基因工程载体噬菌体载体

用途： a.用作一般的克隆载体。 b.用于构建基因组或cDNA。 c.用于抗体库或随机肽库的构建。
（四） λ-DNA的抽提
1) 大肠杆菌培养至对数生长期 2) 加入λ-噬菌体或重组λ-噬菌体悬浮液，37℃
E.coli使之在E.coli内繁殖，并裂解E.coli，形成空斑。
换型噬菌体λ是使用最广泛的载体。
（3）凯伦噬菌体载体
既有插入型；又有替换型 在基因工程实验中的用途十分广泛 承受外源DNA的能力：几个kb到23kb
（三）体外包装
λ噬菌体DNA体外重组后，一般必须经 过体外包装，然后以噬菌体感染的方式将
2、 噬菌体的结构和其核酸类型：
结构：无尾部结构的二十面体型、
具尾部结构的二十面体型、 线状体型 核酸类型：最常见的是双链线性DNA、
双链环形DNA、 单链环形DNA、 单链线形DNA、 单链RNA。
3、λ-DNA的物理图谱
λ-DNA为线状双链DNA 分子，两端各有一个12核苷 酸的互补单链（粘性末端） GGGCGGCGAC CT, CCCGCCGCTGGA，称为 cos区，全长48.5kb。
（2）λ 替换型载体（取代型 e.g. EMBL3载, 体DA）SH
• 外源DNA取代噬菌体染色体中对于噬菌体 的感染和复制非必要的片段 (~ 20 kb)
• 高感染效率 (109 转化株/ug 载体 DNA, 比质 粒高100-倍)
替换式载体
野生型噬菌体染色体的中段对于噬菌体的感染和 复制是非必要的，外源DNA可以取代这一片段，例如 Charon 4A、 λEMBL 3/ 4、Charon40等载体，这些 载体是用Lac 5（乳糖操纵子的大部分系列，包括完整 的Lac Z）替换入噬菌体的中间区段，同时将Lac 5作 为选择标记，使用时用EcoRI水解，去掉中间的片段， 再与欲克隆片段在体外进行重组、包装。而后，感染
cos 位点
A
结构区 重组区 调控区
EcoRI
R
A
裂解区
R
目的基因
插入型
置换型
λ噬菌体的基因组结构
头部基因
尾部基因
功能不明区
AWBCDE FZUVGHMLKIJ
b2
COS
溶源化 重组 早期控制 阻遏 DNA合成 溶菌 COS att int xis gam red cIII N cI cro cII O P Q S R
主菌体内连续复制，合成大量基因产物，进而装配成噬菌体 颗粒，裂解宿主菌，释放出来的噬菌体又可感染其他细菌。 溶源性生长(lysogenic pathway)
噬菌体感染细菌后，可将自身DNA整合到细菌的染色体中 去，与之一起复制，并遗传给子代细胞，宿主细胞不被裂解 。
噬菌体
cos位点
A WB DEF Z J att xis N cl cro O P Q SR
5’-CG
GGGCGGGCGACCTCG-3’ Linear form
+
GC-5’
3’-GCCCCGCCGCTGGA
（二）λ噬菌体载体的主要类型 （1） 插入式载体
一种只具有一个可供外源DNA插入的克隆位点的 派生载体。 （2） 替换型载体（取代型载体）
具有成对的克隆位点，在这 两个位点之间的λDNA 区段可以被外源插入的DNA片段所取代。 （3） 凯伦噬菌体载体
特点是功能相近的基因在基 因组中聚集在一起。
λ噬菌体
组成特点：
双链线状DNA分子， 全长50kb， 含65个基因，
在其分子两端各含有12 个碱基的互补单链，是天 然的粘性末端，被称为 COS位点。
λ噬菌体感染细菌后的溶菌性生长和溶源性生长
溶菌性生长（lytic pathway） 噬菌体感染细菌后，借助其2个COS位点互补成环，在宿
噬菌体
1. 噬菌体的生物学特性
烈性噬菌体,只具有溶菌生长周期
温和噬菌体，具有溶源生长周期和溶菌生长周期
溶菌周期指噬菌体将DNA注入寄主细胞后很快环化，然 后进行自我复制、蛋白衣壳合成和新噬菌体颗粒的组装， 最后使寄主细胞破裂而释放出大量的子代噬菌体。
溶源周期中，注入寄主细胞的噬菌体DNA是整合到寄主 细胞染色体上并可以随着寄主细胞的分裂而进行复制。
整合了一套完整的噬菌体基因组的细菌被称为溶源性细
菌。在溶源性细菌内存在的整合或非整合的噬菌体DNA
被称为原噬菌体。
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噬菌体的生活周期
分为两种： （1） 溶菌周期：
烈性噬菌体（virulent phage)
（2） 溶原周期：
温和噬菌体（temperate phage)
感染细菌后，将自己的DNA整 合到细菌的染色体DNA中。形 成这一过程称为溶源化
生长非必须区段 cI基因：溶源过程控制基因。
The phage cos ends
5‘-CGGGGCGGCGACCTCG-3’ 3’-GCCCCGCCGCTGGAGC-5’ Circular form
Cleavage (during packaging)
Ligation (after infection)
插入式载体可携带的外源ＤＮＡ片段较 替换式为小。
• ◆ λ噬菌体载体可接受15 kb-23 kb的外源 DNA片段，它既可作为克隆载体，也可作 为表达载体，广泛用于各类基因库的构建。
重组噬菌体的分子量必须在野生型噬 菌体 分子量大小的75%至105%之间。
筛选标记： 蓝白斑(LacZ)、噬菌斑等。
噬菌体载体 （phage vectors）
一、噬菌体载体 二、单链噬菌体载体 三、噬菌粒载体 四、柯斯质粒载体
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一、噬菌体载体
（一）噬菌体的一般特性
噬菌体是一类细菌病毒（Bacteriophage）
结构：
蛋白质外壳内包裹 着DNA（双链、单 链、线性、环状 等）。
T4 Bacteriophage
重组DNA导入E.coli细胞内。这是因为以感
染方式导入细胞的频率可达 106~108/μgDNA，而以转染（translation） 的方式导入的频率仅为103~105/ μgDNA。
λ噬菌体的包装限制为野生噬菌体DNA （约48.5 kb）的75%~105%。
由于λ噬菌体包装时，当DNA的长度短 于野生型的78%或超过105%时，噬菌体的 活性就急剧下降。因此只包装它的野生型 DNA（48.5KB）的75%~105%左右的Ｄ ＮＡ，要求λ载体DNA和外源DNA长度之 和在39～53kb之间。