09-SOP-022-02 活疫苗性状检验操作规程
非禽源细胞及其制品外源病毒检验SOP之猪瘟活疫苗检测
非禽源制品外源病毒检验SOP之猪瘟活疫苗检测一、目的用于规范猪瘟活疫苗的外源病毒检验。
二、适用范围适用于猪瘟活疫苗制品的外源病毒检验。
三、检验1.注意事项1.1检验所用原材料应符合有关规定。
如所选细胞应纯净无污染。
1.2荧光染色检查法使用直接免疫荧光抗体检测和间接免疫荧光抗体检测均可，直接免疫法是直接用FITC标记的单特异性抗体荧光检测，间接免疫法是用单特异性抗体和FITC标记的二抗进行荧光检测直接。
该SOP介绍直接荧光操作法。
1.3严格无菌操作，防止交叉污染。
2.仪器设备与试剂及物品准备2.1仪器设备恒温培养箱、CO2培养箱、低速离心机、普通显微镜、荧光显微镜、水浴锅等。
2.2试剂0.25％EDTA胰酶溶液、MEM营养液、PBS（PH7.2）、PPV荧光多抗、BVDV荧光多抗（北京兰伯瑞生物技术有限公司）、灭活胎牛血清、双抗（100ug/ml）、0.2％豚鼠红细胞悬液、0.2％鸡红细胞悬液、吉姆萨染色剂等。
2.3阳性对照用毒种牛病毒性腹泻病毒/粘膜病病毒（BVDV）：OregonC24V（美国）、NADL株（美国）或其它毒株；（现用毒株为OregonC24V）猪细小病毒（PPV）：NADL-2株、7909株或其它毒株；(现用毒株BJ-2株)2.4培养液：生长液为含5-10％新生牛血清，维持液为含2-3％新生牛血清。
3.检验步骤3.1复苏Vero、MDBK、PK15（或ST）细胞，经传代1-2次培养，细胞生长良好，均匀铺成单层，即可用。
3.2样品处理每批样品取2-3瓶。
将样品混合稀释至1ml疫苗应至少含10头份。
兔源产品由于保护剂和组织的影响，可以5000-8000r/min 10min离心取上清接种细胞，细胞源可以直接接种细胞。
3.3接种细胞：取处理好的样品至少10头份/ml，接种已长好的Vero、MDBK、PK15（或ST）各一瓶，置37℃吸附1小时，吸附后加维持液置5％CO2 37℃培养（如果样品保护剂浓度仍高可能影响细胞生长，可弃去液，涮一次，再加维持液培养）。
猪瘟活疫苗
附件3猪瘟活疫苗（传代细胞源）等4种兽药产品质量标准、说明书和标签一、猪瘟活疫苗（传代细胞源）质量标准、说明书和内包装标签（一）猪瘟活疫苗（传代细胞源）质量标准猪瘟活疫苗（传代细胞源）Zhuwen Huoyimiao(ChuandaiXibao Yuan)Classical Swine Fever Vaccine, Live(Cell Line Origin)本品系用猪瘟病毒兔化弱毒株（CVCC A V1412）接种易感传代细胞培养，收获培养物，加适宜稳定剂，经冷冻真空干燥制成。
用于预防猪瘟。
【性状】淡黄色海绵状疏松团块，易与瓶壁脱离，加稀释液后迅速溶解。
【无菌检验】按现行《中国兽药典》附录进行检验，应无菌生长。
【支原体检验】按现行《中国兽药典》附录进行检验，应无支原体生长。
【外源病毒检验】按现行《中国兽药典》附录进行检验，应无外源病毒污染。
【鉴别检验】将疫苗用灭菌生理盐水稀释成为每毫升含有100个兔MID的病毒悬液，与等量的抗猪瘟病毒特异性血清充分混合，置10~15℃作用60分钟，其间振摇2~3次。
同时设立病毒对照和生理盐水对照。
中和结束后，分别耳静脉注射兔2只，每只1.0ml，按效力检验（1）项进行观察和判定。
除病毒对照组应出现热反应外，其余2组在接种后120小时内应不出现热反应。
【安全检验】选用无猪瘟病毒中和抗体（检测方法见附注）的健康猪，接种前观察5~7日，每日上、下午各测体温1次。
挑选体温、精神、食欲正常的使用。
每批疫苗按瓶签注明头份用灭菌生理盐水稀释成每毫升含6头份，肌肉注射猪5头，每头5.0ml(含30头份)。
接种后，每日上、下午各观察并测体温1次，观察21日。
体温、精神、食欲与接种前相比没有明显变化；或体温升高超过0.5℃，但不超过l.0℃，稽留不超过4个温次；或减食不超过l日，疫苗可判为合格。
如果有l头猪体温升高l℃以上，但不超过1.5℃，稽留不超过2个温次，疫苗也可判为合格。
免疫技术产品标准操作规程
免疫技术产品标准操作规程目录：一、灭活疫苗的制备二、诊断试剂盒的制备三、免疫球蛋白的制备一、灭活疫苗的制备的标准操作规程（SOP）1.执行范围：生产部门、质检部门、质量保证部门、工程设备部门、物流部2.目的：明确灭活疫苗的生产环境、生产流程、检验环节和人员要求，保证遵循全面质量管理使生产顺利进行，保证产品质量。
3.生产环境要求：3.1洁净级别：生产当中菌种筛选和包装工艺过程要求100级或局部100级洁净区内完成，具体要求：最大允许尘埃粒子数/平方米最大允许微生物数/平方米≥0.5um ≥5um 浮游菌沉降菌3500 0 5 1扩大培养工艺过程要求10万级洁净区内完成，具体要求：最大允许尘埃粒子数/平方米最大允许微生物数/平方米≥0.5um ≥5um 浮游菌沉降菌3500000 20000 500 103.2温湿度要求洁净区的温度为18-26度，相对湿度为45%-65%。
3.3其他条件（1）洁净车间与外界正压差≥10Pa；（2）洁净车间与工艺走廊或不同洁净度车间之间正压差≥5Pa。
4.人员要求：4.1健康要求：不得患有传染病，皮肤病（包括体表不得有创伤），不得对生物制品质量产生潜在的不利影响。
从事助检查的工作人员应达到裸视4.9校正视力5.0以上，应无色盲的视力标准。
进入生产区人员应注射相应疫苗，并且每年体检一次。
4.2服饰要求：不可以戴首饰，头发上不可以打发胶之类的物品。
所穿的衣服是分身的猴服。
5.工作流程控制要求：5.1人员进入洁净区流程坐在鞋柜上换鞋→用酒精消毒手→穿衣（顺序是由上到下，帽子、上衣、裤子，帽子完全包住头发，上衣完全放到裤子里）→戴上口罩和一次性橡胶手套→进入洁净工作区。
5.2 工作前检查5.2.1检查上一次的清场是否在有效期之内，不合格的要先做清场。
5.2.2检查并记录时间、温湿度等常规条目。
5.2.3检查设备和物料准备情况。
对购买的微孔反应板进行质量检测。
5.3工作流程5.3.1菌种筛选参照工作指导手册，筛选出免疫原性强，生物活性好的菌种。
流行性乙型脑炎灭活疫苗制造及检定规程
流行性乙型脑炎灭活疫苗制造及检定规程流行性乙型脑炎（下称乙脑）灭活疫苗是将乙脑病毒接种于地鼠肾细胞，培育后收获病毒液，加入甲醛溶液将病毒杀死后制成。
用于预防乙脑。
1 毒种1.1 毒种来源P3株病毒，每3～5年应用新分离的乙脑流行株病毒检查P3株的保护力，以了解该毒株的有效性。
P3株干燥毒种由中国药品生物制品检定所分发。
1.2 毒种检定1.2.1 无菌试验毒种启封和每次传代后均需做无菌试验，合格者方可使用。
1.2.2 病毒滴定每正代必须用体重7～9g小白鼠进行脑内滴定，滴度≥9.0LogLD50/1.0ml可用于生产。
1.2.3 纯毒试验生产前和生产末期用小白鼠做脑内法中和试验，以鉴定毒种的特异性。
所用特异性抗血清由中国药品生物制品检定所提供。
中和指数必须在500以上。
生产过程中如对毒种发生疑问，应及时进行鉴定。
1.3毒种传代分正亚代传递。
从检定所取回的干燥毒种传递不超过15代称正代，由正代传递一代直接用于生产称亚代。
每次用于传代的毒种不得少于3个鼠脑。
传代时选用体重7～9g健康小白鼠或乳鼠，脑内接种病毒，72小时后选眼结膜正常，有典型痉挛战粟、肢体麻痹的小白鼠，无菌取脑并进行无菌试验。
1.4 毒种保存鼠脑毒种收剖经无菌试验后立即保存于-60℃以下，无菌试验通过后方可使用。
亦可将鼠脑毒种研磨乳化制成10%脑悬液，分装小瓶冻存于-60℃以下，无菌试验合格后备用。
2 疫苗制造2.1 细胞制备2.1.1 地鼠选用健康地鼠。
如发现肾脏异常或有乳糜状腹水，应废弃。
2.1.2 细胞消化及培养取肾剪碎，用适量的胰蛋白酶溶液消化。
用营养液分散细胞，制备细胞悬液，分装培养瓶，于37℃进行培养。
营养液中牛血清含量不得超过8%。
2.1.3 外源因子检查每生产批细胞留5%（或不少于500ml）悬液作为对照细胞检查外源病毒。
该细胞除不接种病毒外，细胞浓度和处理均与生产过程平行进行，至原液收获之日用显微镜观察，应无病变发生。
疫苗杂菌计数和病原性鉴定
杂菌计数和病原性鉴定以及沙门氏菌检验只允许非病原性杂菌如果允许制品中含有一定数量非病原菌，应进一步作杂菌计数和病原性鉴定。
一、杂菌计数1、（药典）每批有杂菌污染的制品至少取样3瓶，用普通肉汤或蛋白胨水分别按头（羽）份数作适当稀释，接种含4%血清及0.1%裂解血球全血的马丁琼脂培养基平皿上，每个样品接种平皿4个，每个平皿接种0.1ml（禽苗的接种量不少于10羽份，其他产品的接种量按各自的质量标准），置37℃培养48小时后，再移至25℃放置24小时，数杂菌菌落，然后分别计算杂菌数。
如果污染霉菌，亦作为杂菌计算。
任何1瓶制品每头（羽）份（或每克组织）的杂菌应不超过规定。
超过规定时，判该批制品不合格。
2、操作：A.马丁琼脂和蛋白胨水（或普通肉汤）配制B.37℃温箱放置血清（先无菌取出10ml）和全血（避免加入培养基中出现絮状物）C.待马丁琼脂在65℃左右，加入4%血清和0.1%裂解血球全血，混匀，铺板（每批对应12+1平板）D.倒扣平板于37℃干燥半小时E.用蛋白胨水或普通肉汤（即营养肉汤）稀释至200羽份/0.1ml，每个平皿接种0.1ml，每批产品至少取3份样品，每份样品接种4个平板，铺匀。
F.将平板至37℃培养48小时，再移至25℃培养24小时。
G.计算菌落数平均值，在要求范围内可进行下一步----病原性鉴定。
附注：裂解血球全血：-15分装冻存，使用前取出（网上）培养基鉴定：将培养基放37℃温箱内培养24小时后，证明是否无菌，同时用已知菌种检查在此培养基上生长繁殖及生化反应情况，符合要求者方可使用。
禽苗----胚苗不超过1个非病原菌细胞苗无菌猪苗----猪瘟兔源≤75个/头份猪瘟细胞源无菌二、病原性鉴定对杂菌进行病原性鉴定需氧菌：（药典）将所有污染需氧性杂菌的液体培养管的培养物等量混合后，移植1支TG管或马丁（肉）汤，置相同条件下培养24小时，取培养物，用蛋白胨水稀释100倍，皮下注射0.2ml体重在18-22g的小鼠3只，观察10日。
口服脊髓灰质炎活疫苗制造及检定规程
口服脊髓灰质炎活疫苗制造及检定规程口服脊髓灰质炎活疫苗系用具有高度抗原性的脊髓灰质炎I、n、田型减毒株，分别接种于猴肾或人二倍体细胞培养制成的单价或三价液体疫苗。
用于预防脊髓灰质炎。
A、猴肾细胞脊髓灰质炎活疫苗1毒种1.1毒种来源可用Sabin株，Sabin纯化株，中n 17,中田2株。
所有疫苗生产用毒株均须经卫生部批准。
1.2毒种批1.2.1毒种批制备与保存毒种批用原毒株在猴肾细胞或人二倍体细胞上制备。
从原毒株算起，Sabini、n型、中n 17及中田2型传代次数均不得超过3代，Sabinin型不超过2代。
所有毒种均应于-60C以下保存。
1.2.2毒种批检定每一毒种批均按A3项分批检定（滴度不得低于6.5LogPFU/1.0ml ) O2疫苗制备生产用房应为独立的单元，不得携入或操作强毒株或其他病毒、致病菌。
生产前，应对生产区进行消毒。
工作人员必须经过专业培训，身体健康，并服用脊髓灰质炎活疫苗。
每年生产前应进行体检。
传染性肝炎、痢疾、活动性肺结核患者不得进入生产部门。
在猴区工作的人员不得患有肺结核。
2.1猴肾细胞制备2.1.1动物选择和检疫用未做过其他试验或做过本疫苗检定的健康狮猴制备细胞培养物。
所用动物隔离检疫应不少于6周，应无结核、B病毒感染及其他急性传染病。
凡有严重化脓灶、赘生物以及明显的肝、肾病理改变者不得用于制备疫苗。
2.1.2细胞消化与培养采用电磁搅拌或灌注法以胰蛋白酶或其他分散剂消化猴肾细胞。
细胞培养瓶置37±0.5C培养，应于9天内长成单层。
每只猴所获细胞为一个细胞批。
可把原代猴肾细胞连续传5代后，用于接种病毒2.2病毒接种、培育与收集细胞维持液含3.0〜5.0g/L碳酸氢钠(pH7.6〜7.8)。
病毒接种量为0.01〜0.5MOI,种毒后置33±0.5 C培养，出现完全病变时间应在40〜96小时。
病毒液按细胞批收集于大瓶中，澄清过滤。
2.3病毒液合并或浓缩病毒液合并或浓缩时可用0.2以m的滤膜过滤。
组织苗工艺规程及SOP
组织苗工艺规程及SOP组织苗工艺规程及SOP鸡新城疫低毒力活疫苗（L系、Ⅱ系、F系、）工艺规程一、目的：规定制造鸡新城疫低毒力活疫苗L系（Ⅱ系、F系）的方法和程序。
二、适用范围：适用于鸡新城疫低毒力活疫苗L系（Ⅱ系、F系）生产的全过程。
三、依据：《鸡新城疫低毒力活疫苗制造及检验规程》。
四、责任者：生产部各岗位。
五、正文：1工艺流程图2 鸡新城疫低毒力活疫苗L系（Ⅱ系、F系）控制要点Ⅱ操作细则：1 鸡胚孵化2 生产用毒种的制备2.1 条件准备2.2 操作规则2.2.1 毒种繁殖2.2.2 毒种鉴定2.3 清场和记录3 半成品的制备3.1条件准备3.2 操作规则3.3 半成品检验3.4 清场和记录4 疫苗的配制5 疫苗的分装6 疫苗的冻干7 轧盖、贴签Ⅲ成品质量标准见《鸡新城疫低毒力活疫苗成品质量内控标准》。
检验方法见《鸡新城疫低毒力活疫苗成品检验操作规程》。
鸡胚孵化操作规程一、目的：确保鸡胚孵化工作的质量。
二、适用范围：适用于鸡胚孵化工序。
三、责任者：生产车间鸡胚孵化工序操作人员。
四、正文：将送来的生产用SPF鸡蛋送到车间由专用窗口传入车间洗蛋间，放置到用蛋盘中进入熏蒸间经福尔马林熏蒸处理后，再进入孵化器内进行孵化。
（一）孵化前准备1 孵化器2 蛋盘3 种蛋4 批号（二）孵化1 入蛋2 检查3 孵化中应作的工作（三）清场与记录病毒的复制、病毒的遗传与进化（一）病毒的复制根据病毒的一步生长曲线，观察到病毒有复制周期，包括吸附、穿入与脱壳、生物合成、组装及释放等步骤。
特异性吸附是病毒表面分子与细胞受体结合的结果，血凝作用的本质也是病毒与细胞受体的结合。
穿入与脱壳可发生在细胞膜、内吞小体及核膜，因病毒种类而异。
在隐蔽期病毒进行活跃的生物合成，此时完成mRNA的转录及蛋白质的合成,病毒转录的方式各不同,也许值得注意的特点。
翻译的蛋白质有尚需后加工，如糖糖基化。
酶裂解等。
结构简单的无囊膜20面体病毒依壳可自我组装。
有声活疫苗免疫
正确免疫前提是保定
• 小鸡一人操作，左手将鸡头水平放置，一侧 面部向上，左手食指堵住下侧鼻孔，右手持 瓶距眼、鼻2厘米垂直滴入，待疫苗吸收后 轻放鸡只。 • 大鸡一人拿鸡，一人如上操作。
• 点口用于球虫或法氏囊疫苗的免疫：操作基 本如上，拿鸡使鸡口向上，左手打开鸡嘴， 右手持瓶距口2厘米垂直滴入舌根，待鸡有 吞咽动作后轻放鸡只。
准备工作
1、器械消毒，物品备足
2、禽群的健康状况检查 • 有病或不健康禽群不宜接种 • 在恶劣气候条件下也不应该接种 3、免疫接种前后，加强饲养管理
冻干苗的保存
1、耐热冻干苗一般保存在2-8℃，最好4℃。 当保存这个温度时，在有效期内是不会失 效的。 2、无耐热保护的冻干苗是-15℃保存。 3、液氮马立克在-196度液氮面以下保存。 4、稀释液建议2-8度冷藏避光保存。
• 将接种针充分插入疫苗溶液中，待针槽充满药液 后，将针轻靠小瓶内壁，除去附在针上的多余药 滴。
• 轻轻展开鸡翅，将针插入鸡翅翼膜内侧。
• 刺种针勿接触鸡羽
• 刺种时，应小心拨开鸡羽，注意勿伤及肌肉、关 节、 血管、神经和骨头 • 给2周龄以下小鸡接种时，最好每接种一瓶疫苗 (500-1000鸡)换一枚刺种针
影响饮水免疫的三大因素
鸡群因素
免疫能力 饮水量
疫苗因素
操作因素
病毒在水中稳定性 疫苗量 病毒的侧向扩散 断水时间
母源抗体水平
饮水位 环境温度 社会等级
病毒的免疫原性
免疫接种时间 病毒浓度
水质
饮水器类型、卫生 投放疫苗的方法
• • • •
4、喷雾免疫 设备-雾滴大小、压力稳定 环境-风速、湿度、灰尘 鸡群-日龄、健康、集中
5、解冻或开启的疫苗，尽量在2小时内用完 ，避免解冻或开启的疫苗再冻结后使用、 避免阳光直射、高温、消毒剂接触。 6、⑴免疫用水温度不得超过20℃， ⑵不得含有氯离子和其他消毒剂。 7、免疫最好在早晨或傍晚进行 是非常有效的局部免疫接种方 法，同时能激发机体的全身免疫，鼻腔下 有丰富的淋巴样组织，眼部有哈德氏腺， 对抗原都能产生很好的免疫应答。 常见：新城疫、新-支、传喉、霉形体等
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
1.目的
制定活疫苗性状检验操作规程，指导活疫苗性状检验操作。
2.适用范围
适用于活疫苗性状检验操作。
3.定义和缩略词
无。
4.角色与职责
QC经理和主检人负责相关操作人员培训，确保操作按照规程进行。
5.健康与安全
无。
6.材料
无菌TG培养基
10 mL一次性注射器
75%酒精
待检样品
7.程序
外观检验用的10瓶疫苗即为无菌检验用疫苗，在无菌检验前进行外观检验。
7.1.准备
每批成品疫苗抽取10瓶作为待检样品。
将待检样品取出一字排列于工作台面。
7.2.检验
所有的观察均在正常的实验室光照条件下，肉眼观察。
7.2.1.冻干活疫苗
逐个观察冻干块的颜色，检查冻干块是否有异物、干缩、变质。
摇动疫苗瓶，检查冻干块是否容易和瓶壁脱离。
用手转动铝塑盖的铝盖部分，检查是否能转动。
检查疫苗瓶的标签是否打印上批号、生产日期、有效期至，打印的文字是否清晰可
辨。
用手揭去铝塑盖的塑片，消毒注射胶塞穿刺部位。
用10 mL一次性注射器吸取2mL无菌TG培养基，从针刺部位穿过胶塞注入待检样品瓶内，摇晃疫苗瓶，检查冻干块是否迅速溶解。
溶解后，检查每个疫苗瓶里是否有异物、凝块、絮状物。
7.3.结果判定
7.3.1.冻干苗活疫苗
冻干苗为海绵状疏松团块，易与瓶壁脱离，加稀释液后能迅速溶解。
疫苗瓶内应无异物，溶解后无凝块、无絮状物。
冻干块应无干缩、无变质。
铝塑盖应不能转动。
瓶签打印有批号、生产日期、有效期至，打印的文字清晰可辨。
活疫苗的颜色见附表1。
8.文件历史
附表一：活疫苗颜色。