁质酶基因(图2)。
检测结果(表1)表明Bt 血清变种中蕴涵着丰富的几丁质酶基因。
图2 Bt serovar.toumano ffi HD201克隆子部分序列的blastx 结果3 讨论近年来,苏云金芽孢杆菌的几丁质酶及其对杀虫活性作用受到格外重视。
在产几丁质酶Bt 菌株的筛选中,人们普遍采用了透明圈法。
以白色不溶的胶体几丁质为唯一的碳氮源制成分离平板,以平板上菌落周围透明圈的大小判断菌株对几丁质的水解能力及几丁质酶的活性高低。
但是Wiwat 等[5]在150株中也仅筛选到14株,李力[10]从64株Bt 中仅筛选出4株,而进行几丁质酶基因的PCR 鉴定时,23个样品中有19个具有几丁质酶基因。