葡萄茎尖培养脱毒与快繁技术研究
葡萄茎尖超低温保存及超低温疗法脱毒研究
葡萄茎尖超低温保存及超低温疗法脱毒研究葡萄(Vitis)是世界范围内最具经济价值的果树之一,城市化、工业化、土壤盐碱化和沙漠化等原因导致葡萄许多野生种与栽培种濒临灭绝。
建立高效、简易的种质资源长期保存技术能有效地保护种质资源的多样性。
超低温保存是目前植物种质资源长期保存最为理想的方法。
病毒病是制约葡萄与葡萄酒产业发展的主要因素之一。
栽培无毒苗是生产上防治病毒病害最为有效的措施。
生产无毒苗是栽培无毒苗的核心技术。
近年来建立的超低温疗法,为葡萄无毒苗生产提供了一种新技术。
本研究以葡萄(Vitis)试管苗为试材,建立了茎尖小滴-玻璃化法超低温保存体系,为葡萄种植资源超低温库的建立提供了高效、广谱的超低温保存方法。
建立了超低温疗法,有效的脱除了葡萄卷叶相关病毒-3(Grapevineleafroll-associated virus 3,GLRaV-3),为葡萄脱毒苗的生产提供了核心技术。
同时,试管指示植物法、微样直接RT-PCR、免疫组织化学定位病毒检测为脱毒和病毒检疫提供技术支撑。
本研究主要结果如下:1.通过优化影响葡萄茎尖超低温保存的关键因素,建立了简易、高效、光谱的葡萄茎尖小滴-玻璃化法超低温保存体系。
含5-6片叶原基的腋芽(尺寸约1.0 mm)取自8周苗龄欧洲葡萄‘赤霞珠’(Vitis vinifera‘Cabernet Sauvignon’)试管苗,在预培养基(0.3 M蔗糖+0.16μM还原型谷胱甘肽+0.14μM L-抗坏血酸,pH=5.7)上暗培养3 d。
加载液(2 M甘油+0.4 M蔗糖)常温处理20 min,再用1/2浓度植物玻璃化溶液(PVS2)和全浓度PVS2冰上分别处理30 min和25-50 min,然后将茎尖放置于铝箔条上的PVS2小滴(2.5μL)中,直接投入液氮中保存。
保存后的携带茎尖的铝箔条迅速转移到卸载液(1.2 M蔗糖)中常温解冻20 min,培养于含0.6 M蔗糖的恢复培养基中恢复24 h。
葡萄的组培快繁技术
葡萄的组织培养技术湖北第二师范学院1.葡萄外植体的采集和消毒1.1外植体是从植物体上分离下来的用于离体培养的材料。
在该组织培养中，用的培养材料是茎尖，通常切块在0.5厘米左右，如果为培养无病毒苗而采用的培养材料通常仅取茎尖的分生组织部分，其长度在0.1毫米以下。
葡萄脱毒过程中，外植体的大小与脱毒率高低成相关性。
所以选取外植体的大小适宜在葡萄脱毒过程中应要掌握好.葡萄在茎尖培养中，光的效果通常要比暗培养好。
一般多采用光培养的方式，试管苗培养适宜的温度是25+/-2度1.2防止外植体带菌1.2.1选择好外植体采集时期和采集部位1.2.1.1外植体采集以春秋为宜；1.2.1.2优先选择地上部分作为外植体；1.2.1.3阴雨天勿采，晴天下午采集；1.2.1.4采前喷杀虫剂、杀菌剂或套塑料袋。
1.2.2室内或无菌条件下进行预培养。
1.2.3外植体严格灭菌灭菌效果实验多次灭菌和交替灭菌1.3培养材料的消毒1.3.1先将材料用流水冲洗干净，最后一遍用蒸馏水冲洗，再用无菌纱布或吸水将材料上的水分吸干，并用消毒刀片切成小块。
1.3.2在无菌坏境中将材料放入70％洒精中浸泡30－60秒。
1.3.3再将材料移入漂白粉的饱和液或0.01％升汞水消毒10分钟。
1.3.4取出后用无菌水冲洗三、四次。
1.4制备外植体将已消毒的材料，用无菌刀、剪、镊等，在无菌的环境下，剥去芽的鳞片、嫩枝的外皮和种皮胚乳等，叶片则不需剥皮。
“然后切成0.2－0.5厘米厚的小片，这就是外植体。
2.培养基的成分及制备2.1培养基的成分组织培养过程中，外植体生长所需的营养和生长因子，主要是由培养基供应的。
因此，培养基中应包括植物生长必需的16种营养元素和某些生理活性物质。
所有这些物质，可概括为5大类：2.1.1无机营养物培养基的各种盐类中均含有氮、磷、钾、钙、镁、硫、铁、硼、锰、铜、锌、钼、氯。
无机氮可以两种形式供应，即硝态氮和铵态氮。
有些培养基以硝态氮为主，另一些以铵态氮为主，多数二者兼而有之。
常见植物的脱毒与快速繁殖技术
《常见植物的脱毒与快速繁殖技术》一、常见植物培养方式：1、草莓脱毒苗的培养方式主要有微茎尖培养和花粉培养两种。
2、马铃薯病毒鉴定的方法主要有指示植物法、症状鉴定法。
3、通过组织培养获得微型薯的技术关键有两个：单茎节扩大繁殖；微型薯诱导。
4、在葡萄栽培架式，棚架是应用最广泛的类型。
5、草莓脱毒苗的培养方式主要有微茎尖培养和花粉培养两种。
6、菊花生根能力比较强，有两种方法：嫩茎试管生根；无根嫩茎的扦插。
7、菊花的继代增殖有多种技术，多数是诱导愈伤组织产生丛生芽而获得大量的试管苗。
8、百合经茎尖培养脱毒、鉴定合格后，可通过两种继代增殖方式：①经愈伤组织增殖；②诱导分化不定芽。
二、提问：对马铃薯脱毒苗的培养大致分几个阶段？各阶段是怎样操作的？马铃薯茎尖培养脱毒程序：①取材；②消毒；③接种；④培养基；⑤病毒鉴定。
影响脱毒效果的因素：外植体大小；茎尖所处部位；病毒种类及复合感染。
简述苹果花粉培养的过程。
①选取适期花蕾；②花蕾预处理和消毒；③诱导胚状体形成；④诱导生根；⑤移栽。
苹果的栽培管理过程中应注意哪几个问题？①育苗技术；②土壤改良；③施肥方法；④灌溉时期；⑤整形和修剪技术。
草莓无毒苗的繁殖程序分哪几步？草莓无毒苗的繁殖程序可以发为五步，即鉴定出无毒苗、原种种苗培养、原种种苗繁殖、良种种苗繁殖和生产用苗繁殖。
蝴蝶兰怎样用花梗组织培养方法繁殖?蝴蝶兰脱毒：花梗侧芽的消毒与培养——茎尖培养——原球茎诱导——继代培养——原球茎增殖——生根炼苗。
通过原球茎增殖的方法，可大大提高繁殖速度，实现蝴蝶兰生产的工厂化育苗。
香石竹的茎尖脱毒培养操作技术。
香石竹的茎尖脱毒培养操作技术：一般结合热处理：将带毒植株进行盆栽，放入人工控制箱内，采用38-40℃高温处理6-8周，再切1mm 大小的茎尖培养。
说明甘薯脱毒快繁技术的工艺流程。
（1）脱毒：优良品种母株选择；材料消毒；茎尖剥离；茎尖培养；茎尖苗的初级快繁；脱毒鉴定。
（2）快繁：脱毒苗的快繁；原原种的繁育；原种的繁育；种薯的繁育三、甘薯脱毒试管苗栽培管理注意哪些问题？培育壮苗；适当炼苗；精心移栽；控制湿、温、光等条件；适时定植；严防病虫害。
脱毒苗培养
2、指示植物鉴定法：利用特定的易于感染某些 病毒的指示植物的特征进行病毒鉴定。
指示植物
CMV病毒感染的植株叶片
3、抗血清鉴定法：利用抗原和抗体的特异性反应原理 进行病毒鉴定。用已知病毒的抗血清（antiserum）鉴 定未知病毒。
近年来又在此基础上发展出酶联免疫法（Enzyme Linked Immunosorbent Assay，ELISA），方法是将抗 原固定在支持物上，加入待检血清，然后加入酶（过氧 化物酶或碱性磷酸酶）标记的抗体，使待检血清与对应 抗原的特异性抗体结合，最后用分光光度计进行诊断。
二、脱毒方法：
（一）茎尖分生组织培养脱毒： 1. 脱毒原理：病毒在植物体内的分布不均匀，越靠近
顶端区域，带毒越少，顶端分生组织（0.2-0.5 mm）不带 病毒或含病毒量极低。因此，分离分生组织细胞进行培 养，可以获得无病毒种苗。
2. 茎尖分生组织培养脱毒的基本程序：
一般包括培养基选择和制备、带脱毒材料的表面、灭 菌、茎尖分生组织分离、接种和培养、诱导芽分化和小 植株增殖、诱导生根、驯化移栽等环节。 茎尖分生组织的分离需要在超净工作台上借助体视显 微镜进行。茎尖放在培养皿内进行解剖，一只手用镊子 固定，另一手用解剖针将叶片和叶原基层层剥掉，当露 出半圆形顶端分生组织时，将分生组织切下，接种与培 养基上。
（四）其他脱毒方法：
1. 花器官培养脱毒：由植物的花器官培养脱分化形成愈伤 组织，然后再分化不定芽，可以获得无毒苗。如草莓花 药培养。 2. 珠心胚培养脱毒：柑橘类珠心胚与微管组织没有联系，一 般不带毒，可以利用珠心胚进行培养获得。
3.化学脱毒:采用病毒唑等试剂处理材料或添加到培养基中可 以钝化病毒，达到一定的脱毒效果。
（2）茎尖嫁接：在超净工作台上，将幼苗的上胚轴和子叶去掉， 根系截短，在离上胚轴顶端越0.5cm处斜向下切一深达木质 部，长2-3cm的切口，在斜切口末端横切一刀，用去掉切下 部分。在体视显微镜下，从待脱毒样品上切取0.2mm的茎尖 分生组织，小心放于切口的水平面上，切面向下并与砧木切 口形成层组织紧密贴合，然后接于培养基上。
植物组织培养脱毒快繁技术的综述
植物组织培养脱毒快繁技术的综述李西雁（广西职业技术学院农业技术工程系2002级应用生物技术专业）摘要：脱除病毒是植物组织培养深入探讨研究中的一个技术难题。
本文结合在桂林莱茵生物科技股份有限公司的实践情况，简要介绍植物组织培养的基本原理和方法，综述植物脱除病毒的热处理、茎尖培养和抗病毒药剂三种方法的原理、发展史和技术方法，并介绍了几种常用的病毒检测方法。
本文以马铃薯为例，重点介绍了利用热处理加茎尖组织培养法获得马铃薯脱毒苗的具体技术方法，脱毒率可达100%。
同时还对植物组织培养脱毒快繁技术的应用前景作了分析。
关键词：茎尖培养，组织培养，快繁脱毒技术，病毒检测，应用前景1 植物组织培养研究概况1.1 研究简史自从1943年怀特（White）提出植物细胞“全能性”（Totipotency）学说及诸多后学者（Steward，1958，Guha和Marteshwari，1964）相继证实后，引发植物组织和细胞培养快繁技术的勃然兴起。
我国的专家学者在20世纪70年代后也在此领域做了大量的研究和开发工作，创造了很多新方法、新技术，提出不少新成果，开拓了植物组织培养快繁技术的新局面[1]。
目前采用组织培养脱病毒快繁及离体快繁生产株苗的技术已发展相当成熟[2]。
脱毒株苗具有无杂菌、适应能力较强、繁育较快、质量优、抗性好、分蘖性强、繁殖系数高、大批量生产、周年供应、便于运输等优点，已得到有关专家的鉴定及高度评价和种植试验区、种植产区果农的认可。
例如脱毒马铃薯、脱毒红薯、脱毒生姜、脱毒大蒜、脱毒草莓、脱毒苗木、脱毒花卉等等，已成为现代农民致富的新宠[2]。
1.2 植物组织培养和脱毒快繁的定义植物组织培养（Plant tissue culture）是指在无菌的条件下，将离体的植物（根、茎、叶、花、果实、种子等）、组织（形成层、花药组织、胚乳、皮层等）、细胞（体细胞和生殖细胞）以及原生质体，培养在人工配制的培养基上，给予适当的培养条件，使其长成完整的植株。
第7章 茎尖培养和脱毒、快繁技术
7.3 快速繁殖技术（micropropagation ） 快速繁殖技术（
3. 快繁的一般步骤：
③ 试管苗的壮苗与生根：
• 一般要分成单苗 ， 转移到盐浓度较低 、 不含细 一般要分成单苗， 转移到盐浓度较低、 胞分裂素， 含低浓度生长素的生根壮苗培养基， 胞分裂素 ， 含低浓度生长素的生根壮苗培养基 ， 至根、茎长到合适的长度，即可锻炼出瓶。 至根、茎长到合适的长度，即可锻炼出瓶。 • 问题：不易生根 （ 延长时间、 继代 ） ；易生根： 问题：不易生根（ 延长时间 、 继代） 壮苗阶段不加生长素， 壮苗阶段不加生长素 ， 试管外生根可减少费用； • 特殊方法：如马铃薯的小球茎法。 特殊方法：如马铃薯的小球茎法。
7.3 快速繁殖技术（micropropagation ） 快速繁殖技术（
4. 提高试管苗繁殖速度的措施：
① 选择合适的繁殖途径 ② 改良培养基： 激素 （腋芽 、 不定芽 、 胚状体 ） 等； 激素（ 腋芽、 不定芽、 胚状体） ③ 改良培养条件 ： 温 、光 、 湿度、 气体（有利气体、 湿度 、 气体 （ 有利气体、
7.1 茎尖培养
3. 茎尖培养技术： • 培养方法：固体培养、液体纸 桥培养（易愈伤化时）
7.1 茎尖培养
3. 茎尖培养技术： • 对培养基和培养条件的要求： • 一般可用MS培养基，加少量的生长素（不 用2,4-D）和细胞分裂素；GA3有时对抑制 愈伤等有一定的效果。
7.2 脱毒技术： 脱毒技术：
3. 茎尖培养技术： • 材料消毒：在温室种植或田间种植的健康植 株上取枝条，必要时母株可用杀菌剂处理； 在实验室切取2-3cm长的芽，去掉较大的叶 片，进行常规的表面灭菌；
7.1 茎尖培养
3. 茎尖培养技术： • 茎尖分离：将灭菌的芽置放有湿滤纸的无菌 培养皿中，置体视显微镜下，依次用镊子或 解剖刀剥去叶片直至露出生长点，用锋利的 解剖刀片把带或不带叶原基的分生组织切下 来，直接接种到培养基上；
葡萄的脱毒与快繁植物组织培养常用文档
5、试管苗的驯化与移栽
• 试管苗长出5~7片新叶时，把瓶子移入温室 中，即时可打开培养瓶，历时7d。把苗从 培养瓶中取出，洗净培养基，栽于经过干 热灭菌处理的蛭石内，盘上塑料薄膜罩严 ，置于阳光下，20 ℃，自然条件下锻炼 15d。移入土中。
小结：
形态特征和生物学习性
葡
选材接种
萄 的
葡萄的组织培养
培养基 苗分化
脱
根分化
毒 与
热处理脱毒
快
脱毒 茎尖培养脱毒
繁
无病毒苗的鉴定
脱毒与快繁
材料与消毒
培养条件
快繁 生长与分化
生根培养
试管苗的驯化与移栽
08生物教育 张磊蕾
3mm茎尖进行立体培养，即可获得脱毒苗。
MS+IAA 0.4mg/L+NAA 0.05mg/L
培养基中进行生根。
三、脱毒与快繁
（一）脱毒
葡萄受到26种病毒的危害,主要有卷叶 病毒、栓皮病毒、扇叶病毒、黄脉病毒和 斑点病毒等。由于病毒的危害，葡萄的长 势减弱，产量降低，果实的糖分含量减少， 风味变劣。
• 1、材料与消毒 • 取经过脱毒的枝条稍1~2cm，用5%的次
氯酸钠aq消毒2~3min，用无菌水冲洗3次， 再在0.1%升汞aq中浸泡2min，用无菌水冲 洗4次。把芽放在解剖镜下，无菌条件下， 去除幼叶和叶原基，使生长点暴露。用刀 切下含有1~2个叶原基，大小为0.2~0.3mm 的生长点接种于培养基上。
2、培养基：MS培养基，再添加6-BA 葡萄属落叶木质藤本植物，葡萄地上部分的茎细。
光照：1000lx，16小时
1～2mg/L
节6%上，具而有B卷5培须养，基可，愈向伤上N组攀织援A化。严A重，0茎.0尖生1长m不好g。 /L，LH100mg/L，蔗糖2%，琼
毛葡萄组织培养的脱毒技术
２月份 时 ， 长约 ２ ￣４ ｍ 毛葡 萄 茎段 扦 插 于 实 验 室 沙 盆 中 ， 将 ０ ０ｃ 保持 沙 土湿 润 ， 长 出嫩 芽 ， ３ ５ 待 取 ～
ｃ 毛葡 萄嫩 芽作 为 外植体 进 行组 织 培养 ， ｍ 诱导 无 根试 管 苗 ， 取 无根 试管 苗 进行 脱 毒试 验 。 再 将 获得 的无 根试 管 苗接 种在 Ｂ ＋Ｂ ０ ５ｍｇ Ｌ ＡＡ ０ １ｍｇ Ｌ培 养基 中 ， 于光 照 培养 箱 内 （ ｓ Ａ ． ／ ＋Ｉ ． ／ 置 白天 ３ Ｃ处理 ８ｈ 光 照强 度 ４ ￣ ｌ ｍ ・ ＿， 上 ２ Ｃ处理 １ ） ７ｏ 、 ０／ ｍｏ ・ ｓ。 晚 ２。 ６ｈ 分别 进 行 变温 热处 理 ７ １ 、５ ２ 。 、 ０１ 、５ｄ
由广西 农业 科 学院 重点 实验 室用 分 子生 物学 检验 法 （ Ｔ—ｃ 检 验 毛葡 萄试 管 苗脱 毒 效果 。 Ｒ Ｐ Ｒ）
收 稿 日期 ：０ ８０ 一０ ２ ０ —４１
基金项 目： 国家 自然 科 学 基 金 项 目资 助 （０ ６ ０ ６ ３ ６０ ３ ）
通 讯 联 系 人 ： 贵 玉 （９ ３ ） 男 ， 石 １ ５一 ， 广西 百 色 人 ， 西 师 范 大 学 教 授 。Ｅ ｍａｌｇｓ ｉｙ １３ ｃｒ 广 — ｉ ｌ ｇ ＠ ６ ．ｏ ： ｈ ｎ
毛葡 萄脱 毒苗 的 技术 途 径和 植 株再 生 的较 佳 条 件 ， 以便 为 毛葡 萄建 立快 繁体 系 和 无病 毒 种 苗 的 工厂 化 生 产 提供 理论 依据 和 实验 基础 。
１ 材 料 与 方 法
１ １ 实验 材 料 ． 毛葡萄 Ｖｉｓ ｕｎ ｕ ｎ ｕａ ｉ Ｒ ｈ ｔ ｉｑ ａ ｇ ｌｒｓ ｅ ｄ品种 九龙 二号 （ ｉｑ 广西 罗城 水果 局提 供 ） 。
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葡萄茎尖培养脱毒与快繁技术研究
本文通过对葡萄病毒病进行脱毒技术探讨以及脱毒后快繁技术研究,建立了简便易行、高效的葡萄茎尖培养脱毒技术体系,通过对夏黑无核葡萄进行扦插基质的筛选,从而筛选出适宜葡萄生长的基质,为无病毒苗的炼苗移栽提供最适宜的基质。
探索出葡萄脱毒后快速繁殖无病毒苗的技术。
主要取得了以下研究成果：(1)研究了茎尖培养、热处理、化学处理以及热处理与化学处理结合4种脱毒方法,热处理结合茎尖培养比单独茎尖培养脱毒效果更好,其中变温热处理比恒温热处理的脱毒成活率和脱毒率高,热处理与化学处理结合脱毒综合效率率最高,但成活率低,操作时间长,茎尖的生长发育较其他的脱毒方法慢。
最适的脱毒方法为变温热处理结合茎尖培养脱毒。
(2)确定了最佳的灭菌处理方案是葡萄单芽茎段灭菌效果最好的是1mol/L 盐酸30s+1%次氯酸钠20min处理；筛选出了夏黑无核、金手指、户太8号、金星无核、甬优一号、红宝石无核六个品种葡萄的最佳初代培养、继代培养、生根培养以及茎尖培养的培养基,建立了六个品种葡萄的组培快繁体系。
(3)河沙：食用菌渣：草炭(3：2：1)混合对夏黑无核葡萄扦插苗质量的综合效果最优,单一基质河沙中扦插的苗木质量最差,在带病毒病枝条扦插保存时以及无病毒苗炼苗移栽时,应选择河沙：食用菌渣：草炭(3：2：1)的基质配方。