细胞增殖的实验
细胞增殖实验(MTT assay)
MTT实验一．实验原理检测原理为活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性MTT还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲瓒（Formazan）并沉积在细胞中，而死细胞无此功能。
二甲基亚砜（DMSO）能溶解细胞中的甲瓒，用酶标仪在490nm(可参比630nm)波长处测定其光吸收值，在一定细胞数范围内，MTT结晶形成的量与细胞数成正比。
根据测得的吸光度值（OD值），来判断活细胞数量，OD值越大，细胞活性越强（如果是测药物毒性，则表示药物毒性越小）二．溶液配制将MTT粉末用PBS配制成5mg/ml的储液，0.22μm的小滤头过滤除菌后，分装到灭菌的EP管中1ml/管，-20℃避光保存；使用时，将其用DMEM+10%FBS的培养基稀释10倍至终浓度0.5mg/ml进行细胞活性试验测定。
三．实验步骤1.细胞的准备：选择接近对数期生长的细胞，胰酶消化终止后，离心沉淀细胞去上清，正常培养基重新悬浮细胞；细胞计数板计数，对MDA-MB-231细胞，利用培养基将细胞浓度调整至20000个/ml，然后利用八连排移液器，依次取100μL细胞悬液加入96孔板中，此时每孔的细胞数约为2000个，根据实验的组数及需要测定的天数接种适当的孔数和板数，通常每个实验组设置3-6个重复。
2.细胞的培养与处理：当进行加药处理时，通常选择接种12h后，进行首次细胞活性测定，作为本底值；同时将相应的实验组加入对应的处理，根据药物作用时间选择合适的点进行选择时间进行细胞的活性测定。
（在进行TGF-beta对细胞增殖的抑制试验时，选择5ng/ml的TGF-beta持续处理4d，并每天选择一块板进行测量，来绘制细胞的增值曲线；实验中注意根据细胞的生长状况选择两天换液一次。
）3.MTT的反应与结晶的生成：测定时，先将MTT原液用DMEM+10%FBS的培养基稀释至工作浓度0.5mg/ml，然后用移液器吸出原来的培养基，每孔加入含0.5mg/ml MTT的培养基；37℃，5%CO2条件下，继续对细胞培养3-5h，待结晶的生成。
细胞增殖实验
增殖
1、1000个细胞/孔（96孔），一般5个左右重复，大约能做一周
2、孔板周围需用PBS封闭以防蒸发
3、MTS或CCK-8 均是100UL+10UL,可以混好后每孔加100ul,2-4小时后测OD值
4、从第三天开始换液，以后隔天换一次
克隆形成
1、96孔每孔10个细胞（6-10个重复），24孔每孔50个细胞（容易有边缘效应，3-4个重复）
2、孔板周围用PBS封闭
3、约10天左右染色
4、3-4天需换一次液
1. 接种一定数目的细胞于24孔培养板（如50细胞/孔）或6孔培养板（如100细胞/孔）中，每种细胞3个重复孔。
2. 37度孵箱培养，3-4天更换一次培养基。
3. 根据不同的细胞生长状况，10-14天时对克隆形成染色。
4. 弃去培养基，PBS洗1次。
5. 甲醇室温固定10分钟。
6. 弃去甲醇，水洗，超净台中吹干。
7. 加入吉姆萨染色10-30分钟。
8. 弃去吉姆萨，水洗，风干。
9. 根据不同细胞生长情况，一般以50个细胞以上的群体为一个克隆，统计克隆数，与接种的细胞数比较计算出克隆形成比例。
成球
1、96孔10个每孔，6-10个重复，需10天以上
2、孔板周围用PBS封闭
3、3-4天换一次液
4、EGF 20ng/ml ,HGF10ng/ml ,BFGF 20ng/ml ,B27 50x ,LG 100x ,双抗，F12培养基，非贴的96孔板。
细胞增殖实验报告
细胞增殖实验报告细胞增殖实验报告细胞增殖是生物学中一个重要的研究领域，对于了解生命的起源、发展和疾病的发生机制具有重要意义。
本文将介绍一项关于细胞增殖的实验，旨在探究细胞增殖的规律和影响因素。
实验设计：本次实验选择了人类肺癌细胞株作为研究对象，通过培养细胞，观察细胞在不同条件下的增殖情况，并分析影响细胞增殖的因素。
实验步骤：1. 细胞培养：将人类肺癌细胞株接种于含有适宜培养基和培养液的培养皿中，放置于恒温培养箱中，温度为37℃，湿度为95%，二氧化碳浓度为5%。
2. 细胞计数：每隔一定时间，取出一小部分细胞悬液，使用显微镜和细胞计数板对细胞进行计数。
记录细胞数量并计算平均值。
3. 细胞增殖曲线绘制：根据细胞计数结果，绘制细胞增殖曲线，以时间为横轴，细胞数量为纵轴，观察细胞增殖的动态变化。
实验结果：经过一段时间的培养，我们观察到细胞数量逐渐增加，呈现出指数增长的趋势。
细胞增殖曲线显示，细胞数量在初始阶段增长较缓慢，随着时间的推移，增长速度逐渐加快，直至达到饱和状态。
讨论：1. 生长曲线特征：细胞增殖曲线呈现出一定的特征，即初始阶段增长缓慢，然后迅速加速，最后趋于平缓。
这是由于细胞在培养基中适应环境，增殖能力逐渐增强，细胞数量也随之增加。
当细胞数量达到一定程度时，培养基中的营养物质和空间有限，细胞增殖速度减缓，最终停止增殖。
2. 影响因素：细胞增殖受到多种因素的影响，如培养基中的营养物质浓度、pH 值、温度、湿度等。
其中，营养物质的供应是细胞增殖的基础，适宜的pH值和温度可以提供良好的生存环境，湿度对于细胞的生长也有一定的影响。
3. 应用前景：细胞增殖实验可以为药物筛选、疾病治疗和组织工程等领域提供重要参考。
通过观察细胞在不同条件下的增殖情况，可以评估药物对细胞增殖的影响，为新药的开发提供依据。
此外，细胞增殖实验还可以为疾病的治疗方案提供参考，例如癌症治疗中的细胞毒性药物筛选和剂量确定。
结论：通过本次实验，我们成功观察到了人类肺癌细胞在培养基中的增殖情况，并绘制了细胞增殖曲线。
细胞增殖实验
细胞增殖检测方法细胞增殖检测通常是检测分裂中的细胞数量或者细胞群体发生的变化。
目前细胞增殖检测主要分为五类：DNA合成检测、代谢活性检测、细胞数量检测、细胞增殖相关抗原检测和ATP 浓度检测。
在这些方法中作何选择，主要取决于所研究的细胞类型和研究方案。
1.DNA合成检测这是目前实验室中检测细胞增殖最准确可靠的方式。
该法是将放射性标记的3H-胸腺嘧啶与细胞一同孵育，这样新增殖细胞的DNA中就会掺入放射性标记，经洗脱后可用闪烁计数器检测。
该方法耗时长，而且有个明显的弊端就，即使用和处理放射性物质既麻烦又不安全。
不过，可以使用5-溴-2-脱氧尿苷BrdU来进行类似实验，因为BrdU也同样可以掺入到新合成的DNA中。
但这样就需要进行额外的实验步骤，先孵育特异性BrdU单抗和带标记的二抗，然后再进行比色法、化学发光检测或荧光信号检测等步骤。
该方法的优点就是不再需要放射性物质。
BrdU标记很适合免疫组化IHC、免疫细胞化学IC、细胞内ELISA、流式细胞分析和高通量筛选。
2.代谢活性检测检测细胞群体的代谢活性也可以反映细胞增殖的情况。
在细胞增殖过程中脱氢酶的活性会增加，因此其底物四唑盐或Alamar Blue在代谢活跃的细胞环境中会逐渐减少，形成能够改变培养基颜色的甲臜染料。
可以通过低配置或高配置的分光光度计和酶标仪来读取含染料培养基的吸光度，从而衡量细胞的代谢活性，检测细胞增殖的情况。
四种最常见的四唑盐是：MTT、XTT、MTS和WST1。
MTT在标准的细胞培养基中是不溶的，而且其生成的甲臜晶体需要溶解在DMSO或者异丙醇中。
因此，MTT主要作为终点检测方法。
其他三种盐与Alamar Blue一样，都是可溶且无毒。
它们可以作为连续监控手段来跟踪细胞增殖的动态改变。
其中XTT的效率较低，需要添加额外的因子；WST1更灵敏有效，与其他盐相比能够更快显色；Alamar Blue的灵敏度也很高，只要微孔板的孔中有100个细胞就能够检测到。
细胞增殖实验(MTT assay)
MTT实验一．实验原理检测原理为活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性MTT还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲瓒（Formazan）并沉积在细胞中，而死细胞无此功能。
二甲基亚砜（DMSO）能溶解细胞中的甲瓒，用酶标仪在490nm(可参比630nm)波长处测定其光吸收值，在一定细胞数范围内，MTT结晶形成的量与细胞数成正比。
根据测得的吸光度值（OD值），来判断活细胞数量，OD值越大，细胞活性越强（如果是测药物毒性，则表示药物毒性越小）二．溶液配制将MTT粉末用PBS配制成5mg/ml的储液，0.22μm的小滤头过滤除菌后，分装到灭菌的EP管中1ml/管，-20℃避光保存；使用时，将其用DMEM+10%FBS的培养基稀释10倍至终浓度0.5mg/ml进行细胞活性试验测定。
三．实验步骤1.细胞的准备：选择接近对数期生长的细胞，胰酶消化终止后，离心沉淀细胞去上清，正常培养基重新悬浮细胞；细胞计数板计数，对MDA-MB-231细胞，利用培养基将细胞浓度调整至20000个/ml，然后利用八连排移液器，依次取100μL细胞悬液加入96孔板中，此时每孔的细胞数约为2000个，根据实验的组数及需要测定的天数接种适当的孔数和板数，通常每个实验组设置3-6个重复。
2.细胞的培养与处理：当进行加药处理时，通常选择接种12h后，进行首次细胞活性测定，作为本底值；同时将相应的实验组加入对应的处理，根据药物作用时间选择合适的点进行选择时间进行细胞的活性测定。
（在进行TGF-beta对细胞增殖的抑制试验时，选择5ng/ml的TGF-beta持续处理4d，并每天选择一块板进行测量，来绘制细胞的增值曲线；实验中注意根据细胞的生长状况选择两天换液一次。
）3.MTT的反应与结晶的生成：测定时，先将MTT原液用DMEM+10%FBS的培养基稀释至工作浓度0.5mg/ml，然后用移液器吸出原来的培养基，每孔加入含0.5mg/ml MTT的培养基；37℃，5%CO2条件下，继续对细胞培养3-5h，待结晶的生成。
检测细胞增殖能力的方法
检测细胞增殖能力的方法细胞增殖能力是生物学和医学研究中极为重要的指标，它反映了细胞的生长、繁殖和生命活力。
本文将详细介绍几种常用的检测细胞增殖能力的方法，以供研究者参考。
一、MTT法MTT法（甲基噻唑基四唑法）是一种经典的检测细胞增殖的方法。
其原理是利用活细胞内的琥珀酸脱氢酶将MTT还原为蓝紫色的甲臜，甲臜的量与活细胞数成正比。
具体步骤如下：1.将细胞接种于96孔板中；2.加入MTT溶液，培养一定时间；3.弃去上清，加入DMSO溶解甲臜；4.使用酶标仪测定吸光度，判断细胞增殖能力。
二、CCK-8法CCK-8法（细胞计数试剂盒-8）与MTT法类似，但操作更简便，毒性更低。
CCK-8试剂在细胞内被还原后生成橙色的甲臜，通过测定吸光度可以评估细胞增殖能力。
三、EdU法EdU法（5-乙炯基-2"-脱氧尿嘧啶法）是一种新兴的细胞增殖检测方法。
EdU是胸腺嘧啶类似物，可以代替胸腺嘧啶插入到DNA中。
通过荧光显微镜或流式细胞仪检测EdU标记的DNA，可以评估细胞增殖情况。
四、Brdu法Brdu法（5-溴脱氧尿嘧啶法）与EdU法类似，也是一种检测细胞增殖的经典方法。
Brdu在细胞周期中代替胸腺嘧啶插入DNA，通过免疫荧光或免疫组化方法检测Brdu标记的DNA，从而评估细胞增殖能力。
五、细胞计数法细胞计数法是最直接的检测细胞增殖能力的方法。
通过细胞计数板或流式细胞仪对细胞进行计数，可以直接得到细胞数量，从而判断细胞增殖能力。
六、其他方法除了以上几种方法外，还有其他检测细胞增殖能力的方法，如：1.克隆形成实验：通过测定细胞克隆的形成数量来评估细胞增殖能力；2.细胞周期分析：利用流式细胞仪检测细胞周期各阶段的细胞比例，间接反映细胞增殖能力；3.报告基因法：通过构建带有报告基因的细胞株，检测报告基因的表达水平来评估细胞增殖能力。
综上所述，检测细胞增殖能力的方法多种多样，研究者可以根据实验需求和条件选择合适的方法。
细胞增殖实验实验报告单
一、实验目的1. 掌握细胞增殖实验的基本原理和方法。
2. 学习使用MTT法和克隆形成实验法检测细胞增殖。
3. 了解细胞增殖在不同条件下的变化。
二、实验原理细胞增殖是生物体生长发育的基础，也是细胞生物学研究的重要内容。
细胞增殖实验主要包括MTT法和克隆形成实验法。
MTT法通过检测细胞线粒体中的脱氢酶活性，间接反映细胞增殖活力；克隆形成实验法则通过观察单个细胞分裂形成的克隆数量，评估细胞的增殖能力。
三、实验材料1. 细胞：HeLa细胞（人子宫颈癌上皮细胞）2. 试剂：MTT工作液、DMSO、胎牛血清、RPMI1640/DMEM培养液、0.25%胰蛋白酶-0.02%EDTA混合消化液、96孔培养板、酶联免疫检测仪、CO2培养箱、低速离心机3. 仪器：显微镜、细胞计数器、电子天平、移液器、超净工作台四、实验方法1. 细胞培养：将HeLa细胞接种于96孔培养板，每孔1000个细胞，加入200μl RPMI1640/DMEM培养液，置于37℃、5%CO2培养箱中培养。
2. MTT法：（1）培养细胞2-3天后，每孔加入20μl MTT工作液，继续培养4小时。
（2）小心吸弃孔内培养上清液，每孔加入150μl DMSO，振荡10分钟，使结晶物充分融解。
（3）在酶联免疫检测仪上测定各孔光吸收值，以时间为横坐标，吸光值为纵坐标绘制细胞生长曲线。
3. 克隆形成实验法：（1）将细胞接种于6孔板，每孔2000个细胞，加入200μl RPMI1640/DMEM培养液，置于37℃、5%CO2培养箱中培养。
（2）培养细胞至一定时间后，用0.25%胰蛋白酶-0.02%EDTA混合消化液消化细胞，制成细胞悬液。
（3）将细胞悬液稀释至适当浓度，接种于6孔板，每孔100μl。
（4）培养细胞至克隆形成，用显微镜观察并计数。
（5）计算克隆形成率。
五、实验结果1. MTT法：细胞生长曲线呈S形，细胞增殖活力随时间延长而增加。
2. 克隆形成实验法：克隆形成率随时间延长而增加，表明细胞增殖能力较强。
细胞增殖速度实验报告
一、实验目的本研究旨在通过细胞培养实验，观察细胞在不同条件下增殖速度的差异，分析影响细胞增殖的因素，为细胞生物学研究和相关疾病的治疗提供理论依据。
二、实验材料1. 实验细胞：人肺腺癌细胞株（A549）2. 培养基：DMEM培养基3. 细胞培养试剂：胎牛血清、青霉素-链霉素双抗、胰蛋白酶4. 实验仪器：细胞培养箱、显微镜、酶标仪、离心机等5. 实验试剂：CCK-8试剂盒、MTT试剂盒、细胞计数板等三、实验方法1. 细胞培养：将人肺腺癌细胞株A549接种于含有10%胎牛血清的DMEM培养基中，置于37℃、5%CO2的培养箱中培养，待细胞生长至对数生长期时进行实验。
2. 细胞增殖实验：（1）MTT实验：将细胞接种于96孔板，每孔100μl，分别设置实验组和对照组，实验组加入不同浓度的药物处理，对照组加入等量DMEM培养基。
培养24小时后，加入20μl MTT溶液，继续培养4小时。
弃去上清液，加入150μl DMSO，用酶标仪测定各孔吸光度值（OD值）。
（2）CCK-8实验：将细胞接种于96孔板，每孔100μl，分别设置实验组和对照组，实验组加入不同浓度的药物处理，对照组加入等量DMEM培养基。
培养24小时后，加入10μl CCK-8溶液，继续培养2小时。
用酶标仪测定各孔OD值。
（3）细胞计数实验：将细胞接种于细胞计数板，在显微镜下观察并计数细胞数量。
3. 数据分析：采用SPSS 21.0软件对实验数据进行统计分析，比较各组间差异。
四、实验结果1. MTT实验：实验结果显示，随着药物浓度的增加，细胞增殖能力逐渐减弱，与对照组相比，差异具有统计学意义（P<0.05）。
2. CCK-8实验：实验结果显示，随着药物浓度的增加，细胞增殖能力逐渐减弱，与对照组相比，差异具有统计学意义（P<0.05）。
3. 细胞计数实验：实验结果显示，随着药物浓度的增加，细胞数量逐渐减少，与对照组相比，差异具有统计学意义（P<0.05）。
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3.盐酸和酒精混合液（1∶1）使组织中的细胞相互分离开来， 同时将细胞杀死并固定。 4.分生区细胞大多数处于细胞分裂间期，只有少数处于分裂期。 5.由于制成临时装片 时细胞已死亡，因此不能用一个细胞观察一个连续的细胞分裂 过程。
过程设计
洋葱根尖细胞培养：实验课前3~4 d培养（温暖、常换水）， 待根长到5 cm 取材：取根尖2~3 mm 解离液：质量分数为15%的HCl溶液和95%的 酒精溶液按1∶1的体积比配制 解离 解离时间：3~5 min 解离目的：使组织中的细胞互相分离开 解离程度：根尖酥软
解析：由于实验过程“解离”，故分生区全部是死细
胞，看不到细胞内染色体的动态变化。
答案： C
2.在进行“观察植物细胞的有丝分裂”实验中，甲 ~戊 五位同学在剪取洋葱根尖后立即进行的操作步骤如下表： 操作步骤 解离 漂洗 染色 制片 观察 — + + + + + + + — + + + + + + + + + +
先低倍镜：据细胞特点找到分生区（细胞呈正方形， 排列紧密，有的细胞正在分裂） 观察 后高倍镜：先找中期细胞，后找前、后、末期细胞（ 绝大多数细胞处于间期，少数处于分裂期 。因为间期时长远大于分裂期）
易错归纳
1. 剪取生长旺盛、带有分生区的根尖，同时注意剪取的时 间，一般在上午10点至下午2点左右，此时分生区细胞分裂
基础再现
1.在高等植物体内，有丝分裂常见于根尖、芽尖等分生区细胞。 由于各个细胞的分裂是独立进行的，因此在同一分生组织中可 以看到处于不同分裂时期的细胞。 2.染色体容易被碱性染料（如龙胆紫溶液）着色，通过在高倍
显微镜下观察各个时期细胞内染色体（或染色质）的存在状态，
就可判断这些细胞处于有丝分裂的哪个时期。
观察细胞有丝分裂实验
（2009年江苏卷）有1位同学做根尖有丝分裂
实验，在显微镜中观察到的图像如下图所示。造成这种情 况的原因可能是（ ）。
①取材位置不合适 ②取材时间不合适 ③制片时压片力量不合适 ④解离时间不合适 ⑤视野选择 不合适 A．②③ B．②⑤
C．①②⑤
D．①③④
解析：由图观察，细胞多处于未分裂状态，故可能取
学生 甲 乙 丙 丁
戊
+
+
+
+
+
（ 1 ）甲观察到的实验结果是 __________ ，乙观察到的
D 实 验 结 果 是 __________ ，丙观察到的实验结果是 A __________ 。（请从下列选项中选择）
B
A．染色体未着上颜色，无法看清
B．细胞重叠，看不到染色体 C．染色体着上颜色，清晰可见 D．染色体着色很浅，模糊不清
（2）丁同学在进行上述操作后，直接在高倍镜下观察，长 时 间 未 找 到 有 丝 分 裂 的 细 胞 ， 正 确 操 作 是
使用显微镜时先用低倍镜，再用高倍镜 ________________________________________ 。
（3）戊同学观察到了许多呈长方形的细胞，但未找到有丝
分 裂 各 时 期 的 图 像 ， 可 能 的 原 因 是
热点训练
（ 2009 惠州二模）下图为显微镜下观察到的根尖分 生区处于细胞分裂不同时期的细胞图像示意图，在显时期相同
（ ）
解析：在细胞周期中，间期占的时间特别长，故处于这段
时间的细胞比例最多。
答案： B
走进实验室
实验课题：观察根尖分生组织细胞的有丝分裂
观察部位不正确（该同学看到的是成熟区细胞或伸长区细胞） ________________________________________ 。
（4）采用物理或者化学方法可以抑制细胞的有丝分裂，使
细胞停留在细胞周期的某一个阶段，如下表所示，“—”表 示停留时期。根据下表的内容回答下列问题：
时期 处理方法 秋水仙素 低温(2~4 ℃)
都能合成蛋白质，并非只有分裂期的细胞才能合成蛋
白质。处于不同的分裂期， DNA 含量可能不同，如后
期和末期 DNA 含量不同；正常的不分裂的细胞核 ，
DNA 含量都相同。在一个细胞分裂周期中，只有处于 分裂期的细胞才能形成染色体，只有在前期和中期的 细胞才能见到染色单体。洋葱根尖分生区细胞属于体 细胞，都能进行有丝分裂。
旺盛。
2.解离充分，细胞才能分散，细胞才不会重叠。 3.染色时，染色液的浓度和染色时间必须掌握好，应注意
染色不能过深，否则镜下一片紫色，无法观察细胞图像。
4.压片时用力必须恰当，过重会将组织压烂，过轻则细胞 未分散，二者都将影响观察。
精题演习
1.观察植物细胞有丝分裂装片时，找到分生区后，看 不到细胞内染色体的动态变化。其原因是（ ） A．观察时间有限 C．细胞已死亡 B．细胞分裂速度缓慢 D．观察的部位不对
________________________________________。 ③秋水仙素和低温抑制细胞有丝分裂的原理常被利用于生 产、生活或科学研究，就这两种方法各举一个在实际中的 应用实例： ________________________________________；
材时间不合适，细胞分裂不旺盛，且视野中有一些细胞为
长形，可能取自伸长区细胞，为取材位置不合适，应取分 生区细胞；也有可能是视野选择不当，没有找到合适视野 观察；由图知细胞均分散开，故不可能为③④所述原因。
答案：C
名师点睛： 以洋葱分生区细胞为知识载体，考查了
有丝分裂的有关主要知识点。生物体内所有的活细胞
装片 的制 作
漂 漂洗液：清水 漂洗时间：10 min 洗 漂洗目的：洗去组织中的解离液，有利于染色 染色液：0.01 g/mL或0.02 g/mL的龙胆紫 染 （醋酸洋红）溶液 色 染色时间：3~5 min 染色目的：使染色体（或染色质）着色 制片：用镊子尖把根尖弄碎，盖上盖玻片，复加一 块载玻片，用拇指轻压（使细胞分散开）
间期 前期 中期 后期 末期
加入过量的胸苷 — — — — — — —
①加入过量的胸苷抑制有丝分裂的最可能原因 是
抑制DNA复制
。胸苷的抑制作用是可逆的，当把过量
的胸苷去除，细胞可以恢复正常分裂。
②要观察细胞内的染色体，最好采用哪种方法处理，为什
②用秋水仙素处理。因为秋水仙素抑制纺锤体的形成，使细胞有丝分裂停留 么？ ________________________________________