最新微生物限度检查方法验证方案
版药典微生物限度检查方法验证方案
版药典微生物限度检查方法验证方案验证微生物限度检查方法的方案一、实验目的：验证药典中的微生物限度检查方法的准确性、可靠性和可行性。
二、实验材料：1.药典中规定的微生物限度检查方法；2.待验证的药品样品；3.适用的培养基和培养条件；4.培养基的质量控制菌种。
三、实验步骤：1.制备适用的培养基：按照药典中规定的方法和成分制备适用的培养基，并进行批次记录。
2.准备质量控制菌种：3.制备菌液悬液：从购买的质量控制菌种中，挑取一株菌种进行连续传代培养至活性最佳的生长阶段。
然后制备菌液悬液，以备后续试验使用。
4.扩大悬液应用范围：从第3步得到的菌液悬液中，取适量接种于适用培养基上，培养出代表性的细菌菌液悬液。
然后，通过菌液的光学检测、显微镜检查和菌落计数，确定菌液的细菌浓度。
5.验证方法的准确性：将待验证的药品样品加入培养基，根据药典中的方法将培养基分成不少于3组。
每组培养基中分别加入一定量的菌液悬液，并在药典规定的温度和时间下培养。
同时，设置对照组，只加入菌液悬液和培养基。
6.菌落计数：取适量的培养基样品，分别进行菌落计数，并根据培养基的数量、培养基总菌落数、对照组的菌落数等数据，计算菌落形成单位。
7.验证方法的可靠性：将待验证的药品样品按照药典中的方法进行连续验证，至少重复3次。
然后，对比不同验证结果的一致性和稳定性，评估方法的可靠性。
8.验证方法的可行性：根据实际的样品情况和验证结果，评估方法在操作上和技术上的可行性。
如，是否存在样品的特殊要求，检测方法是否能满足检测要求等。
四、数据处理与分析：根据实验结果的菌落计数和验证的次数，进行数据处理和统计分析。
评估验证结果的一致性、可靠性和可行性。
五、结论：根据实验结果和数据分析，得出关于药典中微生物限度检查方法的准确性、可靠性和可行性的结论。
如果验证结果与药典一致，说明方法可靠并可以使用。
如果验证结果与药典不一致，需要进一步分析原因和进行修正或优化。
微生物限度检查方法适用性验证方案
微生物限度检查方法适用性试验方案验证方案组织与实施微生物限度检查方法适用性试验工作应由质量管理部门负责组织，质量管理部门有关人员组成验证小组，参与实施。
方案起草方案审核方案批准目录一、概述二、验证目的和风险评估三、验证内容四、方法判定五、再验证周期六、参考文献七、结果评价及结论1、概述：微生物限度检查法系检查非规定灭菌制剂及其原料、辅料受微生物污染程度的方法。
检查项目包括需氧菌数、霉菌数和酵母菌数及控制菌检查。
当建立产品的微生物限度检查法时，应进行需氧菌、霉菌和酵母菌计数方法的适用性试验和控制菌检查方法的适用性试验，以确认所采用的方法适合于该产品的需氧菌、霉菌和酵母菌数的测定和控制菌检查。
依照中国药典2015版，需氧菌、霉菌和酵母菌及控制菌均采用平皿法进行方法适用性试验。
2、试验目的和风险评估：验证目的：确认所采用的需氧菌、霉菌和酵母菌计数方法及控制菌检查方法适合我公司所生产产品的微生物限度检查。
风险评估：3、验证内容：3.1、培养基来源：确认人：确认日期：3.2、检查用培养基配制方法：确认人：确认日期：3.3、使用仪器确认人: 确认日期：3.4、验证试验用菌种：确认人：确认日期：3.5试验方法：取供试品10 ml加PH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液至100ml→1:10供试液。
需氧菌、霉菌和酵母菌、控制菌采用常规法。
3.6菌液的制备：3.6.1取金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、大肠埃希菌、枯草芽孢杆菌的胰酪大豆胨琼脂斜面培物一铂金饵，加入胰酪大豆胨液体培养基中置30～35℃培养箱中培养18～24h，取金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、大肠埃希菌、枯草芽孢杆菌的胰酪大豆胨液体培养物1ml加入9ml0.9％无菌氯化钠溶液中，制成10-1 的菌液，依法10倍稀释至10～7，分取各菌悬液1ml注入平皿中，立即倾注胰酪大豆胨琼脂培养基20ml，各菌悬液平行制备两个平皿，平皿法培养计数，取小于100CFU/ml和1000CFU/ml的菌液备用。
微生物检查方法验证方案
微生物限度检查方法验证方案目录1、概述2、验证目的3、验证条件4、验证步骤5．验证试验小结1.概述微生物限度为产品质量的一个重要指标，其检查方法的选择对检验结果真实性有很大的影响，为此必须对其检查方法进行验证。
2.验证目的通过对微生物限度检查方法的验证，确认在正常条件下本检验方法处于控制状态，且能够稳定地对公司产品进行有效的微生物的检查和控制。
确认相应标准操作规程的适用性。
3.验证条件3.1验证小组成员与分工3.2 参加本方案实施操作的人员须事先进行《微生物限度检查标准操作程序》的培训，能熟练掌握检查方法和原理，熟悉本方案的内容。
3.3验证所用的各类物料均应符合相应的规定或标准。
相应的设备须验证的应事先进行验证并符合要求。
4.验证步骤4．1验证依据参照2010年版《中国药典》微生物限度检查计数方法的验证4．2与验证有关的文件《微生物限度检查标准操作程序》文件编号：SOP-ZL-010《净化工作台标准操作程序》文件编号：SOP-ZL-0324．3验证用材料4．3．1试验样品药品包装用复合膜产品4．3．2实验菌株1．金黄色葡萄球菌[CMCC（B）26003]2．大肠埃希菌[CMCC（B）44102]3．枯草芽孢杆菌[CMCC（B）63501]4．白色念株菌[CMCC（F）98001]5．黑曲霉[CMCC（F）98003]以上菌株购自省药品检验所。
4．4细菌、霉菌及酵母菌计数方法的验证4．4．1验证方法4．4．1．1菌液制备接种金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、枯草芽孢杆菌新鲜培养物至营养肉汤中，培养18～24小时；接种白色念株菌至改良培养基中，培养24～48小时，上述培养物用0.9%无菌氯化钠溶液制成每1ml含菌数为50～100CFU的菌悬液。
接种黑曲霉的新鲜培养物至改良马丁琼脂斜面培养基中，培养5～7天，加入3～5ml0.9%无菌氯化钠溶液，将孢子洗脱，然后，吸出孢子悬液（用管口带有薄的无菌纱布能过滤菌丝的无菌毛细吸管）至无菌试管内，用0.9%无菌氯化钠溶液制成每1ml含孢子数为50～100CFU的孢子悬液，备用。
微生物限度检查方法验证方案
微生物限度检查方法验证方案1.目的：为确认所采用的方法适合于该药品的微生物限度检查，包括细菌、霉菌及酵母菌计数和控制菌检查，特制定本验证方案，通过比较试验菌的恢复生长结果，来评价整个检验方法的准确性、有效性和重现性，以确认供试品在该实验条件下无抑菌活性或其抑菌活性可忽略不计，所采用的方法适用于该品种的微生物限度检查。
验证过程应严格按照本方案规定的内容进行，若因特殊原因确需变更时，应填写验证方案修改申请并报验证领导小组批准2.范围：本验证方案适用于微生物限度检查方法的验证。
3.规范性引用文件：根据《中国药典》2010年版二部附录Ⅺ J 微生物限度检查法的要求，由于某些供试品具有抗菌活性，在建立微生物检查方法或产品的组分发生改变或原检查法的检验条件发生改变时，可能影响检验结果的准确性，必须对供试品的抑菌活性及测定方法的可靠性进行验证。
4.验证实施：4.4.1 试验前的准备:4.4.1.1 试验用具的准备：将试验需用的试管、刻度吸管、薄膜过滤器、滤膜（孔径0.22um、直径50mm）、平皿、空三角瓶、称量纸等，用牛皮纸包扎好后，放于湿热灭菌器中，在121℃，灭菌30 min，在3天内使用。
4.4.1.2试验用培养基的制备：取适用性检查合格的营养琼脂培养基、玫瑰红钠琼脂培养基、营养肉汤培养基、胆盐乳糖培养基（BL）、改良马丁琼脂培养基、4-甲基伞形酮葡糖苷酸培养基（MUG）等脱水培养基，按照相应的配制说明，用纯化水配制、分装后，在2小时内，放于湿热灭菌器中，在121℃，灭菌15 min，在3周内使用。
4.4.1.3试验用稀释剂/缓冲液、冲洗液的制备：取在有效期内的试剂，按照相应的配制方法，配制pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液、0.9%无菌氯化钠溶液、0.05%（ml/ml）聚山梨酯80的0.9%无菌氯化钠溶液等，用纯化水配制，加热使溶，过滤，分装，在121℃，灭菌15 min，在3周内使用。
4.4.2 试验菌的制备和稀释：4.4.2.1细菌、霉菌及酵母菌计数方法验证用菌液：4.4.2.1.1取大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌的新鲜培养物少许接种至10ml营养肉汤中，在30～35℃培养18～24小时；取白色念珠菌的新鲜培养物接种至改良马丁培养基中，在23～28℃培养24～48小时；取黑曲霉的新鲜培养物接种至改良马丁琼脂斜面培养基上，23～28℃培养5～7天。
微生物限度检查方法薄膜过滤法验证方案
微生物限度检查方法薄膜过滤法验证方案 Document number【SA80SAB-SAA9SYT-SAATC-SA6UT-SA18】微生物限度检查方法(薄膜过滤法)验证方案微生物限度检查方法(薄膜过滤法) 验证方案编码：表一、验证方案的起草与批准1.验证方案起草起草人：起草时期：年月日2.验证小组成员：3.验证方案审核4.验证方案批准批准人：批准日期：二、验证方案1.验证目的和原理验证目的为确认所采用的方法适合于该药品的细菌、霉菌、酵母菌数的测定，特制定本方案。
验证过程应严格按照本方案规定的内容进行，若因特殊原因确需要变更时，应报验证委员会批准。
原理通过比较试验4组中试验菌的恢复生长结果来评价整个检验方法的准确性、有效性和重现性。
2.验证方法步骤验证前的准备：进行微生物限度检查方法（薄膜过滤法）验证前，所有的平皿和稀释剂都应该严格按照相关的灭菌程序消毒，以确保其对试验的结果没有影响。
试验菌应包括G—、G+、酵母菌和霉菌类微生物以基本覆盖样品中可能存在的微生物。
验证试验的操作计划：用3个不同批号产品微生物限度检测方法进行平行试验，通过计算回收率来判断限度检查方法是否对产品有影响。
试验结果可接受标准：用标准菌株评价方法“”的微生物限度检查对检品中微生物的抑制性，试验结果应显示3次独立的平行试验中，稀释剂对照组的菌回收率应不小于70%，试验组回收率也不低于70%。
3.试验实施试验前的准备3.1.1主要仪器设备：恒温培养箱、生化培养箱、电子天平、高压蒸汽灭菌器、净化工作台。
3.1.2操作环境：操作间应该安装空气除菌过滤层装置。
环境洁净度不应低于10000级，局部洁净度为100级（或放置同等级净化工作台）。
操作间或净化工作台的洁净空气应该保持对环境形成正压，不低于。
3.1.3试验样品：批号：批号：批号：3.1.4培养基：3.1.5稀释液：无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液以上经115℃高压蒸汽灭菌30min。
3.1.6验证用微生物名称及其编号实验菌株的来源：编号由菌名首字母—传代代数—制备日期组成。
微生物限度检查方法(薄膜过滤法)验证方案
微生物限度检查方法(薄膜过滤法)验证方案微生物限度检查方法(薄膜过滤法) 验证方案编码：表一、验证方案的起草与批准1.验证方案起草起草人：起草时期：年月日2.验证小组成员：3.验证方案审核4.验证方案批准批准人：批准日期：二、验证方案1.验证目的和原理验证目的为确认所采用的方法适合于该药品的细菌、霉菌、酵母菌数的测定，特制定本方案。
验证过程应严格按照本方案规定的内容进行，若因特殊原因确需要变更时，应报验证委员会批准。
原理通过比较试验4组中试验菌的恢复生长结果来评价整个检验方法的准确性、有效性和重现性。
2.验证方法步骤验证前的准备：进行微生物限度检查方法（薄膜过滤法）验证前，所有的平皿和稀释剂都应该严格按照相关的灭菌程序消毒，以确保其对试验的结果没有影响。
试验菌应包括G—、G+、酵母菌和霉菌类微生物以基本覆盖样品中可能存在的微生物。
验证试验的操作计划：用3个不同批号产品微生物限度检测方法进行平行试验，通过计算回收率来判断限度检查方法是否对产品有影响。
试验结果可接受标准：用标准菌株评价方法“”的微生物限度检查对检品中微生物的抑制性，试验结果应显示3次独立的平行试验中，稀释剂对照组的菌回收率应不小于70%，试验组回收率也不低于70%。
3.试验实施试验前的准备3.1.1主要仪器设备：恒温培养箱、生化培养箱、电子天平、高压蒸汽灭菌器、净化工作台。
3.1.2操作环境：操作间应该安装空气除菌过滤层装置。
环境洁净度不应低于10000级，局部洁净度为100级（或放置同等级净化工作台）。
操作间或净化工作台的洁净空气应该保持对环境形成正压，不低于。
3.1.3试验样品：批号：批号：批号：3.1.4培养基：3.1.5稀释液：无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液以上经115℃高压蒸汽灭菌30min。
3.1.6验证用微生物名称及其编号实验菌株的来源：编号由菌名首字母—传代代数—制备日期组成。
3.1.7器具：无菌薄膜过滤器：（孔径直径50mm）、无菌移液管（5ml）4.验证方法菌液的制备将大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌接种至10ml的无菌营养肉汤中在30～35℃下培养18～24小时，将白色念珠菌接种至改良马丁液体培养基中，在23～28℃下培养24～48小时。
微生物限度检查方法(薄膜过滤法)验证方案
微生物限度检查方法(薄膜过滤法)验证方案微生物限度检查方法(薄膜过滤法) 验证方案编码：表一、验证方案的起草与批准1.验证方案起草起草人：起草时期：年月日2.验证小组成员：3.验证方案审核4.验证方案批准批准人：批准日期：二、验证方案1.验证目的和原理1.1验证目的为确认所采用的方法适合于该药品的细菌、霉菌、酵母菌数的测定，特制定本方案。
验证过程应严格按照本方案规定的容进行，若因特殊原因确需要变更时，应报验证委员会批准。
1.2原理通过比较试验4组中试验菌的恢复生长结果来评价整个检验方法的准确性、有效性和重现性。
2.验证方法步骤2.1验证前的准备：进行微生物限度检查方法（薄膜过滤法）验证前，所有的平皿和稀释剂都应该严格按照相关的灭菌程序消毒，以确保其对试验的结果没有影响。
试验菌应包括G—、G+、酵母菌和霉菌类微生物以基本覆盖样品中可能存在的微生物。
2.2验证试验的操作计划：用3个不同批号产品微生物限度检测方法进行平行试验，通过计算回收率来判断限度检查方法是否对产品有影响。
2.3试验结果可接受标准：用标准菌株评价方法“”的微生物限度检查对检品中微生物的抑制性，试验结果应显示3次独立的平行试验中，稀释剂对照组的菌回收率应不小于70%，试验组回收率也不低于70%。
3.试验实施3.1试验前的准备3.1.1主要仪器设备：恒温培养箱、生化培养箱、电子天平、高压蒸汽灭菌器、净化工作台。
3.1.2操作环境：操作间应该安装空气除菌过滤层装置。
环境洁净度不应低于10000级，局部洁净度为100级（或放置同等级净化工作台）。
操作间或净化工作台的洁净空气应该保持对环境形成正压，不低于4.9pa。
3.1.3试验样品：批号：批号：批号：3.1.4培养基：3.1.5稀释液：PH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液以上经115℃高压蒸汽灭菌30min。
3.1.6验证用微生物名称及其编号实验菌株的来源：编号由菌名首字母—传代代数—制备日期组成。
微生物限度检查方法适用性试验方案
微生物限度检查方法适用性试验方案一、试验目的本试验旨在验证微生物限度检查方法的适用性，并评估其在实际样品中的准确性、精密度和灵敏度，以确保检测结果的可靠性。
二、试验范围本试验适用于各类药品、食品、环境以及生物制品等样品的微生物限度检查。
三、试验设备与试剂1. 培养基：本试验需使用适当的培养基，如大肠杆菌培养基、沙门氏菌培养基等，以满足特定微生物的培养需求。
2. 灭菌设备：试验中的培养基、工具及试剂需经过灭菌处理，以保证试验环境的无菌状态。
3. 微量移液器：用于准确取样和移液，确保实验的精确性。
4. 微生物培养箱：用于提供适宜的温度和湿度条件来培养微生物样品。
四、试验步骤1. 样品制备：按照相关规定和标准采集样品，并根据不同样品的特性进行适当处理，以便得到具有代表性的样品。
2. 培养基接种：将样品按照试验要求接种到相应的培养基中，并在一定条件下进行培养，以促使微生物生长。
3. 培养基培养：将接种过样品的培养基置于微生物培养箱中，根据微生物的生长特性进行培养，通常包括温度、湿度和培养时间等方面的控制。
4. 结果观察与记录：根据实验要求，观察培养基上是否有微生物的生长，并记录对应的观察结果。
5. 试验数据处理与分析：根据试验结果进行数据处理与分析，并评估微生物限度检查方法的适用性、准确性和灵敏度。
五、试验评价指标1. 准确性：通过与参考方法的比对，评估限度检查方法的准确程度。
2. 精密度：利用不同实验者、设备和试剂的重复试验，评估方法的可重复性和稳定性。
3. 确定度：评估方法的灵敏度和特异性，以确定方法对微生物的检测能力。
4. 可靠性：综合以上评价指标，评估方法在实际应用中的可靠性和适用性。
六、试验结果与分析根据试验评价指标，通过一系列试验和数据分析，我们可以得出以下结论：1. 限度检查方法在各类样品中的准确性良好，能够准确反映样品中微生物的含量。
2. 试验结果表明，方法具有较好的重复性和稳定性，不同实验者、设备和试剂的试验结果相对一致。
微生物限度检查方法(薄膜过滤法)验证方案
微生物限度检查方法(薄膜过滤法)验证方案微生物限度检查方法(薄膜过滤法) 验证方案编码：表一、验证方案的起草与批准1.验证方案起草起草人：起草时期：年月日2.验证小组成员：3.验证方案审核4.验证方案批准批准人：批准日期：二、验证方案1.验证目的和原理1.1验证目的为确认所采用的方法适合于该药品的细菌、霉菌、酵母菌数的测定，特制定本方案。
验证过程应严格按照本方案规定的内容进行，若因特殊原因确需要变更时，应报验证委员会批准。
1.2原理通过比较试验4组中试验菌的恢复生长结果来评价整个检验方法的准确性、有效性和重现性。
2.验证方法步骤2.1验证前的准备：进行微生物限度检查方法（薄膜过滤法）验证前，所有的平皿和稀释剂都应该严格按照相关的灭菌程序消毒，以确保其对试验的结果没有影响。
试验菌应包括G—、G+、酵母菌和霉菌类微生物以基本覆盖样品中可能存在的微生物。
2.2验证试验的操作计划：用3个不同批号产品微生物限度检测方法进行平行试验，通过计算回收率来判断限度检查方法是否对产品有影响。
2.3试验结果可接受标准：用标准菌株评价方法“”的微生物限度检查对检品中微生物的抑制性，试验结果应显示3次独立的平行试验中，稀释剂对照组的菌回收率应不小于70%，试验组回收率也不低于70%。
3.试验实施3.1试验前的准备3.1.1主要仪器设备：恒温培养箱、生化培养箱、电子天平、高压蒸汽灭菌器、净化工作台。
3.1.2操作环境：操作间应该安装空气除菌过滤层装置。
环境洁净度不应低于10000级，局部洁净度为100级（或放置同等级净化工作台）。
操作间或净化工作台的洁净空气应该保持对环境形成正压，不低于4.9pa。
3.1.3试验样品：批号：批号：批号：3.1.4培养基：3.1.5稀释液：PH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液以上经115℃高压蒸汽灭菌30min。
3.1.6验证用微生物名称及其编号实验菌株的来源：编号由菌名首字母—传代代数—制备日期组成。
微生物限度检查方法验证方案
微生物限度检查方法验证方案微生物限度检查法验证方案1。
目的:为确认所采用的方法适用于药品微生物限度检查，包括细菌、霉菌、酵母菌和对照菌的计数，特制定本验证方案。
通过比较试验菌的复苏生长结果，评价整个试验方法的准确性、有效性和重现性，从而确定试验样品在实验条件下无抑菌活性或抑菌活性可忽略不计。
所采用的方法适用于该品种的微生物限度检查。
验证过程应严格按照本计划规定的内容进行。
因特殊原因确需变更的，应填写《验证计划变更申请书》，报验证领导小组批准。
2.范围: 本验证计划适用于微生物限度检查方法的验证。
3。
规范性引用文件:根据《中国药典》XXXX版附录二附录九J微生物限度检查法的要求，由于部分试验品的抗菌活性，当已建立的微生物检查方法或产品的成分发生变化或原检查方法的检查条件发生变化时，可能会影响检查结果的准确性。
因此，必须验证测试物品的抗菌活性和测试方法的可靠性。
4.验证和实施:4.4.1试验前准备:4.4.1.1试验设备的准备:试管、刻度移液器、薄膜过滤器、滤膜(孔径0.22um，直径50毫米)、平皿、空三角瓶、称重纸等。
试验要求用牛皮纸包裹，放在湿热灭菌器中，在121℃灭菌30分钟，3天内使用4.4.1.2试验培养基的制备:取脱水培养基如营养琼脂培养基、玫瑰红钠琼脂培养基、营养肉汤培养基、胆盐乳糖培养基(BL)、改良马丁琼脂培养基、4-甲基伞形酮葡萄糖醛酸苷培养基(MUG)等经适用性检验合格的脱水培养基，按相应的制备说明用纯净水配制，分装，2小时内放入湿热灭菌器中，121℃灭菌15分钟，3周内使用4.4.1.3试验用稀释液/缓冲液和冲洗液的配制:取有效期内的试剂，配制pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液、0.9%无菌氯化钠溶液、0.05%(毫升/毫升)聚山梨酯80无菌氯化钠溶液和0.05%(毫升/毫升)0.9%氯化钠溶液等。
按照相应的制备方法，用纯净水配制，加热溶解，过滤，分装，121℃灭菌15分钟，3周内使用4.4.2试验菌的制备和稀释:4.4.2.1细菌、霉菌和酵母菌计数法验证菌液:4.4.2.1.1取少量新鲜培养的大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和枯草芽孢杆菌，接种于10毫升营养肉汤中，在30-35℃培养18-24小时；将新鲜白色念珠菌培养物接种到改良的马丁培养基中，在23-28℃培养24-48小时；将黑曲霉的新鲜培养物接种到改良的马丁琼脂斜面培养基上，在23-28℃培养5-7天4.4.2.1.2将上述大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌和白色念珠菌的均匀培养物(细菌悬液)用0.9%无菌氯化钠溶液稀释两次，以制备每毫升细菌含50-100伏的测试细菌溶液。
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微生物限度检查方法验证方案
六、验证内容
1.供试液的制备
1.1.取供试品10g，加pH7.0无菌氯化钠－蛋白胨缓冲液至100ml，充分振摇使混匀，作为1:10的供试液。
1.2.取1:10供试品10ml，加pH7.0无菌氯化钠－蛋白胨缓冲液至100ml，充分振摇使混匀，作为1:100的供试液。
1.3.取1:100供试品10ml，加pH7.0无菌氯化钠－蛋白胨缓冲液至100ml，充分振摇使混匀，作为1:1000的供试液。
备注：供试液制备若需加温时，应均匀加热，且温度不超过45℃。
供试液从制备至加入检验用培养基，不得超过1小时。
2.菌液制备
2.1.接种大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌的新鲜培养物至胰酪大豆胨液体培养基中，30〜35℃培养18～24小时；分别取上述培养物用0.9%无菌氯化钠溶液或pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液，依次稀释至、、、制成每1ml含菌数为小于100cfu的菌悬液。
2.2.接种白色念珠菌的新鲜培养物至沙氏葡萄糖液体培养基中，20〜25℃培养2～3 天；取此培养物用0.9%无菌氯化钠溶液或pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液，依次稀释至，制成每1ml含菌数为小于100cfu的菌悬液。
2.3.将黑曲霉菌斜面的新鲜培养物接种至沙氏葡萄糖琼脂斜面培养基上，20〜25℃培养5〜7天，使大量的孢子成熟。
加入3-5ml含0.05%（ml/ml）聚山梨酯80的0.9%无菌氯化钠溶液或pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液，将孢子洗脱。
然后，采用适宜方法吸出孢子悬液至无菌试管内，用含0.05%（ml/ml）聚山梨酯80的0.9%无菌氯化钠溶液或pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液依次稀释至，制成每 1ml 含孢子数小于100cfu 的孢子悬液。
2.4.上述菌悬液制备后若在室温下放置，应在2小时之内使用；若保存在2~8℃，可在24小时内使用。
黑曲霉孢子悬液可保存在2~8℃，在验证过的贮存有效期内使用。
3.计数方法的验证
3.1.需氧菌、霉菌及酵母菌计数（平皿法）
所加菌液的体积不得超过供试液体积的1%。
为确认供试品中的微生物能被充分检出，首先
应选择最低稀释级的供试液进行计数方法适用性检查。
3.1.1.试验组
取上述制备好的供试液，加入试验菌液、混匀，使每1ml供试液或每张滤膜过滤的供试液中含菌量不大于100cfu。
—取的供试液9.9ml和小于10000cfu的铜绿假单胞菌菌悬液0.1ml混匀后，吸取1ml注入平皿中，立即倾注胰酪大豆胨琼脂培养基 15～20ml，混匀，凝固，于30～35℃倒置培养3天点计菌落数。
平行制备2个平皿。
—取的供试液9.9ml和小于10000cfu的金黄色葡萄球菌菌悬液0.1ml混匀后，吸取1ml注入平皿中，立即倾注胰酪大豆胨琼脂培养基15～20ml，混匀，凝固，于30～35℃倒置培养3天点计菌落数。
平行制备2个平皿。
—取的供试液9.9ml和小于10000cfu的枯草芽孢杆菌菌悬液0.1ml混匀后，吸取1ml注入平皿中，立即倾注胰酪大豆胨琼脂培养基15～20ml，混匀，凝固，于30～35℃倒置培养3天点计菌落数。
平行制备2个平皿。
—取的供试液9.9ml和小于10000cfu的白色念珠菌菌悬液0.1ml混匀后，吸取1ml注入平皿中，立即倾注胰酪大豆胨琼脂培养基15～20ml，混匀，凝固，于30～35℃倒置培养3天点计菌落数。
平行制备2个平皿。
—取的供试液9.9ml和小于10000cfu的黑曲霉菌悬液0.1ml混匀后，吸取1ml注入平皿中，立即倾注胰酪大豆胨琼脂培养基15～20ml，混匀，凝固，于30～35℃倒置培养3天点计菌落数。
平行制备2个平皿。
—取的供试液9.9ml和小于10000cfu的白色念珠菌菌悬液0.1ml混匀后，吸取1ml注入平皿中，立即倾注沙氏葡萄糖琼脂培养基15～20ml，混匀，凝固，于20～25℃倒置培养5天点计菌落数。
平行制备2个平皿。
—取的供试液9.9ml和小于10000cfu的黑曲霉菌悬液0.1ml混匀后，吸取1ml注入平皿中，立即倾注沙氏葡萄糖琼脂培养基15～20ml，混匀，凝固，于20～25℃倒置培养5天点计菌落数。
平行制备2个平皿。
3.1.2.菌液组
—取小于100cfu的铜绿假单胞菌菌悬液、金黄色葡萄球菌菌悬液、枯草芽孢杆菌菌悬液、白色念珠菌菌悬液、黑曲霉菌悬液各1ml，注入平皿中，立即倾注胰酪大豆胨琼脂培养基约15～20ml，混匀，凝固，于30～35℃倒置培养3天点计菌落数。
各平行制备2个平皿。
—取小于100cfu的白色念珠菌菌悬液、黑曲霉菌悬液各1ml，立即倾注沙氏葡萄糖琼脂培养基各15～20ml，混匀，凝固，于20～25℃倒置培养5天点计菌落数。
各平行制备2个平皿。
3.1.3.供试品对照组
—取的供试液1ml，注入平皿中，分别立即倾注15～20 ml温度不超过45℃胰酪大豆胨琼脂培养基和沙氏葡萄糖琼脂培养基，混匀，凝固，胰酪大豆胨琼脂培养基30～35℃倒置培养3天点计菌落数，沙氏葡萄糖琼脂培养基20～25℃倒置培养5天点计菌落数。
各组平行制备2个平皿。
3.1.
4.结果判断
3.1.
4.1计算公式：
稀释剂对照组菌数的回收率=
（稀释剂对照组的平均菌落数－供试品对照组的平均菌落数）/菌液组的平均菌落数
试验组菌数的回收率=
（试验组的平均菌落数－供试品对照组的平均菌落数）/菌液组的平均菌落数
3.1.
4.2判定标准：
实验组、稀释剂对照组（如有）的菌数回收率应在0.5～2之间。
若各试验菌的回收率均符合规定，照所用的供试液制备方法及计数方法进行该供试品的需氧菌总数、霉菌和酵母菌总数计数。
3.1.5试验结果
供试品批号、、。
结果判定：
验证人： 复核人： 日期： 日期： 4.控制菌检查
4.1.（大肠埃希菌）的验证 4.1.1.试验组
取的供试液ml （取相当于1g 或1ml 供试品的供试液），小于100cfu 的大肠埃希菌菌悬液1ml ，加至约100ml 的胰酪大豆胨液体培养基，于30～35℃培养18～24小时。
4.1.2.阴性对照组
取pH7.0无菌氯化钠－蛋白胨缓冲液10ml ，加至约100ml 的胰酪大豆胨液体培养基，于30～35℃培养18～24小时。
4.1.3.阳性对照组
取小于100cfu 的大肠埃希菌菌悬液1ml ，加至约100ml 的胰酪大豆胨液体培养基，于30～35℃培养18～24小时。
4.1.4.检查
取上述培养物
1ml ，接种至含100ml 麦康凯液体培养基内培养，42～44℃培养24～48小时。
取麦康凯液体培养物划线接种于麦康凯琼脂平板上30～35℃培养18～72小时。
检查结果如下： 第一次试验结果： 供试品批号：
第二次试验结果：供试品批号：
第三次试验结果：供试品批号：
标准：阳性对照和试验组应检出大肠埃希菌，阴性对照应无菌生长。
结果判定：
验证人：复核人：
日期：日期：
备注：采用以上供试液制备方法，分别对需氧菌、霉菌及酵母菌计数和控制菌检查法进行方法验证时，若结果不能达到各标准时，应继续采用其他方法（如培养基稀释法、薄膜过滤法等）消除供试品的抑菌活性，重新进行方法验证。
七、验证异常情况处理
本次验证实施人员异动情况：□发生变化□未发生变化，发生异动情况描述如下：
本次验证测试仪器校验情况：□符合要求□不符合要求，不符合处理情况描述如下：
本次验证实施异常情况：□有异常□无异常；异常处理情况：□已处理完成□未处理完成。
实施小组组长：日期：审核人：日期：。