树突细胞分离步骤
树突状细胞实验报告
一、实验目的1. 了解树突状细胞（Dendritic Cells，DCs）的基本特性及其在免疫调节中的作用。
2. 掌握DCs的分离、培养和鉴定方法。
3. 学习利用DCs进行免疫调节实验。
二、实验原理树突状细胞是机体免疫系统中重要的抗原提呈细胞，具有摄取、加工和呈递抗原的能力。
DCs在启动、调控和维持免疫应答中发挥着关键作用。
本实验通过分离、培养和鉴定DCs，探讨DCs在免疫调节中的作用。
三、实验材料1. 试剂：胎牛血清、RPMI 1640培养基、DMEM培养基、双抗、TNF-α、IL-4、抗鼠CD14抗体、FITC标记的羊抗鼠IgG抗体等。
2. 仪器：CO2培养箱、倒置显微镜、流式细胞仪等。
四、实验方法1. DCs分离与培养（1）取健康小鼠脾脏，置于DMEM培养基中，剪碎后用200目筛网过滤。
（2）将滤液加入含10%胎牛血清的RPMI 1640培养基，在37℃、5%CO2条件下培养。
（3）培养3天后，加入TNF-α和IL-4，继续培养至第7天。
2. DCs鉴定（1）收集培养的细胞，用抗鼠CD14抗体进行标记。
（2）用FITC标记的羊抗鼠IgG抗体进行二次染色。
（3）流式细胞仪检测细胞表面CD14的表达情况。
3. 免疫调节实验（1）将分离得到的DCs与抗原共同培养，观察DCs对抗原的摄取和呈递能力。
（2）将DCs与T细胞共同培养，观察DCs对T细胞的激活作用。
五、实验结果1. DCs分离与培养：培养7天后，观察到细胞形态呈树突状，符合DCs的形态特征。
2. DCs鉴定：流式细胞仪检测结果显示，细胞表面CD14的表达率为（95±3）%，说明成功分离出DCs。
3. 免疫调节实验：（1）DCs对抗原的摄取和呈递：在抗原刺激下，DCs能够摄取并呈递抗原，说明DCs具有抗原摄取和呈递能力。
（2）DCs对T细胞的激活作用：在DCs与T细胞共同培养条件下，观察到T细胞增殖，说明DCs具有激活T细胞的作用。
树突状细胞培养方法
树突状细胞培养方法树突状细胞（Dendritic Cells，DCs）是一类免疫细胞，主要负责识别和激活T细胞，发挥着重要的免疫调节和抗肿瘤等作用。
为了进行树突状细胞的研究，科研人员需要对其进行体外培养。
本文将介绍常用的树突状细胞培养方法。
1.制备树突状细胞前驱细胞：树突状细胞前驱细胞主要存在于外周血和骨髓中。
首先，采集外周血或骨髓，并将其进行红细胞裂解。
然后，用PBS洗涤样品，离心沉淀细胞。
最后，将细胞进行培养。
2.培养基的选择：培养树突状细胞需要选择适宜的培养基。
目前常用的培养基有RPMI1640、DMEM等。
添加10-20%的胎牛血清（FBS）可以提供必要的生长因子和营养物质。
3.添加生长因子：在培养树突状细胞的过程中，可能需要添加一些生长因子来促进细胞的分化和增殖。
常见的生长因子包括GM-CSF（粒细胞巨噬细胞集落刺激因子）和IL-4（白细胞介素4）。
可以将这些生长因子添加到培养基中，以达到最佳生长条件。
4.细胞培养条件的控制：树突状细胞对培养条件非常敏感。
因此，需要对温度、湿度、CO2浓度等参数进行严格控制。
一般来说，将细胞培养在37摄氏度、5%CO2的培养箱中。
5.细胞的分离和传代：在树突状细胞培养过程中，细胞会不断增殖。
为了保证细胞的活力和稳定性，需要定期分离和传代细胞。
可以使用胰酶等消化酶将细胞从培养瓶中剥离，然后进行细胞计数并按照一定比例进行传代。
6.细胞质量的评估：在培养树突状细胞的过程中，需要对细胞质量进行评估。
可以通过使用流式细胞仪等设备来检测细胞表面标记物的表达情况，以及细胞活力、树突状突起的形态等指标来评估细胞的质量。
7.树突状细胞的激活：树突状细胞的主要功能是激活T细胞。
为了使树突状细胞具备充分的抗原递呈能力，可以使用多种促进细胞激活的方法，如脂多糖、TNF-α等。
总结：树突状细胞培养方法包括制备前驱细胞、培养基选择、生长因子添加、细胞培养条件控制、细胞分离和传代、细胞质量评估以及细胞的激活等步骤。
小鼠骨髓来源树突状细胞(BMDC)培养
小鼠骨髓来源树突状细胞（BMDC）的培养1、取骨髓，对倍稀释2、用滴管沿管壁缓慢加入淋巴细胞分离液(45度角倾斜，尽量产生气泡，起到缓冲作用)3、2000转，离心30分钟4、吸取白膜层，（沿管壁）交替多次吸取，加入5倍体积以上的PBS液5、1500转，离心15分钟（洗掉血小板）6、弃掉上清，留少许回流液，轻弹管壁，加入PBS液至50ml7、800转，离心10分钟，（洗掉红细胞）8、重复两至三次9、加入PBS液至50ml，计数:？个细胞离心后铺板，1X1076孔板培养液，共铺20板。
无血清1640+DNA酶12h后轻晃培养液，洗板后加入完全培养基和GM—CSF(1000U/ml)和IL—4(500U/lml) 10、第三天每孔补加等体积的完全培养基和GM—CSF(1000U/ml)和IL—4(500U/lml) ，这时细胞部分悬浮11、第五天为imDC，+1LPS(1ug/ml),诱导至第七天，为mDC。
参考Inaba等人的方法，并根据本实验室的经验稍作改进。
即：1. 颈椎脱位法处死C57BL/6小鼠，无菌状态下取股骨和胫骨，浸泡在RPMI-1640培养基中。
2. 用1ml注射器吸取RPMI-1640培养液，从骨干的一端刺入骨髓腔，将骨髓冲洗到一无菌培养皿中，每根骨头反复4～6遍，收集培养皿中的骨髓细胞悬液，离心，1500 rpm×10min。
3. 弃去上清，加入5 ml无菌Tris-NH4Cl溶液悬浮细胞溶解红细胞，于室温下静置2分钟溶解红细胞后，再次离心，1500 rpm×5min，弃上清。
4. 用RPMI-1640培养液洗涤后将细胞用完全培养基悬浮，分至6孔培养板中，并在每孔中加入完全培养基至4 ml，再加入rmGM-CSF至终浓度10 ng/ml，IL-4终浓度10ng/ml。
5. 将细胞培养板放入37℃，含5% CO2的孵箱中培养48小时。
6. 轻轻吹打细胞后，连同培养液一起吸去悬浮细胞，仅保留贴壁细胞。
树突状细胞抗原提呈过程
树突状细胞抗原提呈过程
第一步，抗原捕获。
树突状细胞通过其表面上的特异性受体，如Toll样受体（TLR）和C型凝集素受体（CLR），能够识别和捕获外源抗原。
当DC细胞
接触到病原体或其他外源抗原时，这些受体会识别并结合抗原分子，将其内部化到细胞内。
第二步，抗原处理。
捕获到的抗原分子在DC细胞内被降解成小片段，这一过程发生
在特殊的细胞器内，如内质网和溶酶体。
这些小片段被称为抗原肽，它们将在后续步骤中被呈递给T细胞。
第三步，抗原呈递。
处理后的抗原肽将与主要组织相容性复合物（MHC）分子结合，
形成MHC-抗原肽复合物。
这些复合物将被转运到树突状细胞表面，
并在那里呈递给T细胞。
第四步，T细胞激活。
当T细胞受体识别到MHC-抗原肽复合物时，T细胞将被激活并开始免疫应答。
这将引发一系列的免疫反应，包括T细胞的增殖和分化，以及其他免疫细胞的活化。
树突状细胞抗原提呈过程的完成标志着免疫系统对外源抗原的识别和应答。
这一过程的精密调控对于维持免疫系统的平衡和功能至关重要。
对树突状细胞抗原提呈过程的深入理解也为疾病的治疗和预防提供了新的思路和方法。
小鼠树突状细胞(DC)培养
8．加入树突细胞培养液重悬细胞，调整细胞数至1×106/ml(Scepter自动细胞计数器,美国Millipore公司)，按2ml/孔接种至12孔细胞培养板（4.5cm2/孔），置37℃、5%CO2孵箱培养。
9．于培养第3，5天每孔分别更换2ml树突细胞培养液。第6天收集悬浮细胞，流式抗体染色后，流式细胞仪检测树突状细胞的表型。
1.4.4 红细胞裂解液pH7.2（1L）：
NH4CL 8.56g
Tris碱 2.059g
MilliQ水定容至1L 调节pH至7.2
1．处死BALB/c小鼠并浸泡于75%医用酒精10min，随后取小鼠股骨及胫骨并用眼科剪剔除附着在骨骼上的肌肉。
2．剪掉两侧股骨头，将吸满PBS缓冲液的注射器针头插入骨腔中，并缓慢推动注射器冲洗骨髓腔，直至骨变白。
3．将收集到的骨髓细胞悬液500×g离心5mim，弃上清。
4．向骨髓细胞沉淀中加入红细胞裂解液并反复吹打混匀，置37℃孵箱孵，吸弃上清。用PBS重悬细胞沉淀，200钼铜网过滤除去骨髓细胞悬液中组织碎块。
6．用1ml PBS缓冲液重悬细胞，加入功能纯化抗体抗-小鼠CD4/CD8a/ MHC-Ⅱ/CD45R及兔血清补体，37℃孵育1h，以去除T淋巴细胞、B淋巴细胞及MHC-Ⅱ+细胞。(功能纯化抗体抗-小鼠 CD4(L3T4)、CD8a(Ly-2)、CD45R(B220)、MHC-Ⅱ（I-A/I-E）抗体购自eBioscience公司)
树突状细胞及其前体细胞分选
03
树突状细胞及其前体细胞分选的方法
基于表面标志的分选方法
总结词
基于表面标志的分选方法是最常用的树突状细胞及其前体细胞分选方法，通过抗体与细胞表面抗原的 特异性结合，将目标细胞从混合细胞群体中分离出来。
详细描述
这种方法利用树突状细胞及其前体细胞表面特有的抗原标记，如CD11c、CD123等，通过与相应抗体 结合后进行磁性分离或流式细胞仪分选。该方法具有较高的特异性和灵敏度，能够有效地分离出纯度 较高的目标细胞。
02
通过分选树突状细胞及其前体细胞，可以进一步研究它们的生物学特性和功能 ，为免疫学研究提供更多有价值的信息。
03
树突状细胞及其前体细胞分选还有助于开发新的免疫疗法和疫苗，为人类健康 和疾病治疗提供更多选择。
树突状细胞及其前体细胞分选的应用
在疫苗研发中，通过分选特定类型的树突状细胞，可以设计出更有效的 疫苗，提高免疫应答的效果和持久性。
基于细胞活力的分选方法
总结词
基于细胞活力的分选方法是根据细胞活力的差异，将活力较高的树突状细胞及 其前体细胞分离出来的方法。
详细描述
该方法利用不同细胞活力的特点，通过特定的染色或标记技术，将活力较高的 树突状细胞及其前体细胞选择性地分离出来。该方法能够保证细胞的活性，有 利于后续的实验和应用。
基于细胞大小和密度的分选方法
免疫荧光染色
利用特异性抗体对分选后的细胞进行免疫荧光染 色，通过显过检测特定基因的表达水平，评估分选后细胞 的纯度和功能状态。
分选结果的应用前景
疾病治疗
利用分选得到的树突状细胞及其前体细胞进行疾病治疗，如肿瘤 免疫治疗和自身免疫性疾病治疗。
药物筛选
将分选得到的细胞用于药物筛选，以发现具有潜在治疗作用的药物 分子。
pbmc分离注意事项
PBMC分离注意事项一、摘要PBMC（ Peripheral Blood Mononuclear Cells，外周血单个核细胞）分离是生物医学研究中常见的实验操作之一。
PBMC包括淋巴细胞、单核细胞、树突状细胞等，在免疫学、肿瘤学、血液学等领域的研究中具有重要意义。
然而，在进行PBMC分离时，需要注意许多细节和操作要点，以确保实验结果的准确性和可靠性。
本文将就PBMC分离的实验准备、操作过程和后续处理等方面的注意事项进行详细讨论，旨在提高实验操作效率和实验结果质量。
二、实验准备注意事项在开始PBMC分离之前，需要进行充分的实验准备工作。
以下是一些需要注意的事项：1.血液样本的采集和处理在进行PBMC分离之前，需要采集血液样本。
采血时应注意以下几点：首先，要选择适当的采血时间，如清晨空腹采血可以提高检测结果的稳定性；其次，应选择适当的采血方式，如静脉采血或动脉采血；最后，应使用适当的抗凝剂来处理血液样本，以避免血液凝固。
在采集血液样本后，应尽快将样本送往实验室进行处理。
2.实验器材和试剂的准备在实验前，需要准备好所需的实验器材和试剂。
应选择适当的离心管、吸管、细胞筛等实验器材，并确保这些器材的清洁度和无菌状态。
此外，需要准备适当的分离介质、洗涤液、培养基等试剂，并确保这些试剂的质量和浓度符合实验要求。
三、操作过程注意事项在PBMC分离的操作过程中，应注意以下事项：1.离心速度和时间的选择离心是PBMC分离的重要步骤之一。
在选择离心速度和时间时，应根据实验要求和实际情况进行权衡。
离心速度过高或时间过长可能导致细胞损伤或失活；离心速度过低或时间过短则可能导致分离不充分。
因此，需要根据分离介质的特性和所需细胞类型进行选择和调整。
2.操作过程的无菌化处理在PBMC分离过程中，应保持操作的无菌化处理。
所有实验器材和试剂应保持清洁和无菌状态，以避免污染和交叉感染。
此外，实验操作应在无菌操作台或超净工作台中进行，并穿戴适当的个人防护装备。
bmdc细胞提取步骤
bmdc细胞提取步骤BMDC（骨髓源性树突状细胞）的提取步骤通常包括以下几个步骤：1.准备工作：a.高效细胞培养基：根据实验要求选择适合的培养基，常见的包括RPMI-1640培养基、DMEM等。
b.包含20%胎牛血清（FBS）的细胞培养基。
c.手术器械：包括手术刀、剪刀、镊子和注射器等。
d.消化酶：常用的有胰蛋白酶和胶原酶等。
e.细胞培养条件：包括恒温恒湿的细胞培养箱以及含5%CO2的细胞培养箱。
2.动物准备：a.选择符合实验要求的动物（常用小鼠）。
b.按照实验室动物管理规定进行麻醉和安乐死操作。
c.用70%乙醇对动物表面进行消毒。
3.BMDC提取：a.彻底消毒动物表面后，在操作实验纸上将动物放置在耳板的背面。
b.使用消毒的剪刀和镊子，从动物的骨髓中提取骨骼。
c.将提取的骨骼置于含有培养基的试管中，并用注射器吸入10mL的培养基，将髓腔彻底清洁。
d.将清洗后的骨骼放在含有培养基的培养皿中，在恒温恒湿的培养箱中孵育24小时。
4.BMDC筛选和分离：a.24小时后，将培养皿中的骨骼取出，用胰蛋白酶和胶原酶进行胶原酶消化处理。
b.消化结束后，用细胞培养基将胶原酶停止消化，并通过筛选筛除未消化的骨骼颗粒。
c.将筛选后的纯化细胞放入含有培养基的96孔培养板中，每孔种植一定数量的细胞。
d.将种植后的培养板放入恒温恒湿的培养箱中进行细胞培养和观察。
5.细胞培养和扩增：a.用培养基进行细胞培养，每2-3天更换一次培养基。
b.确保培养皿内有适当的氧气和营养物质。
c.观察细胞的生长情况，密度达到一定程度后，用胰蛋白酶进行细胞裂解。
d.细胞数目达到要求后，用所需的方式进行实验或培养。
BMDC的提取过程需要严格的操作和分离步骤，确保获取纯化的树突状细胞，这对进一步的实验研究是非常重要的。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
试剂：红细胞裂解液(139 .6 mmol/L NH4Cl , 16 .96mmol/L Tris , 用1 mol/L HCl 调PH 至7 .2)和GKN缓冲液(8g/L NaCl , 0 .4 g/L KCl , 1 .77 g/L Na2PO4 , 0 .6 g/L NaH2PO4 , 2 g/L 葡萄糖, 0 .01 g/L 酚红), 均由本所配制, 高压灭菌, 4 ℃保存。
粒细胞巨噬细胞集
落刺激因子(GM-CSF)和白细胞介素-4(I L-4)均为深圳雅为生物公司产品, 均用PBS 配成1 mg/ L 储备液, 过滤除菌, 分装, -20 ℃保存, 临用时加入培养基配成终浓度50 ng/L。
树突状细胞的培养：
C57BL/6 小鼠, 拉颈处死, 浸入75 %的乙醇中5～10 min , 无菌手术取出股骨, 反复冲洗出骨髓, 直至骨变白, 收入15 ml 离心管中;离心(1 200r/min , 5min)弃上清, 收集沉淀的骨髓细胞。
以1∶10 的体积比加入37 ℃预温的红细胞裂解液, 反复吹打混匀,置室温2 ～ 4 min , 除去红细胞;以含10 %FCS 的RPMI 1640 配成
2 ×106/ml 骨髓细胞悬液, 分装于玻璃细胞培养瓶, 温育2 ～
3 h , 除去未贴壁细胞;, 然后用RMPI1640 完全培养基(添加1 mmol/ L 丙酮酸钠, 2 mmol/L 谷氨酰胺, 10 mmol/L Hepes , 8 .9 mmol/L NaHCO3 , 50 μmol/ L 巯基乙醇, 20 万u/L青霉素, 20 万u/L 链霉素, 50 ng/L GM-CSF 和50ng/L IL-
4 , 20 %的FCS)调细胞浓度为108/L , 加入6 孔培养板中, 每孔1 .
5 ～2 ml;放入37 ℃, 5 %CO2培养箱中培养, 隔日半量换液, 在培养的第3 天轻轻除去未贴壁细胞, 至第 5 ～7 天, 在倒置显微镜下观察其形态和数量的变化, 强力吹打即可收集DC。
主要试剂：
（1）红细胞裂解液(139 .6 mmol/L NH4Cl ,16 .96 mmol/L Tris , 用1mol/L HCl 调pH 至7 .2)本室配制;
（2）GKN 缓冲液(8 g/L NaCl , 0 .4 g/L KCl , 1 .77 g/L Na2HPO4·2H2O , 0 .6 g/L NaH2PO4·H2O , 2 g/L 葡萄糖,0 .01 g/L 酚红)本室配制, 这两种缓冲液均高压灭菌, 4℃保存。
（3）rmGM-CSF 和rmIL-4 均为美国R D Systems 产品, 分别用PBS 配成50 mg/L 和1 mg/L 储备液, 上述液体均需过滤除菌, 分装, -20 ℃保存, 临用时加入培养基配成终浓度分别500 ng/L 和200 ng/L 。
（4）抗鼠CD4 单克隆抗体(McAb)、抗鼠CD8 McAb 、抗鼠B 细胞McAb
（5）山羊补体液为美国GIBCO 产品, 用含1 g/L 牛血清白蛋白的PBS 缓冲液配成1 g/L补体储备液, 用时再按1∶15 稀释, 终浓度为66 .7mg/L。
实验步骤：
（1）1 .1 制备骨髓细胞
取健康6 ～ 8 周雌雄不拘的BALB/C 小鼠, 拉颈处死, 浸入体积分数为75 % 的乙醇中5 ～ 10 min , 无菌手术取出股骨和胫骨, 尽量剥去肌肉组织, 用GKN 洗涤3 次;剪去骨两端, 用GKN 洗涤2 次;再用5 ml 灭菌注射器抽取GKN , 将其针头分别从两端插入骨髓腔, 反复冲洗出骨髓, 直至骨变白,收入50 ml 离心管中;离心1 500 ～ 3 000 r/min , 弃上清, 沉淀细胞用GKN 重悬, 离心洗涤3 次, 收集沉淀的骨髓细胞。
1 .
2 树突状细胞及其前体的分离与培养[ 5, 6 , 8] 按下列(图1)程序, 分别从骨髓细胞中分离DC 及其前体。
根据上述所得的细胞压积, 以1∶10 的体积比加入37 ℃预温的红细胞裂解液, 反复吹打混匀, 室温,2 ～ 4 min , 加10 ml GKN 终止其反应, 同上离心洗涤2次;然后加入抗鼠CD4 McAb 、抗鼠CD8 McAb 、抗鼠B细胞McAb 各0 .5 ml , 重悬沉淀细胞, 混匀, 置冰浴或4℃冰箱30 min , 同上离心洗涤2 次;再按沉淀细胞压积, 以体积比1∶10 加入补体工作液(66 .7 mg/L)重悬。
细胞, 混匀, 37 ℃水浴, 30 min , 同上离心洗涤2 次, 收集沉淀细胞, 细胞计数;然后用RPMI 1640 完全培养基(添加1 mmol/L 丙酮酸钠, 2 mmol/L L-谷氨酰胺, 10mmol/L Hepes , 8 .9 mmol/L NaHCO
3 , 50 μmol/L 巯基乙醇, 20 万u/L 青霉素, 20 万u/L 链霉素, 体积分数为10 %～20 %的新生小牛血清), 调细胞浓度为108L-1,加入6 孔培养板中, 1 .5 ～ 2 ml 每孔;放入37 ℃, 体积分数为5 %CO2 培养箱中培养, 在其培养过程中轻轻移去细胞碎片和未贴壁细胞, 反复吹打收集所得的细胞即为DC 及其前体。
1 .3 细胞因子诱生DC/LC 与扩增培养
将上述连续排异所得的细胞培养24 h 后, 轻轻振动培养板,抽去培养液和悬浮
的细胞及碎片;或将所得的DC 及其前体重新铺板。
这时补加新的完全培养基含
有500ng/L rmGM-CSF 和200 ng/L rmIL-4 , 隔日半量换液, 每次轻振培养板, 吸去未贴壁细胞, 培养5 ～ 7 d , 并在倒置显微镜下观察其形态和数量的变化, 强力吹打即可收集DC/LC 。