primer5和oligo使用技巧概况
认证考试primer5和oligo联合设计引物步调及心得
primer5和Oligo结合设计引物步骤及心得一、引物设计step by step1、在NCBI上搜索到目的基因，找到该基因的mRNA，在CDS选项中，找到编码区所在位置，在下面的origin中，Copy该编码序列作为软件查询序列的候选对象。
2、用Primer Premier5搜索引物①打开Primer Premier5，点击File-New-DNA sequence, 出现输入序列窗口，Copy目的序列在输入框内（选择As），此窗口内，序列也可以直接翻译成蛋白。
点击P rime r，进入引物窗口。
②此窗口可以链接到“引物搜索”、“引物编辑”以及“搜索结果”选项，点击Search按钮，进入引物搜索框，选择“PCR primers”，“Pairs”，设定搜索区域和引物长度和产物长度。
在Search Parameters里面，可以设定相应参数。
一般若无特殊需要，参数选择默认即可，但产物长度可以适当变化，因为100～200bp 的产物电泳跑得较散，所以可以选择300～500bp.③点击OK，软件即开始自动搜索引物，搜索完成后，会自动跳出结果窗口，搜索结果默认按照评分（Rating）排序，点击其中任一个搜索结果，可以在“引物窗口”中，显示出该引物的综合情况，包括上游引物和下游引物的序列和位置，引物的各种信息等。
④对于引物的序列，可以简单查看一下，避免出现下列情况：3’不要出现连续的3个碱基相连的情况，比如GGG或CCC，否则容易引起错配。
此窗口中需要着重查看的包括：T m应该在55～70度之间，GC％应该在45％～55％间，上游引物和下游引物的T m值最好不要相差太多，大概在2度以下较好。
该窗口的最下面列出了两条引物的二级结构信息，包括，发卡，二聚体，引物间交叉二聚体和错误引发位置。
若按钮显示为红色，表示存在该二级结构，点击该红色按钮，即可看到相应二级结构位置图示。
最理想的引物，应该都不存在这些二级结构，即这几个按钮都显示为“None”为好。
primer5使用
引物设计的原则引物设计有3 条基本原则：首先引物与模板的序列要紧密互补，其次引物与引物之间避免形成稳定的二聚体或发夹结构，再次引物不能在模板的非目的位点引发DNA 聚合反应(即错配)。
具体实现这3 条基本原则需要考虑到诸多因素，如引物长度（primer length），产物长度（p roduct length），序列Tm 值(melting temperature)，引物与模板形成双链的内部稳定性(inte rnal stability, 用∆G 值反映)，形成引物二聚体(primer dimer)及发夹结构（duplex formation and hairpin）的能值，在错配位点（false priming site）的引发效率，引物及产物的GC 含量（composition），等等。
必要时还需对引物进行修饰，如增加限制性内切酶位点，引进突变等。
根据有关参考资料和笔者在实践中的总结，引物设计应注意如下要点：1. 引物的长度一般为15-30 bp，常用的是18-27 bp，但不应大于38，因为过长会导致其延伸温度大于74℃，不适于Taq DNA 聚合酶进行反应[2]。
2. 引物序列在模板内应当没有相似性较高，尤其是3’端相似性较高的序列，否则容易导致错配。
引物3’端出现3 个以上的连续碱基，如GGG 或CCC，也会使错误引发机率增加[2]。
3. 引物3’端的末位碱基对Taq 酶的DNA 合成效率有较大的影响。
不同的末位碱基在错配位置导致不同的扩增效率，末位碱基为A 的错配效率明显高于其他3 个碱基，因此应当避免在引物的3’端使用碱基A[3][4]。
另外，引物二聚体或发夹结构也可能导致PCR 反应失败。
5’端序列对PCR 影响不太大，因此常用来引进修饰位点或标记物[2]。
4. 引物序列的GC 含量一般为40-60%，过高或过低都不利于引发反应。
上下游引物的GC 含量不能相差太大[2][5]。
5. 引物所对应模板位置序列的Tm 值在72℃左右可使复性条件最佳。
primer5和oligo使用技巧概况
一、Primer Premier 5.0 的使用技巧简介1. 功能“Premier”的主要功能分四大块,其中有三种功能比较常用,即引物设计、限制性内切酶位点分析和DNA 基元(motif查找。
“Premier”还具有同源性分析功能,但并非其特长,在此略过。
此外,该软件还有一些特殊功能,其中最重要的是设计简并引物,另外还有序列“朗读”、DNA 与蛋白序列的互换、语音提示键盘输入等等。
有时需要根据一段氨基酸序列反推到DNA 来设计引物,由于大多数氨基酸(20 种常见结构氨基酸中的18 种的遗传密码不只一种,因此,由氨基酸序列反推DNA 序列时,会遇到部分碱基的不确定性。
这样设计并合成的引物实际上是多个序列的混和物,它们的序列组成大部分相同,但在某些位点有所变化,称之为简并引物。
遗传密码规则因物种或细胞亚结构的不同而异,比如在线粒体内的遗传密码与细胞核是不一样的。
“Premier”可以针对模板DNA 的来源以相应的遗传密码规则转换DNA 和氨基酸序列。
软件共给出八种生物亚结构的不同遗传密码规则供用户选择,有纤毛虫大核(Ciliate Macronuclear、无脊椎动物线粒体(Invertebrate Mitochon drion、支原体(Mycoplasma、植物线粒体(Plant Mitochondrion、原生动物线粒体(P rotozoan Mitochondrion、一般标准(Standard、脊椎动物线粒体(Vertebrate Mitochondr ion和酵母线粒体(Yeast Mitochondrion。
2. 使用步骤及技巧“Premier”软件启动界面如下:其主要功能在主界面上一目了然(按钮功能如上述。
限制性酶切点分析及基元查找功能比较简单,点击该功能按钮后,选择相应的限制性内切酶或基元(如-10 序列,-35 序列等,按确定即可。
常见的限制性内切酶和基元一般都可以找到。
你还可以编辑或者添加新限制性内切酶或基元。
primer premier5 使用详解
2. 安装好以后就会在程序中双击打开。
开始设计克隆目的基因的引物。
打开后的界面如图。
点FILE---NEW—DNA SEQUENCE如图所示。
输入目的基因片段，可以复制后用ctrl+V键拷贝到栏内，后应加数个N以备后续设计时加酶切位点及保护碱基，如图所示。
选中enzyme图标，将所选质粒上的多克隆酶切位点加入左栏选中OK键，分析目的基因中所含的酶切位点，选插入位点时就应排除这些酶选中primer图标，点S图标，edit primer,开始设计正义链。
软件默认引物为二-五个碱基可将鼠标点在设计框的3端从右向左删除7-9个碱基，保留16-18个配对即可在引物的5端加入选好的酶切位点并在其左侧加3个保护碱基，入该图加入HIND III酶切位点及TTA保护碱基，完成后点analyze，认为可以后点OK。
EDIT PRIMERS图标，开始设计反义链。
从3端删除7－9个碱基同正义链。
将酶切位点加在5端，应将产品目录所示的酶切位点序列从右至左加入（注意不要加反）如图加入BamH I酶切位点及CGC3个保护碱基。
完成后点analyze，认为可以后点OK。
最后分析结果如图，反义链的FALSE PRIMING可以不考虑，RATING表示引物评分也可以不考虑，主要看Tm值正义链和反义链相差不应超过3度。
GC含量不应超过60％该软件有个缺点，不能保存分析结果，只能选择打印如果设计RT-PCR检测的引物就如下所示。
同上输入目的基因片段，选SEARCH 图标，选择参数，一般选PCR primers---both—100至250个碱基，引物长短20＋/-2，search parametere中的参数可以不选，为默认设置。
点OK。
显示满足设计参数的候选结果，点OK.点SENES选择正义链，RATING表示引物评分，最好选评分高的。
点ANTI-SENSE,相同方式选择反义链。
整个一队引物评价同目的基因克隆的引物设计相同5.0。
引物设计软件Oligo使用方法介绍荧光定量PCR仪
引物设计软件Oligo使用方法介绍荧光定量PCR仪|荧光定量PCR基因扩增仪作为目前最好、最专业的引物设计软件，Oligo的功能很强，在这里我们介绍它的一些主要功能，如：普通引物对的搜索、测序引物的设计、杂交探针的设计以及评估引物对质量等等。
在正式进行引物设计前，我们首先面临的一个任务就是向Oligo程序导入模板序列，根据不同的实验情况，导入模板有三种方法：1、直接用键盘输入：a、点击file菜单中的New Sequence 浮动命令，或直接点击工具栏中的New Sequence命令，进入序列展示窗口；b、此时即可键入DNA序列；c、如果需要的话，Oligo提供碱基回放功能，在边键入时边读出碱基，防止输入错误。
点击Edit菜单中的“Readback on”即可。
2、利用复制和粘贴：当我们序列已经作为TXT文件存在或其它oligo不能直接open的文件格式，如word文件。
html 格式，这个功能就显得很有用了。
在相应文件中复制序列后在序列展示窗口粘贴，oligo会自动去除非碱基字符。
当序列输入或粘贴完成后，点击Accept/Discard菜单中的Accept浮动命令，即可进入引物设计模式。
3、如果序列已经保存为Seq格式或者FASTA,GenBank格式时，oligo就可以直接打开序列文件。
点击File菜单中的“Open”浮动命令，找到所需文件，打开即可。
进入引物设计模式后，oligo一般会弹出三个窗口，分别是6-碱基频率窗口，碱基退火温度窗口以及序列内部碱基稳定性窗口，其中的退火温度窗口是我们引物设计的主窗口，其它的两个窗口则在设计过程中起辅助作用，比如6-碱基频率窗口可以使我们很直观地看到所设计引物在相应物种基因组中的出现频率，如果我们的模板是基因组DNA或混合DNA 时，该信息就显得有用了，而内部稳定性窗口则可以显示引物的5‘端稳定性是否稍高于3’端等。
一、普通引物对的搜索：以Mouse 4E（cDNA序列）为例。
引物设计步骤与要点
①打开Primer Premier5，点击File-New-DNA seuence, 出现输入序列窗口，Copy目的序列在输入框内（选择As），此窗口内，序列也可以直接翻译成蛋白。点击Primer，进入引物窗口。
②此窗口可以链接到“引物搜索”、“引物编辑”以及“搜索结果”选项，点击Search按钮，进入引物搜索框，选择“PCR primers”，“Pairs”，设定搜索区域和引物长度和产物长度。在Search Parameters里面，可以设定相应参数。一般若无特殊需要，参数选择默认即可，但产物长度可以适当变化，因为100～200bp的产物电泳跑得较散，所以可以选择 300～500bp.
③点击OK，软件即开始自动搜索引物，搜索完成后，会自动跳出结果窗口，搜索结果默认按照评分（Rating）排序，点击其中任一个搜索结果，可以在“引物窗口”中，显示出该引物的综合情况，包括上游引物和下游引物的序列和位置，引物的各种信息等。
④对于引物的序列，可以简单查看一下，避免出现下列情况： 3’不要出现连续的3个碱基相连的情况，比如GGG或 CCC，否则容易引起错配。此窗口中需要着重查看的包括：Tm应该在55～70度之间，GC％应该在45％～55％间，上游引物和下游引物的Tm值最好不要相差太多，大概在2度以下较好。该窗口的最下面列出了两条引物的二级结构信息，包括，发卡，二聚体，引物间交叉二聚体和错误引发位置。若按钮显示为红色，表示存在该二级结构，点击该红色按钮，即可看到相应二级结构位置图示。最理想的引物，应该都不存在这些二级结构，即这几个按钮都显示为“None”为好。但有时很难找到各个条件都满足的引物，所以要求可以适当放宽，比如引物存在错配的话，可以就具体情况考察该错配的效率如何，是否会明显影响产物。对于引物具体详细的评价需要借助于Oligo来完成，Oligo自身虽然带有引物搜索功能，但其搜索出的引物质量感觉不如Primer5.
Oligo_6_Primer_Premier_5__中文说明书王
使用Oligo 6和Primer Premier 5.0等软件设计PCR引物张新宇（中国医科院肿瘤研究所，北京100021）电子邮件: zhangxy@在当今分子生物学研究中，PCR技术已成为使用最多，最广泛的技术之一。
而引物设计是PCR技术中至关重要的一环。
在PCR扩增以前，一般模板序列已被全部或部分确定。
要想扩增出理想的目的片断，一般都得通过正确设计PCR 引物。
也有的人不经过设计直接取模板序列的两个片断作为引物，这样很可能导致实验失败，如扩增出多条带（引发错配所致），不出目的带或出目的带很弱（引物引发效率低下），引物二聚体带（引物与引物之间形成稳定二聚体）等等。
现在PCR引物设计都通过计算机软件进行。
生物信息学发展至今日，具有引物设计功能的软件有很多，其中大部分是免费软件，可直接从网上下载，安装并运行。
这类软件大都简单易用，但其引物设计功能一般不很强，通过它们设计的引物常常不尽如人意，而专门进行引物设计的商业版软件功能强大，但使用起来不太容易。
本文就这一问题进行探讨。
引物设计的原则引物设计有几条基本原则：首先引物要跟模板紧密结合，其次引物与引物之间不能有稳定的二聚体或发夹结构存在，再次引物不能在别的非目的位点引起DNA聚合反应(即错配)。
围绕这几条基本原则，设计引物需要考虑诸多因素，如引物长度（primer length），产物长度（product length），序列Tm值 (melting temperature)，ΔG值(internal stability)，引物二聚体及发夹结构（duplex formation and hairpin），错误引发位点（false priming site），引物及产物GC含量（composition），有时还要对引物进行修饰，如增加限制酶切点，引进突变等。
以使用Oligo软件分析设计引物为例，笔者总结出以下的要点：1.引物的长度一般为15-30bp，常用的是18-27bp，但不能大于38，因为过长会导致其延伸温度大于74℃，即Taq酶的最适温度。
primer5中文使用说明
Primer Premier4.10Primer Premier4.0是由加拿大的Premier公司开发的专业用于PCR或测序引物以及杂交探针的设计，评估的软件，和Plasmid Premier2.02一起是该公司推出的最新的软件产品。
其主要界面同样也是分为序列编辑窗口（Genetank），引物设计窗口（Primer Design），酶切分析窗口（Restriction Sites）和纹基分析窗口（Motif）。
这里我们主要介绍其引物设计功能，其他功能的介绍请参看Plasmid Premier2.02。
打开程序首先进入的是序列编辑参看，与Plasmid Premier相比，其多了一个语音校正的功能，即在输入序列的时候，程序自动将碱基读出，以便用户进行校正，保证输入的正确和快速。
点击该界面的按钮即可进入到程序的引物设计窗口。
该界面共分为四层，最上面一层左面是5个控制按钮，用于实现引物设计中的各种功能，包括引物自动寻找，寻找结果查看和引物编辑；右边是观察两个引物在模板上结合位置的直观图以及对正链还是负链引物进行选择；第二层是显示模板和引物序列及二者间的配对情况的显示；第三层是显示两个引物的各种参数，包括给引物的打分，引物以及产物的起始位置、长度、Tm值、GC％消光系数、简并性；最后一层是给出的有关于引物的二聚体结构、发卡结构、错配情况和引物间二聚体结构的预测，左边是显示是否存在以上各种对PCR扩增有影响的结构，右边显示的是这些结构的位置，结构细节和稳定能，利用这些参数可以对引物作出可靠的评价。
下面是根据模板序列寻找引物的界面，在该界面中可以设定所要搜索的引物的类型，包括PCR引物，测序引物和杂交探针以及引物所在的链；另外也能设定搜索引物的范围，以及最终PCR产物的长度和引物的长度等。
并通过来点击按钮来设置一些搜寻参数：这些参数包括引物的Tm值，GC比，有简并性碱基，3’端稳定性，引物的稳定性，重复序列，二聚体/发卡结构和与模板及可能的杂质DNA（需要从另外的序列文件中读入）之间的错配情况，这些参数的设定可以根据要求变化，程序本身根据一定的标准分成从极高严谨性到极低严谨性5个档次。
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一、Primer Premier 5.0 的使用技巧简介
1. 功能
“Premier”的主要功能分四大块,其中有三种功能比较常用,即引物设计、限制性内切酶位点分析和DNA 基元(motif查找。
“Premier”还具有同源性分析功能,但并非其特长,在此略过。
此外,该软件还有一些特殊功能,其中最重要的是设计简并引物,另外还有序列“朗读”、DNA 与蛋白序列的互换、语音提示键盘输入等等。
有时需要根据一段氨基酸序列反推到DNA 来设计引物,由于大多数氨基酸(20 种常见结构氨基酸中的18 种的遗传密码不只一种,因此,由氨基酸序列反推DNA 序列时,会遇到部分碱基的不确定性。
这样设计并合成的引物实际上是多个序列的混和物,它们的序列组成大部分相同,但在某些位点有所变化,称之为简并引物。
遗传密码规则因物种或细胞亚结构的不同而异,比如在线粒体内的遗传密码与细胞核是不一样的。
“Premier”可以针对模板DNA 的来源以相应的遗传密码规则转换DNA 和氨基酸序列。
软件共给出八种生物亚结构的不同遗传密码规则供用户选择,有纤毛虫大核(Ciliate Macronuclear、无脊椎动物线粒体(Invertebrate Mitochon drion、支原体(Mycoplasma、植物线粒体(Plant Mitochondrion、原生动物线粒体(P rotozoan Mitochondrion、一般标准(Standard、脊椎动物线粒体(Vertebrate Mitochondr ion和酵母线粒体(Yeast Mitochondrion。
2. 使用步骤及技巧
“Premier”软件启动界面如下:
其主要功能在主界面上一目了然(按钮功能如上述。
限制性酶切点分析及基元查找功能比较简单,点击该功能按钮后,选择相应的限制性内切酶或基元(如-10 序列,-35 序列等,按确定即可。
常见的限制性内切酶和基元一般都可以找到。
你还可以编辑或者添加新限制性内切酶或基元。
进行引物设计时,点击按钮,界面如下:
进一步点击按钮,出现“search criteria”窗口,有多种参数可以调整。
搜索目的(Seach For有三种选项,PCR 引物(PCR Primers,测序引物(Sequencing Primers,杂交探
针(Hy bridization Probes。
搜索类型(Search Type可选择分别或同时查找上、下游引物(Sense/An ti-sense Primer,或Both,或者成对查找(Pairs,或者分别以适合上、下游引物为主(Co mpatible with Sense/Anti-sense Primer。
另外还可改变选择区域(Search Ranges,引物长度(Primer Length,选择方式(Search Mode,参数选择(Search Parameters 等等。
使用者可根据自己的需要设定各项参数。
如果没有特殊要求,建议使用默认设置。
然后按,随之出现的Search Progress 窗口中显示Search Completed 时,再按,这时搜索结果以表格的形式出现,有三种显示方式,上游引物(Sense,下游引物(Anti-sense,成对显示(Pairs。
默认显示为成对方式,并按优劣次序(Rating排列,满分为100,即各指标基本都能达标(如下图。
点击其中一对引物,如第1#引物,并把上述窗口挪开或退出,显示“Peimer Premier” 主窗口,如图所示:
该图分三部分,最上面是图示PCR 模板及产物位置,中间是所选的上下游引物的一些性质,最下面是四种重要指标的分析,包括发夹结构(Hairpin,二聚体(Dimer,错误引发情况(F alse Priming,及上下游引物之间二聚体形成情况(Cross Dimer。
当所分析的引物有这四种结构的形成可能时,按钮由变成,点击该按钮,在左下角的窗口中就会出现该结构的形成情况。
一对理想的引物应当不存在任何一种上述结构,因此最好的情况是最下面的分析栏没有,只有。
值得注意的是中间一栏的末尾给出该引物的最佳退火温度,可参考应用。
在需要对引物进行修饰编辑时,如在5’端加入酶切位点,可点击,然后修改引物序列。
若要回到搜索结果中,则点击按钮。
如果要设计简并引物,只需根据源氨基酸序列的物种来源选择前述的八种遗传密码规则,反推至DNA 序列即可。
对简并引物的分析不需像一般引物那样严格。
总之,“Premier”有优秀的引物自动搜索功能,同时可进行部分指标的分析,而且容易使用,是一个相当不错的软件。
二、Oligo 6.22 使用技巧简介
1. 功能
在专门的引物设计软件中,“Oligo”是最著名的。
它的使用并不十分复杂,但初学者容易被其复杂的图表吓倒。
Oligo 5.0 的初始界面是两个图:Tm 图和ΔG 图;Oligo 6.22 的界面更复杂,出现三个图,加了个Frq 图。
“Oligo”的功能比“Premier”还要单一,就是引物设计。
但它的引物分析功能如此强大以至于能风靡全世界。
2. 使用(以Oligo 6.22 为例
Oligo 6.22 的启动界面如下:
图中显示的三个指标分别为Tm、ΔG 和Frq,其中Frq 是6.22 版本的新功能,为邻近6 至7 个碱基组成的亚单位在一个指定数据库文件中的出现频率。
该频率高则可增加错误引发的可能性。
因为分析要涉及多个指标,起动窗口的cascade 排列方式不太方便,可从windows 菜单改为tili 方式。
如果觉得太拥挤,可去掉一个指标,如Frq,这样界面的结构同于Oligo 5.0,只是显示更清楚了。
经过Windows/Tili 项后的显示如图:在设计时,可依据图上三种指标的信息选取序列,如果觉得合适,可点击Tm 图块上左下角的Upper 按钮,选好上游引物,此时该按钮变成,表示上游引物已选取好。
下游引物的选取步骤基本同上,只是按钮变成Lower。
?G 值反映了序列与模板的结合强度,最好引物的?G 值在5’端和中间值比较高,而在3’端相对低(如图:Tm
值曲线以选取72℃附近为佳,5’到3’的下降形状也有利于引物引发聚合反应。
Frq 曲线为“Oli go 6”新引进的一个指标,揭示了序列片段存在的重复机率大小。
选取引物时,宜选用3’端Fr q 值相对较低的片段。
当上下游引物全选好以后,需要对引物进行评价并根据评价对引物进行修改。
首先检查引物二聚体尤其是3’端二聚体形成的可能性。
需要注意的是,引物二聚体有可能是上游或下游引物自身形成,也有可能是在上下游引物之间形成(cross dimer。
二聚体形成的能值越高,越不符合要求。
一般的检测(非克隆性PCR,对引物位置、产物大小要求较低,因而应尽可能选取不形成二聚体或其能值较低的引物。
第二项检查是发夹结构(hairpin;与二聚体相同,发夹结构的能值越低越好。
一般来说,
这两项结构的能值以不超过4.5 为好。
当然,在设计克隆目的的PCR 引物时,引物两端一般都添加酶切位点,必然存在发夹结构,而且能值不会太低。
这种PC R 需要通过灵活调控退火温度以达到最好效果,对引物的发夹结构的检测就不应要求太高。
第三项检查为GC 含量,以45-55%为宜。
有一些模板本身的GC 含量偏低或偏高,导致引物的G C 含量不能被控制在上述范围内,这时应尽量使上下游引物的GC 含量以及Tm 值保持接近,以有利于退火温度的选择。
如果PCR 的模板不是基因组DNA,而是一个特定模板序列,那么最好还进行False priming site 的检测。
这项检查可以看出引物在非目的位点引发PCR 反应的可能性。
如果引物在错配位点的引发效率比较高,就可能出假阳性的PCR 结果。
一般在错配引发效率以不超过100 为好,但对于特定的模板序列,还应结合比较其在正确位点的引发效率。
如果两者相差很大,比如在正确位点的引发效率为450 以上,而在错误位点的引发效率为130,那么这对引物也是可以接受的。
当我们结束以上四项检测,按Alt+P 键弹出PCR 窗口,其中总结性地显示该引物的位置、产物大小、Tm 值等参数,最有用的是还给出了推荐的最佳退火温度和简单的评价。
由于“Oligo”软件的引物自动搜索功能与“Primer Premier 5”的相类似,并且似乎并不比后者更好用,在此不再赘述。
其实,使用软件自动搜索引物就是让计算机按照人的要求去寻找最佳引物,如果参数设置得当将大大提高工作效率。