入噬菌体及质粒载体..
生物技术制药习题及答案
生物技术制药习题及答案一、选择填空题1.酶的主要来源是什么？微生物生产。
2.第三代生物技术是什么？基因组时代。
3.基因治疗最常用的载体是什么？质粒载体和λ噬菌体载体。
4.促红细胞生长素基因可在大肠杆菌中表达。
但不能用大肠杆菌工程菌生产人的促红细胞生产素为什么？因为大肠杆菌不能使人的促红细胞生长素糖基化，人的促红细胞生长素对大肠杆菌有毒性作用。
5.菌体生存所需能量已菌有氧代谢所需能量在什么情况下产生代谢产物乙酸？菌体生长所需能量（大于）菌体有氧代谢所能提供的能量时，菌体往往会产生代谢副产物乙酸。
6.cDNA第一链所合成所需的引物是什么？cDNA第一条链合成所需引物为PolyT。
7.基因工程制药在选择基因表达系统时首先考虑什么？表达产物的功能。
8.为了减轻工程菌代谢负荷，提高外源基因表达水平可采取什么措施？将宿主细胞生长和外源基因的表达分成两个阶段。
9.根据中国生物制品规定要求，疫苗出厂需要经过哪些检验？理化检定、安全检定、效力检定。
10.基因工程药物化学本质是什么？蛋白质。
11.PEG诱导细胞融合？PEG可能与可能与临近膜的水分相结合，使细胞之间只有微笑空间的水分被PEG取代，从而降低了细胞表面的极性，导致双脂层的不稳定，使细胞膜发生融合。
12.以大肠杆菌为目的基因表达系统的表达产物，产物位置是什么？胞内、周质、胞外。
13.人类第一个基因工程药物是什么？重组胰岛素。
14.动物细胞培养的条件是什么？温度:哺乳类37昆虫25~28，ph7.2~7.4，通氧量：使co2培养箱，不同动物比例不同。
防止污染，基本营养物质：三大营养物质+维生素，激素，促细胞生长因子，渗透压：大多数260~320。
15.不属于加工改造抗体的是什么？单域抗体。
16.第三代抗体是什么？利用基因工程技术制备的基因工程抗体。
17.现代生物技术的标志是什么？DNA重组技术。
18.获得目的基因最常用的方法是什么？化学合成法、PCR法（最常用）、基因文库法、cDNA文库法。
第八讲单链噬菌体载体及噬菌粒载体
第八讲单链噬菌体载体及噬菌粒载体吴乃虎中国科学院遗传与发育生物学研究所第八讲单链噬菌体载体及噬菌粒载体一、单链噬菌体的一般生物学1．单链噬菌体的优越性2．M13噬菌体的生物学特性二、M13克隆体系1．M13克隆体系2．M13克隆体系-半乳糖苷酶的显色反应原理3．M13载体系列的发展4．M13载体系列的优点三、噬菌体展示载体1．噬菌体展示载体的构建原理2．噬菌体展示载体3．噬菌体表面展示文库4．应用噬菌体展示载体分离有关蛋白质的实例四、噬菌粒载体1．M13噬菌体载体克隆的若干难点2．噬菌粒3．若干常用的噬菌粒载体4．pBluescript噬菌粒载体5．pUC118和pUC119噬菌粒载体第八讲单链噬菌体载体一、单链噬菌体一般生物学大肠杆菌丝状单链DNA噬菌体有M13噬菌体、f1噬菌体及fd 噬菌体，它们均含有分子量约为6400个核苷酸的单链闭环DNA分子。
1．单链DNA phage的优越性A．具有双链的复制型DNA(RF DNA)，可如质粒质粒一样进行遗传操作；RF DNA：Replication Form DNA。
B．RF DNA和ssDNA均可感染感受态的寄主细胞——形成phaque或colony。
C．不受包装的限制。
因为单链DNA phage的大小是受其DNA 多寡制约的。
D．可容易地测出外源DNA的插入取向。
E．可产生大量的含有外源DNA的单链DNA分子，这种单链DNA分子有如下用途(作为模板)：*1用作双脱氧链终止法进行DNA测序*2制备单链的放射性标记的杂交用DNA探针*3利用寡核苷酸进行定点突变2．M13 phage的生物学特性A．M13 phage同f1 phage亲缘关系十分密切，例如：①基因组组织形式相同；②病毒颗粒大小、形状相近；③DNA同源性高达98%以上。
B．在M13 phage颗粒中只有(+)链DNA，感染具F性须的大肠杆菌菌株，因此M13噬菌体是雄性E.coli特有的；M13噬菌体的(+)链DNA，又称为感染性单链DNA。
大肠杆菌的λ-噬菌体
•功能区：裂解相关S和R，复制相关O和P
3、感染周期（溶菌循环）
•λDNA复制早期：一个ori ，双向复制 •晚期：滚环复制--多个λDNA分子形成线状多联体
尾巴上的微丝可以把噬菌 体的DNA注入细菌内。
噬菌体或病毒的DNA能被开发
成为基因工程的有用载体，因为：
1.高效率的感染性能使外源基
因高效导入受体细胞；
2.自主复制繁殖性能使外源基
因在受体细胞中高效扩增。
大肠杆菌的λ-噬菌体
（一） λ-噬菌体的生物学特性 1、由外壳包装蛋白和λ-DNA组成 2、 λ-DNA的物理图谱
必须携带标记基因
经改造后只具有一个可供外源DNA插入的克隆位点,长度 为37kb，为包装的下限，它本身也能被包装，允许插入 片段最大为14kb.
取代型载体（substitution vector）
具有成对的克隆位点,空载的载体DNA只26kb，不能被包 装，无法进入受体细胞中去,不需要标记基因.
应用：
（1）功能相近的基因在基因组中聚集在一起 目前已经被确定的基因至少61种，一半为必需 基因
（2）线状双链DNA，两端各有一个12bp的互补单链 （粘性末端，cohesive-end site），称λcos site ，粘性末端粘连接变成环状DNA。
λco基因大致分为3个区：
cI基因：编码阻遏蛋白，是感染了λ噬菌体的寄主细胞进 入溶源化的必要条件。cI基因失活或缺失的λ噬菌体无法 使寄主细胞发生溶源化效应。
DNA重组技术一般需要噬菌体处于溶源状态。
λ噬菌体DNA的整合与删除：
噬菌体转导的操作方法
噬菌体转导的操作方法噬菌体是一种可以侵染并感染细菌的寄生病毒。
也可以通过一定的操作方法进行噬菌体的转导，即将噬菌体导入到目标细菌中。
噬菌体转导的方法有多种，包括传统的混合转染和现代的质粒张量传递等。
下面将详细介绍这些方法以及其他与噬菌体转导相关的操作步骤。
一、传统的混合转染方法1. 实验室条件准备：首先需要在无菌环境下操作，在实验室环境中设置无菌台，准备好所需的培养基、细菌菌种、噬菌体溶液和培养皿等。
2. 培养目标细菌：首先，将目标细菌分别接种到含有适合其生长的培养基中，培养至合适的生长状态。
3. 噬菌体溶液制备：将待转导的噬菌体培养物取出，可以进行多次离心洗涤，以去除一些不必要的物质。
然后将噬菌体溶液稀释合适的倍数，通常以MOI （Multiplicity of Infection）为计量单位，即用噬菌体粒子数和目标细胞数的比值来衡量噬菌体转染的效果。
4. 转染实验操作步骤：将噬菌体溶液与目标细菌培养物混合均匀，使噬菌体感染目标细菌。
通常，将细菌培养物与噬菌体溶液在37下静置一段时间（通常为10-30分钟）或在摇床上轻微摇动，以促进噬菌体与细菌结合。
然后，将混合物转移到预先加热的琼脂糖平板上，并均匀摇晃，使得细菌和噬菌体充分接触。
然后将含有混合物的琼脂糖平板培养在适当的温度下，通常在37下培养一段时间，让噬菌体感染目标细菌并形成溶菌斑。
5. 结果分析：观察琼脂糖平板上是否出现了溶菌斑，即噬菌体感染目标细菌后引起的溶解区域。
溶菌斑的大小和数量可以用来评估噬菌体的转导效果和细菌对噬菌体的感受性。
二、质粒张量传递方法传统的混合转染方法虽然简单易行，但受到不少限制，如只能传递噬菌体基因组，不能有效转导大分子质粒等。
而质粒张量传递方法则可以绕过这些限制，使得噬菌体转导的应用领域更加广泛。
1. 质粒构建：首先，需要构建带有目的基因的质粒，该质粒通常包括适当的启动子、转录起始序列、编码序列和终止序列。
2. 噬菌体构建：然后，将构建好的质粒导入到适当的噬菌体质粒载体中。
λ噬菌体包装质粒原理
λ噬菌体包装质粒原理
噬菌体包装质粒是通过利用噬菌体感染细菌并将质粒DNA包装入噬菌体颗粒中来制备。
其原理包括以下几个步骤：
1. 噬菌体感染：选择一种合适的寄主细菌，使其被特定的噬菌体感染，噬菌体一般是属于细菌的病毒，在细菌被噬菌体感染后，噬菌体将控制细菌的合成机制并复制自身。
2. 质粒DNA插入：将感兴趣的质粒DNA插入到被感染的细菌中，这一步骤一般通过细菌转化技术实现，使质粒DNA进入细菌细胞质。
3. 质粒DNA复制和包装：被插入的质粒DNA在被感染的细菌中进行复制，同时噬菌体的复制机制也被激活。
在病毒复制的过程中，质粒DNA被包装入噬菌体颗粒中，形成带有质粒DNA的新的噬菌体。
4. 细菌溶解和收集：当感染的细菌数量达到一定程度时，噬菌体会释放，溶解宿主细菌。
此时，溶解的细菌中含有大量包装有质粒DNA的噬菌体颗粒，通过离心等方法，可以收集到纯净的噬菌体和质粒DNA。
通过以上步骤，可以利用噬菌体包装质粒原理，制备纯净的质粒DNA。
这种方法在基因工程实验中被广泛应用，包括基因克隆、重组蛋白表达、基因组库构建等。
第2章 基因克隆的载体——质粒和噬菌体
第2章基因克隆的载体——质粒和噬菌体载体：携带外源DNA进入宿主细胞的工具。
一、载体的功能：1.运送外源基因高效转入受体细胞2.为外源基因提供复制能力或整合能力3.为外源基因的扩增或表达提供条件二、载体应具备的条件：1.具有对受体细胞的可转移性2.具有与特定受体细胞相适应的复制位点或整合位点3.长度尽可能小，以提高其载装能力4.具有多种单一的酶切位点5.具有合适的选择性标记附图：图 3-1 自主复制型载体和附加载体的扩增方式2.1 质粒质粒是存在于细菌细胞质中独立于染色体而自主复制的共价、封闭、环状双链DNA分子（Covalently closed Circular DNA, ccc DNA），并不是细菌生长所必需的，但可以赋予细菌某些抵御外界环境因素不利影响的能力。
分子量在1-200kb之间。
一、质粒的基本特性：（一）自主复制性质粒DNA携带有自己的复制起始区（ori）以及一个控制质粒拷贝数的基因，因此它能独立于宿主细胞的染色体DNA而自主复制。
不同的质粒在宿主细胞内的拷贝数也不同，少则几个多则几百个不等，当然由于质粒上并没有复制酶的基因，所以其复制需要使用宿主细胞复制染色体DNA的多种酶群。
（二）不相容性利用同一复制系统的不同质粒（RNAI RNAII Rop因子）如果被导入同一细胞中，它们在复制及随后分配到子细胞的过程中，就会彼此竞争，它们在单细胞中的拷贝数也会有差异，拷贝多的复制更快，结果在细菌繁殖几代之后，细菌的子细胞中绝大多数都含有占优势的质粒，因而这两种质粒中只能有一种长期稳定地留在细胞中，这就是所谓的质粒不相容性。
（三）可扩增性质粒就其复制方式而言分为两类：松弛型复制及严谨型复制。
pMB1或ColEI 类质粒复制子的复制完全依靠宿主细胞提供的半衰期较长的复制酶及蛋白因子（DNA聚合酶I，III，RNA聚合酶以及dnaB、dnaC、dnaD、dnaZ的产物），因此在蛋白质合成中断时，质粒复制能持续合成，这样当用氯霉素抑制蛋白质合成并阻断细菌染色体复制时，带有pMB1或ColEI复制子的质粒将利用丰富的原料大量复制，最后每个细胞可以积聚2000-3000个拷贝，这叫做氯霉素扩增。
入噬菌体及质粒载体
理想的质粒载体
(1)分子量小、多拷贝、松弛控制型; (2)具有多种常用的限制性内切酶的单切点; (3)能插入较大的外源DNA片段; (4)具有两个以上的遗传标记物，便于鉴定和 筛选。 (5)对宿主细胞无害。常用的质粒载体大小一 般在1kb至10kb之间，如PBR322、PUC系列、 PGEM系列和pBluescript(简称pBS)等。
Β-半乳糖苷酶失活的插入型载体
• 载体基因组中含有一个大肠杆菌的 lac5区段，编码着Β-半乳糖苷酶基因 lacZ。由这种载体感染到的大肠杆菌 lac-指示菌，涂布在添加IPTG和Xgal 的培养基上就会形成蓝色的噬菌斑。
替换型载体
• λ噬菌体的中央部分有一个可以被外源插入 的DNA分子所取代的DNA片段的克隆载体。
质粒载体的优缺点
• 质粒载体主要用于DNA分子的亚克隆，表达外源 蛋白，DNA序列的测定和基因的体外重新构建等。 • 1.与外源DNA重组操作简便； • 2.外源DNA在质粒载体中相对较稳定， • 3.质粒DNA的制备和纯化方便，快速简单，所以 得到广泛应用。 • 缺点： • 1.它容纳外源DNA片段有限，通常最多为15kb左 右，因为当质粒大于15kb时，转化效率明显下降。
质粒载体
质粒特点
• ①染色质外的双链共价闭合环形DNA（covalently closed
circuar DNA,cccDNA）可自然形成超螺旋结构，不同质 粒大小在2-300kb之间，＜15kb的小质粒比较容易分离纯
化，＞15kb的大质粒则不易提取。
• ②能自主复制，是能独立复制的复制子（autonomous
注 意
• λ噬菌体感染了寄主细胞之后，究竟是发生溶
菌反应还是溶源反应，这是由cI基因和cro基
基因工程常用的三种载体
基因工程常用的三种载体基因工程是一门综合性的学科，其中一个关键方面是使用载体进行基因转移和操控。
载体是一种可以携带和传递特定基因的DNA分子。
在基因工程中，常用的载体有质粒、噬菌体和人工染色体。
下面将详细介绍这三种载体的相关信息。
1. 质粒（Plasmid）质粒是一种环状双链DNA分子，通常存在于细菌细胞内，也可通过人工方法导入其他生物体内。
质粒是最常用的基因工程载体，因其结构相对简单且易于操作，可以携带外源基因并通过转染等方法传递到细胞中。
质粒的大小通常在1-20千碱基对之间，具有自主复制和不受宿主基因组限制的能力。
质粒常用于基因克隆、表达以及基因敲除等研究。
例如，在基因克隆中，通过将目标基因插入质粒中的多克隆位点，可以将质粒转化到宿主细胞中进行扩增和分析。
质粒也常用于表达外源基因，可以将目标基因与促进其表达的启动子及调控元件结合在一起，构建表达载体进入目标细胞中，使其产生目标蛋白。
2. 噬菌体（Bacteriophage）噬菌体是一种寄生于细菌的病毒，是基因工程中另一常用的载体。
噬菌体具有高度选择性对细菌进行感染和复制的能力，因此可以利用噬菌体来转移和表达外源基因。
噬菌体载体通常比质粒大，可以携带更长的DNA序列。
噬菌体常用于噬菌体展示技术和抗体库构建。
噬菌体展示技术是一种用于筛选蛋白质相互作用、抗体或潜在药物靶点的方法。
通过将目标多肽或蛋白质与噬菌体表面蛋白基因融合，在噬菌体所感染的细菌中进行筛选。
另外，噬菌体也常用于构建噬菌体抗体库，通过大规模的筛选，筛选出具有特定抗体活性的噬菌体克隆。
3. 人工染色体（Artificial Chromosome）人工染色体是通过基因工程方法人为合成的染色体模拟体，在某些情况下可用于携带超长的DNA分子。
人工染色体被设计成可以稳定传递和复制的DNA分子，通常包括一个原核或真核的起始序列、一个中央控制区域和一个终止序列。
人工染色体在基因组学和基因治疗研究中发挥着重要作用。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
注 意
• λ噬菌体感染了寄主细胞之后，究竟是发生溶
菌反应还是溶源反应，这是由cI基因和cro基
因编码的蛋白质，同λ噬菌体的两个操纵基因
（OL, OR)之间的相互作用来决定的。 • 如果这两个操纵基因都已摆脱了阻遏状态，那 么噬菌体便可以进入溶菌周期，否则进行溶源 周期。
构建λ噬菌体载体的基本原理
质粒载体
质粒特点
• ①染色质外的双链共价闭合环形DNA（covalently closed
circuar DNA,cccDNA）可自然形成超螺旋结构，不同质 粒大小在2-300kb之间，＜15kb的小质粒比较容易分离纯
化，＞15kb的大质粒则不易提取。
• ②能自主复制，是能独立复制的复制子（autonomous
注意：λ噬菌载体作为载体，其重组噬菌体DNA 大小只能： 38kb ~ 52kb。
体外包装：λ噬菌载体 + 尾部蛋白 + 头部蛋白
λ噬菌体载体的改良
• 围绕三个目的进行： • 设计可对重组体分子作正选择的克隆载体， • 发展可使插入的真核cDNA与β-半乳糖苷 酶形成融合蛋白质的克隆载体。
质粒载体的优缺点
• 质粒载体主要用于DNA分子的亚克隆，表达外源 蛋白，DNA序列的测定和基因的体外重新构建等。 • 1.与外源DNA重组操作简便； • 2.外源DNA在质粒载体中相对较稳定， • 3.质粒DNA的制备和纯化方便，快速简单，所以 得到广泛应用。 • 缺点： • 1.它容纳外源DNA片段有限，通常最多为15kb左 右，因为当质粒大于15kb时，转化效率明显下降。
• 中央可取代片段两侧的多克隆位点是反向 重复序列。因此当外源DNA插入时，一对 克隆位点之间的DNA片段便会被置换掉， 从而有效的提高了克隆外源DNA片段的能 力。
λ噬菌体载体的特点
(1)筛选简便；
(2)可克隆的片段大，最大可达23 kb， 而质粒最大仅10 kb左右； (3)转化效率高。λ噬菌体载体是主要用于cDNA构建， 也经常用于外源目的基因的克隆。
replicon）。一般质粒DNA复制的质粒可随宿主细胞分裂 而传给后代。
• ③质粒对宿主生存并不是必需的，某些质粒携带的基因
功能有利于宿主细胞的特定条件下生存。
质粒载体的种类
• 在基因工程中，常用人工构建的质粒作为 载体。人工构建的质粒可以集多种有用的 特征于一体，如含多种单一酶切位点、抗 生素耐药性等。常用的人工质粒运载体有 pBR322、pSC101。pBR322含有抗四环素 基因(Tcr)和抗氨苄青霉素基因(Apr)，并含 有27种限制性内切酶的单一识别位点。
• 野生型的λ噬菌体DNA，对大多数基因克 隆中常用的核酸内切酶都有过多的限制位 点，通过消除一些多余的限制位点和切除 非必要的区段，才可能将它改造成适用的 克隆载体。
λ噬菌体载体可分为：
插入型载体
替换型载体
插入型载体
• 免疫功能失活的插入型载体：载体基因组 上存在一段免疫区，其中带有一两种核酸 内切限制酶的单切割位点。当外源DNA插 入到这种位点上时，就会使载体所具有的 合成性阻遏物的功能遭受到破坏，而不能 进入溶源周期。因此带有外源DNA插入的 λ重组体都只能形成清晰的噬菌斑，而没 有外源DNA插入的亲本噬菌体就会形成浑 浊的噬菌斑。
理想的质粒载体
(1)分子量小、多拷贝、松弛控制型; (2)具有多种常用的限制性内切酶的单切点; (3)能插入较大的外源DNA片段; (4)具有两个以上的遗传标记物，便于鉴定和 筛选。 (5)对宿主细胞无害。常用的质粒载体大小一 般在1kb至10kb之间，如PBR322、PUC系列、 PGEM系列和pBluescript(简称pBS)等。
λ- 噬菌体及质粒载体
——郭苋 2014212346
噬菌体的一般生物学特性
• 依赖于寄主细胞存活。脱离了寄主细胞后既不能 生长也不能复制。 • 基本功能： • 保护自己的核酸分子（DNA或RNA）免遭环境化 学物质的破坏 • 将其核酸分子注入到被感染的细菌细胞 • 经被感染的细菌细胞转变成制造噬菌体的体系， 从而能产生出大量的子代噬菌体颗粒。 • 使感染的细菌细胞释放出子代噬菌体颗粒
Β-半乳糖苷酶失活的插入型载体
• 载体基因组中含有一个大肠杆菌的 lac5区段，编码着Β-半乳糖苷酶基因 lacZ。由这种载体感染到的大肠杆菌 lac-指示菌，涂布在添加IPTG和Xgal 的培养基上就会形成蓝色的噬菌斑。
替换型载体
• λ噬菌体的中央部分有一个可以被外源插入 的DNA分子所取代的DNA片段的克隆载体。
λ噬菌体载体
1 λ噬菌体的分子生物学概述
2 λ噬菌体载体
1 λ噬菌体的分子生物学概述
• λ噬菌体颗粒中的DNA是一线性双链DNA分 子，长48 502bp，两端各有12个碱基的5` 凸出黏性末端是互补的。进入细胞的λDNA 通过两端的黏性末端环化。可用来构建柯 斯质粒。
• λ噬菌体上有些基因可被取代而不影响其 生活周期。
λ噬菌体基因组编码基因区域
• 左侧区：自基因A到基因J，包括参与噬菌体头部蛋 白质和尾部蛋白质合成所需要的全部基因。 • 中间区：介于基因J与基因N之间，这个区又称为非 必要区。本区基因与保持噬菌斑形成能力无关，但 包括了一些与重组有关的基因（redA 和redB）。以 及整合到大肠杆菌染色体中去的int基因。和把原噬 菌体从寄主染色体上删除出去的xis基因。 • 右侧区：位于Ｎ基因的右侧，包括全部主要的调控 成分，噬菌体复制基因（Ｏ和Ｐ）以及溶菌基因 （Ｓ和Ｒ）