第十三章_分子标记及基因芯片技术应用
分子标记技术在医学和动植物育种中的应用
分子标记技术在医学和动植物育种中的应用分子标记技术是一种基于DNA的分子生物学技术，可以对DNA进行检测和分析，常用于检测遗传变异和分析DNA序列。
在医学和动植物育种中，分子标记技术已经成为了重要的工具，可以帮助研究人员更好地理解遗传特征及其对健康和生产的影响，同时也可以更精确地选择和筛选适合的基因型和生物品种。
一、医学中的应用1.疾病诊断和预测分子标记技术在疾病诊断和预测方面的应用已经成为了研究热点。
通过检测特定的基因或DNA序列，可以帮助诊断和预测某些疾病的风险，例如某些遗传性疾病、癌症、心血管疾病等。
同时，也可以通过比较个体DNA序列的变异情况，筛选出一些与疾病发生相关的基因。
2.药物研究和开发分子标记技术不仅可以用于疾病诊断和预测，还可以帮助研究人员更深入地理解药物的作用机制。
通过检测药物与特定基因的互作关系，可以更好地预测药物的疗效和不良反应，从而提高药物研发的效率和成功率。
3.个性化治疗分子标记技术可以为医生提供更为个性化的治疗方案，根据患者特定基因和DNA序列的变异情况，选择更为适合的治疗方法和药物。
这种个性化治疗可以提高治疗效果和减少不良反应的发生，为患者提供更好的医疗保障。
二、动植物育种中的应用1.物种鉴定和遗传分析分子标记技术可以帮助研究人员对不同物种进行鉴定和分类，通过比较DNA序列的变异情况，确定它们的亲缘关系和进化历史。
同时，也可以对动植物遗传特征进行分析，筛选出与生产和营养有关的重要基因。
2.育种和优化品种分子标记技术可以帮助育种人员更精确地选择和筛选适合的基因型和生物品种。
通过检测目标基因或DNA序列的变异情况，可以确定优良品种的遗传特征和适应能力，从而提高人工育种的效率和成功率。
同时，也可以帮助优化品种的营养价值，提高农产品的质量和产量。
3.环境保护和资源管理分子标记技术可以帮助研究人员更好地了解各种野生动植物的生态环境和适应能力，从而制定更为科学和有效的环境保护和资源管理策略。
DNA分子标记技术的研究与应用
DNA分子标记技术的研究与应用一、本文概述本文旨在对DNA分子标记技术的研究与应用进行全面的概述。
DNA分子标记技术作为现代分子生物学领域的一项重要工具，已经在生物学研究、遗传育种、疾病诊断等多个领域展现出广泛的应用前景。
本文首先介绍了DNA分子标记技术的基本概念、发展历程以及主要类型，包括限制性片段长度多态性（RFLP）、随机扩增多态性DNA（RAPD）、扩增片段长度多态性（AFLP）和单核苷酸多态性（SNP）等。
接着，文章详细阐述了这些技术在不同领域中的具体应用，包括基因克隆、基因定位、遗传图谱构建、物种亲缘关系分析、基因表达和调控研究等。
本文还讨论了DNA分子标记技术在实践应用中面临的挑战和未来发展趋势，如高通量测序技术的结合、大数据分析的利用以及生物信息学的进一步发展等。
通过本文的综述，旨在为相关领域的研究人员和技术人员提供一个全面、深入的了解DNA分子标记技术的平台，以促进该技术的进一步发展和应用。
二、DNA分子标记技术的基本原理与类型DNA分子标记技术是一种直接以DNA多态性为基础的遗传标记技术，其基本原理在于利用DNA分子在基因组中存在的丰富的多态性，通过特定的技术手段将这些多态性转化为可识别的遗传信息，从而实现对生物个体或群体的遗传差异进行精确分析。
这种技术以其高度的准确性、稳定性和多态性，在生物学研究、遗传育种、种质鉴定、基因定位、分子育种、疾病诊断等领域中得到了广泛应用。
基于DNA-DNA杂交的分子标记技术：这类技术主要包括限制性片段长度多态性（RFLP）和DNA指纹技术。
它们通过比较不同个体或群体间DNA片段的杂交信号差异，揭示出基因组中的多态性。
这类标记具有稳定性高、共显性遗传等特点，但操作复杂、成本较高。
基于PCR的分子标记技术：随着聚合酶链式反应（PCR）技术的出现和发展，基于PCR的分子标记技术应运而生。
这类技术包括随机扩增多态性DNA（RAPD）、扩增片段长度多态性（AFLP）和序列特征化扩增区域（SCAR）等。
分子标记技术及其应用
RFLP
1.1 基于Southern杂交的分子标记
小卫星DNA又称数目可变串联重复序列 （Variable Number of Tandem Repeat，VNTR）是一种重复DNA小序 列，为10-几百核苷酸，拷贝数10-10000 不等。
– 缺点：多态性分布集中，合成探针困难，应 用并不广泛。
Right primer
SBE1 CAPS marker derived from 3’-end was used to detect SBE1 gene in DH lines
SCAR标记
1.2 基于PCR技术的分子标记
简单重复序列（Simple Sequence Repeat， SSR）或称微卫星DNA（Microsatellite Repeat）、简单串联重复序列（Short Tandem Repeat Polymorphism，STRP）。 –在真核生物中，存在许多2-5bp简单重复序 列，称为“微卫星DNA”其两端的序列高度保 守，可设计双引物进行PCR扩增，揭示其多 态性。
–酶切扩增多态性序列（Cleaved Amplified Polymorphic Sequence，CAP） –序列特异性扩增区（Sequencecharacterized Amplified Region，SCAR） 和位点特异相关引物（Allele－Specific Associated Primers，ASAP）
–无种属特异性 –适合于自动化分析 –不需制备探针、杂交等程序，成本较低。 –DNA用量少，允许快速、简单地分离基因组 DNA。
1.2 基于PCR技术的分子标记
RAPD缺点：
–是一种显性标记 –稳定性较差
1.2 基于PCR技术的分子标记
分子标记诊断在疾病诊断中的应用
分子标记诊断在疾病诊断中的应用随着科技的不断进步和发展，分子生物学在医学领域中越来越受到重视。
分子标记诊断是基于分子生物学技术研究和诊断疾病的一种方法，它具有快速、灵敏、特异性强等优点，已经成为现代医学中不可或缺的重要手段。
一、分子标记诊断的原理和方法分子标记诊断基于分子遗传学和生物化学的知识和技术，通过检测体内分子水平（包括DNA、RNA、蛋白质等）的变化或表达来诊断疾病。
主要方法包括：1. PCR技术PCR技术是一种重复扩增DNA片段的方法，可使少量DNA片段扩增至足够分析的数量。
PCR技术可以用于检测各种病原体，包括病毒、细菌等。
2. 基因芯片技术基因芯片技术是一种高通量的基因检测方法，它可以同时检测几千至几万个基因的表达情况。
基因芯片技术可以被用于检测癌症等疾病的基因组变化。
3. 蛋白质芯片技术蛋白质芯片技术是一种高通量的蛋白质检测方法，可以检测几百至几千种蛋白质的表达情况。
蛋白质芯片技术可以用来诊断蛋白质相关的疾病，比如心肌梗死、癌症等。
二、分子标记的应用1. 个体化治疗基于分子标记的诊断方法可以帮助医生诊断病情，制定更为精准的治疗方案。
通过对病人的基因信息和分子水平的检测，可以根据不同的基因型和表达情况，制定个体化治疗方案，提高疾病治疗的效果。
2. 疾病早期诊断基于分子标记的诊断方法可以检测出疾病早期的产生，帮助医生在疾病发作前进行早期诊断和治疗。
比如，基于分子标记的疾病诊断方法可以帮助医生早期发现癌症等病症，帮助患者及时治疗，并提高治疗效果。
3. 疾病预测基于分子标记的诊断方法可以根据基因型、表达情况等信息，预测疾病的发展趋势，帮助医生针对预测的结果采取治疗措施。
比如，通过检测某些基因的异常表达可以预测心脏病等疾病的发生概率，从而采取预防措施。
三、分子标记诊断的发展趋势随着技术的不断进步和发展，分子标记诊断在医学领域中的应用越来越广泛。
未来，分子标记技术将越来越成熟，应用场景也会越来越多样化。
分子标记技术及其在植物基因组研究中的应用
分子标记技术及其在植物基因组研究中的应用基因有限公司市场/技术支持部本文献汇编包括以下内容:1, 遗传标记简介2, 分子标记介绍3, 两种重要的分子标记技术AFLP和SNP及其在植物基因组研究中的应用4, 有关仪器介绍1)LI-COR公司的GLOBAL IR2 系统2)PYROSEQUENCING公司的PSQ96 DNA系统一, 遗传标记简介以下内容摘自:邱芳伏健民金德敏王斌,遗传多样性的分子检测,生物多样性,1998年5月,第6卷,第2期选读材料:梁明山等,遗传标记及其在作物品种鉴定中的应用,植物学通报,2001年3月,第18卷,第3期遗传标记(genetic markers)是基因型的特殊的易于识别的表现形式.遗传标记的发展过程主要分为4种类型：（1）形态标记(morphological markers)；（2）细胞标记(cytological markers)；（3）生化标记(biochemical markers)；（4）分子标记(molecular makers)。
前3种标记都是基因表达型的标记，可利用的多态位点较少，易受环境影响，不能满足物种资源鉴定的需要。
直到1980年美国Botstein提出DNA限制性酶切片断长度多态性（RFLP）可以作为遗传标记，开创了直接应用DNA多态性发展遗传标记的新阶段。
80年代DNA多聚酶链式反应（PCR）技术的出现，又推动产生了许多新型的分子标记如RAPD标记，SSR标记等。
1992年由Zebeau和Vos发展起来的扩增片段长度多态性（AFLP）技术被认为是迄今为止最有效的分子标记，既有RFLP的可靠性，又有RAPD的方便性。
分子标记的飞速发展促进了真核生物遗传图谱的构建，目前人类和各主要作物的RFLP遗传图谱已基本完成，可以提供基因组各基因间相互作用的全面信息，观察到群体内和群体间由于位点间互作引起的变异分化，在基础理论、遗传育种和物种进化等方面显示出重要应用价值。
分子标记技术及其应用ISSR
Dissolve by stirring at 37℃, adjust volume to final with ddH2O.
பைடு நூலகம்
Running Acrylamide Gels
Installation of plates
✓ Mount the gel with the short glass plate inwards in the electrophoresis apparatus. Make sure that the buffer valve is closed.
✓ Pour 500 ml 1x TBE into the upper chamber and rinse between the plates with a syringe containing some buffer.
✓ If no buffer leaks from the upper chamber can be found, 500 ml 1x TBE can be poured into the lower chamber.
5′锚定引物 NNNN(CA)n
3′锚定引物 NN(CA)n
锚定ISSR-PCR示意图
CACACACACACACACA GTGTGT GTGTGTGTGT
3′锚定引物的PCR产物
GTGTGT GTGTGT GTGTGTGT GTGTGTGT CACACACACACACACACACACACACACA
Detect of PCR product and statistical analysis
0.5～2.0% Agarose gel electrophoresis
EB staining
6％ PAGE
分子标记的应用
Young等人提出近等基因系法 Near等人提出近等基因系法（ （一）Young等人提出近等基因系法（NearLines，NILs） isogenic Lines，NILs）它是通过杂交及多代回 交或自交分离而获得的（一般6 ），除了目 交或自交分离而获得的（一般6-8代），除了目 标基因外，控制其它性状的位点同轮回亲本（RP） 标基因外，控制其它性状的位点同轮回亲本（RP） 基本一致， 基本一致，该系与原来的轮回亲本就构成了一对 近等基因系。 近等基因系。 Michelmore等人 1991） 等人（ （二）Michelmore等人（1991）提出了混合群体 分组分析法（ Analysis， 分组分析法（Bulked Segregant Analysis， BSA）。利用BSA法不需创造近等基因系，利用F2 ）。利用BSA法不需创造近等基因系 BSA）。利用BSA法不需创造近等基因系，利用F2 BC1的分离群体即可完成标记 简单易行， 的分离群体即可完成标记， 或BC1的分离群体即可完成标记，简单易行，目 前在辅助选择研究中占据了重要位置, 前在辅助选择研究中占据了重要位置,其前景也 非常广阔。NILs与BSA的结合运用 的结合运用， 非常广阔。NILs与BSA的结合运用，加速了与目 的基因紧密连锁标记的建立与鉴定。 的基因紧密连锁标记的建立与鉴定。
应用cDNA AFLP技术进行杂种优势机 应用cDNA－AFLP技术进行杂种优势机 cDNA－ 理的研究表明， 理的研究表明，强优势与弱优势组合 间基因表达有明显差异，有增强型、 间基因表达有明显差异，有增强型、 减弱型和沉默型。 减弱型和沉默型。 杂种优势表现与单亲沉默、双单亲沉 杂种优势表现与单亲沉默、 默有密切关系。 默有密切关系。
展望
随着分子标记技术已飞速发展，该技术已 随着分子标记技术已飞速发展， 被广泛应用于作物遗传研究中。已在玉米、 被广泛应用于作物遗传研究中。已在玉米、 大豆等植物育种和生产中有许多应用研究， 大豆等植物育种和生产中有许多应用研究， 主要集中在基因定位、 主要集中在基因定位、辅助育种等方面的 应用研究工作，取得了一些应用成果。 应用研究工作，取得了一些应用成果。 分子标记技术与提取程序化、 分子标记技术与提取程序化、电泳胶片分 析自动化、信息(数据) 析自动化、信息(数据)处理计算机化的结 必将加速遗传图谱的构建、基因定位、 合，必将加速遗传图谱的构建、基因定位、 基因克隆、 基因克隆、物种亲缘关系鉴别及相关的致 病基因的诊断和分析。 病基因的诊断和分析。 常规育种和现代分子技术的结合必将加快 创新品种的开发和应用！ 创新品种的开发和应用！
分子标记技术
CAPACITY
RFLPs
HiSpeed sequ
DArT SNPs Multi-SSRs SRAP, TRAP SSRsAFLPs RAPDs
1985
1990
1995
2000
2 分子标记来源于DNA水平的突变
突变(Mutation)是指DNA水平的可遗传的变异，不
管这种DNA变异能不能导致可检测的表型或生化改 变，突变产生的变异是自然选择的基础，可遗传 的突变在群体中扩散从而产生多态性。
7. 近10年来，在人类基因组研究计划的 推动下，分子标记的研究与应用得到迅 速的发展。
分子标记的历史
第一代分子标记技术
RFLP （Restriction Fragment Length Polymorphism，限制性片段长度多态性）
第二代分子标记技术
RAPD（Random Amplified Polymorphic DNA，
RFLP
原理：
DNA
限制性内切酶酶切
电泳
转移到硝酸纤维素滤膜
同位素或非放射标记（如地高辛等）的探针杂交
胶片放射自显影，显示酶切片段大小
RFLP的应用
1.遗传学图的构建 结合RFLP连锁图， 任何能用RFLP探针检测出的基因及其 DNA片段都可以通过回交，快速有效地 进行转移。
2.基因定位 利用RFLP技术能够准确地 标记定位种质中的目标基因，结合杂交， 回交及组织培养等技术就可以快速有效的 将所需目标基因的DNA片段引入栽培品 种中，实现品种改良。
都有害； ✓ 探针的制备、保存和发放也很不方便； ✓ 分析程序复杂、技术难度大、费时、成本高。
2.随意扩增多态性DNA标记—RAPD
Random Amplified Polymorphismic DNA
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（5）许多分子标记表现共显性，能鉴别纯合杂 合基因型，提供完整的信息。
分子标记的分类（Staub等1996）
以Southern为基础如RFLP
分 子 标 记 以PCR
单引物PCR标记 有RAPD、 AP-PCR、DAF、ISSR等
双引物选择性扩增PCR 主要指AFLP
为基础 需克隆、测序构建特殊双引物PCR标记
加水至20µl，再加入石腊油，进行PCR扩增
PCR扩增：
Step1 95℃ 2分钟
Step2 Step3 Step4 Step5 Step6
95℃ 36℃ 72℃ GOTO 72℃
15秒 30秒 45秒 Step2 46循环 5分钟
主要特点
• • •
无需杂交，设计引物也无须知道序列信息；
DNA需要量少，引物便宜，成本较低；
同一类内碱基种类不同的SSR,丰度差别很大。
SSR的功能
长期以来一直认为SSR是转录哑区，没有明确的 生理功能。但随着研究深入，证明并非如此。
SSR的主要功能: 编码氨基酸； 染色体末端的SSR，有保护DNA完整性、避免降 解、融合及丢失的功能； 提高或降低临近基因转录速率； 基因重组的热点，是基因变异的来源； 部分SSR可产生转录启动复合物或活化染色体
AFLP —Amplified Fragment Length Polymorphism
RFLP
原理：
DNA
限制性内切酶酶切
电泳
转移到硝酸纤维素滤膜
同位素或非放射标记（如地高辛等）的探针杂交
胶片放射自显影，显示酶切片段大小
酶切—电泳—印迹
酶切：3-5ug DNA，以10U内切酶酶切5小时 电泳：0.6-0.8%琼脂糖胶70V电泳16小时
SSR的分布特点
不同物种其重复序列及重复单位频率不同。 通过对54个植物种核DNA和28个植物种细胞器 DNA SSR(1-4bp)的搜索,发现： (AT)ｎ最丰富,然后依次是: (A)n、(T)n、(AG)n、
(CT)n、(AAT)n、(ATT)n、(AAC)n、(GTT)n、(AGC)n、 (GCT)n、(AAG)n、(CTT) n、(AATT)n、(TTAA)n、 (AAAT)n、(ATTT)n及(AC)n、(GT)n。
89.8 (521) 76.4 (1800) 45.4 (403) 35.2 (1683)
78.3 (299) 86.0 (773) 50.4 (141) 58.4 (363)
SSR的操作
PCR反应：
DNA（20ng/µl） Primer（1mM） 4µl 0.25µl
10×Buffer
Mg2+（25mM） Байду номын сангаасaq酶（5U/µl） dNTP（25mM） 加水至20µl
形态标记
遗传学上稳定、可见的外部特征 如穗形、芒长、穗长、粒色、穗形、矮秆、卷叶等。
---遗传与环境、结构基因与调控基因综合作用的结果。
特点：直观简单
从基因型到表现型存在基因表达、调控、个体发育等 环节，表型差异有时难以反映基因型差异。
细胞学标记
染色体数目变异及结构变异，表现在染色体 核型（数目、大小、随体、着丝点位臵等） 和带型（C带、N带、G带等）。 随着分带、细胞原位杂交等研究技术的发展， 可在染色体水平揭示更多遗传变异。 特点：直观、快速而经济，但变异十分有限， 当染色体数目形态相似时难以分辨。
2.0µl
1.2µl 0.1µl 0.2µl
混合后，进行PCR扩增：
Step1
Step2 Step3 Step4 Step5
95℃
95℃ 56℃ 72℃
2分钟
30秒 30秒 60秒
GOTO Step2 31循环
注：SSR引物退火温度在52-65 ℃ 不等。
SSR的特点：
两侧顺序保守，在同种间多相同；
检测
其它方法: EST-SSR、相关种间SSR... ...
Cross-species SSR
Taxonomic Divergence Transferability % (N) Polymorphism % (N)
Same subgenus Same genus Same alliance Same family
如SSR、STS等
植物遗传研究中常用的分子标记
RFLP — Restriction Fragment Length Polymorphism RAPD—Random Amplified Polymorphic DNAs (DAF, AP-PCR)
SSR —Simple Sequence Repeat
生化标记——贮藏蛋白和同工酶
•
贮藏蛋白 同工酶
特点：经济、方便、成本较低
结构基因表达产物，对非结构基因无能 为力；所检测位点只是基因组一部分； 数量有限，有时受发育时期和环境影响。
分子标记
本质是以核苷酸序列作为标记，一般特点：
（1）不受季节、环境、基因表达与否的限制；
（2）多态性高，存在着丰富的等位变异； （3）数量丰富，多态性遍及整个基因组； （4）表现为“中性”，不影响目标性状的表达， 与不良性状无必然的连锁；
缺点： 对反应条件非常敏感，重复性差。
SCARs （Sequenced Characterized Amplified Regions）
为提高RAPD标记稳定性，把目标RAPD片 段克隆测序，根据片段两末端的序列设计 特定引物（通常24个碱基），再进行PCR 扩增，可把相应的单一位点鉴定出来。
数量丰富，在整个基因组均匀随机分布；
实验重复性好，结果可靠； 多数SSR增减重复序列频率高，在品种间具 广泛位点变异； 共显性标记，可鉴别杂合子和纯合子；
仅需微量组织，适合PCR分析半自动化
不足：
相对的物种专一性；
由于开发时需针对每个座位的微卫星序列， 发现，费用较高，耗时长； 实际分析时一般每次只分析单个位点； 不同引物退火温度不同，需要探索。
SSR的检测
琼脂糖凝胶检测（同前） 聚丙烯酰胺凝胶检测 一般采用银染、荧光检测。
银染检测程序
脱色：加1升10%HAC液，脱色20分钟 冲洗：用重蒸水冲洗胶板2次，每次5分钟 染色：加染色液(1%AgNO3，0.075%甲醛)30分钟 冲洗：用重蒸水冲洗胶板不超过5秒钟； 显影：预冷显影液（30g/LNaCO3，0.075%甲醛， 0.4mg/mlNa2SO3），轻摇到带纹出现； 定影：在固定/停止液并轻摇3-5分钟； 冲洗：用重蒸水冲洗2次，每次2分钟； 干胶：室温下自然干燥过夜。
分子标记及其在植物 遗传育种中的应用
遗传标记
（genetic marker）
• 性状标记
色泽， 形态…
具有多型性
基础基因表达 • 细胞学标记 易于鉴别 结果 倒位，易位，G/N/C带… 表现型 与目标基因紧密连锁 • 生化标记
同功酶…
• 分子标记
DNA碱基 RFLP、RAPD、SSR、AFLP、 序列变异 SNP… …
接头序列
MseⅠ 接头、PstⅠ 分别为： MseⅠ：
5’-GACGATGAGTCCTGAG-3’ 3’-TACTCAGGACTCAT-5’ PstⅠ： 5’-CTCGTAGACTGCGTACC-3’ 3’-CTGACGCATGGTTAA-5’ EcoRⅠ： 5’-CTCGTAGACTGCGTACC-3’ 3’-CTGACGCATGGTTAA-5’
探针标记—随机引物法
25 ng变性DNA
5ul 寡聚核苷酸
2ul BSA
3ul [α-32P]dCTP 2ul Klenow酶 加水至50ul，37℃温箱中标记2小时
RFLP标记特点
共显性，可以区别纯合和杂合基因型 稳定、重复性强 某些植物中开发探针已遍及整个基因组 缺点：DNA需要量较大，技术复杂； 用于做图较费时，难以分析大量样品； 在基因组较大、严格自花授粉作物上多 态性很低，使遗传图饱和度低。
AP-PCR(arbitrarily primed polymerase chain reaction)
引物较长（10～50bp）； 引物浓度较高； 引物长度不定，并且常常来自为其它 目的而设计的引物（如M13通用测序 引物）。
ISSR
共同优点：
在不需要知道所扩增DNA序列情况下， 产生DNA片段的指纹； 需DNA量少，产生多态性丰富。
5'
denature @ 95˚ C
5' 3'
GCTCGC
GCTCGC CGAGCG
AGTACT TCATGA TCATGA
3' 5'
anneal primers @ 60˚ C Taq polymerase binds 3’ and extends
5' 3' GCTCGC GCTCGC CGAGCG AGTACT TCATGA 3' 5'
具有更高的可重复性
共显性
微卫星标记(SSR)
真核生物基因组普遍存在，呈随机分布,大 约每隔10-50kb就存在一个SSR. 哺乳动物中约为植物的5-6倍;植物中平均 23.3kb有一个SSR;双子叶植物SSR数量大于 单子叶植物,核DNA SSR数量多于细胞质DNA; 根据核心序列碱基数的不同,可分为单碱基 、2碱基、3碱基、4碱基等多种重复型。
杂交：预杂交液中加入标记好的marker和 探针，放入杂交膜浸匀。封好杂交盒后，臵 65℃温箱中振荡过夜。 洗脱：将膜转入洗脱盒，加入洗脱液65℃ 振荡洗脱两次（15min/次），吸干包好。