一株耐辐射真菌的鉴定及黑色素分离提取

一株耐辐射真菌的鉴定及黑色素分离提取朱静;顾美英;王玮;宋素琴;谢玉清;唐琦勇;张丽娟;张志东【摘要】[目的]对耐辐射酵母状真菌进行黑色素粗提和特性研究.[方法]从辐射污染土样中分离筛选一株产黑色素的酵母状真菌,提取黑色素.[结果]通过形态和分子鉴定菌株为Aureobasidium pullulans.其黑色素在紫外光谱下具有强烈的吸收作用,并具有良好的热稳定性和光稳定性,尤其具有较强抗UV特性.将色素溶液与E.coli 菌液配伍,可提高UV辐射下的E.coli存活率.[结论]耐辐射黑酵母黑色素具有较强耐UV辐射能力,为天然黑色素的开发利用提供有利参考,同时为探讨耐辐射黑酵母产黑色素与其耐辐射特性之间的关系提供重要的研究材料和证据.【期刊名称】《新疆农业科学》【年(卷),期】2013(050)010【总页数】7页(P1858-1864)【关键词】黑酵母;黑色素;分离;提取【作者】朱静;顾美英;王玮;宋素琴;谢玉清;唐琦勇;张丽娟;张志东【作者单位】新疆农业科学院微生物应用研究所,乌鲁木齐830091;新疆农业科学院微生物应用研究所,乌鲁木齐830091;新疆农业科学院微生物应用研究所,乌鲁木齐830091;新疆农业科学院微生物应用研究所,乌鲁木齐830091;新疆农业科学院微生物应用研究所,乌鲁木齐830091;新疆农业科学院微生物应用研究所,乌鲁木齐830091;新疆农业科学院微生物应用研究所,乌鲁木齐830091;新疆农业科学院微生物应用研究所,乌鲁木齐830091【正文语种】中文【中图分类】Q93-3310 引言【研究意义】黑色素（melanin）是一种广泛存在于动植物和微生物中的非均质类多酚聚合体，依其化学组成可分为真黑色素（eumelanin）、棕黑色素（phaeomelanin）和异黑色素（allomelanin）。

依其分布和来源，可分为动物黑色素、植物黑色素和微生物黑色素[1]。

研究表明，黑色素能作为紫外吸收剂、抗氧化剂、自由基清除剂、生物农药的光保护剂、抗病毒药物及食用色素和化工染料等，广泛应用于日用化妆品工业、食品工业、医药化工、农业等众多领域[2 ～6]。

目前，黑色素的生产主要通过化学合成和生物氧化两种方法，利用微生物发酵所产的天然黑色素具有无毒、无害、稳定性强的特点而深受人们的欢迎[7]。

【前人研究进展】黑酵母（Black yeast）又名出芽短梗霉（Aureobasidium pullulans），为半知菌类短梗霉属，是一种具有酵母型和菌丝型形态的多形真菌。

其厚垣孢子积累黑色素[8]，可抵抗紫外线、高渗胁迫及重金属毒害等多种逆境[3，9 ～10]，还可作为单细胞蛋白、细胞壁多糖、胞外多糖、果胶酶、色素等的生产菌株[11]。

目前对真菌耐辐射特性和机理方面研究发现，黑色素的产生对真菌的耐辐射作用至关重要，可令其具有较高耐γ-射线辐照的能力[12]，部分真菌黑色素甚至可以俘获离子辐射能量作为能源[13 ～14]。

【本研究切入点】中国核辐射污染区地处新疆典型的干旱盐碱荒漠地区，具有我国独一无二、不可复制的特殊辐射生境，拥有众多的耐辐射微生物资源[8]。

国内外对该环境中的微生物研究甚少。

研究组前期对辐射污染区的耐辐射微生物资源进行调查，在耐辐射微生物的分类鉴定、功能产物的提取和特性等研究过程中，发现了一株具有高耐辐射特性的黑色酵母状真菌，该菌株在生长过程中可大量产生黑色素[8]。

【拟解决的关键问题】研究从新疆辐射污染土样中分离筛选出一株黑色酵母状真菌，并对其黑色素的分离提取进行研究，为黑酵母天然黑色素的开发利用提供理论依据。

1 材料与方法1.1 材料1.1.1 土样采集样品采自新疆辐射污染环境地表5 ～20 cm土壤，迅速置于无菌50 mL离心管中，4℃冰箱保存。

1.1.2 培养基（1）马铃薯葡萄糖培养基（PDA，g/L）：马铃薯200，葡萄糖20，琼脂粉16。

YPD培养基（g/L）：蛋白胨20，酵母抽提物10，葡萄糖20。

（2）MEA培养基（g/L）：麦芽浸粉30，大豆蛋白胨3，琼脂粉16。

（3）查氏培养基（g/L）：NaNO3 2，K2HPO4 1，KCl 0.5，MgSO4 0.5，FeSO4 0.01，蔗糖30，琼脂粉16。

1.2 方法1.2.1 菌种的筛选取采集的土样12 g分装于15 mm×150 mm无菌试管中，置于60 Coγ射线下进行10 kGry剂量辐照处理，然后向试管中加入5 mL液体查氏培养基，28℃振荡富集3 d。

取1 mL上述富集液移入装有9 mL无菌生理水的试管中，依次进行梯度稀释后，取0.2 mL稀释液涂布于查氏培养基和YPD平板上，于28℃恒温条件下培养7 d，观察菌落生长情况，挑取单菌落进行纯化。

1.2.2 LSU rDNA D1/D2 区的PCR扩增将菌株接种于液体MEA培养基，于28℃恒温条件下培养4 d，离心收集菌体，使用TE洗涤3 遍。

菌体经液氮研磨后，DNA提取参照Gerrits等[15]方法，DNA经70%乙醇洗涤后自然干燥，加入50 μL无菌的双蒸水，4℃下溶解2 h，20℃保存备用。

LSU rDNA D1/D2 区的PCR扩增采用真菌通用引物，NL1：5′-GCATATCGGTAAGCGGAGGAAAAG-3′，NL4：5′-GGTCCGTGTTTCAAGACGG-3′，扩增条件为：95℃5 min；94℃1 min，52℃1 min，72℃2 min，共35 个循环；72℃10 min[16]。

PCR产物经切胶纯化（上海鼎国生物技术公司胶回收试剂盒）回收，加去离子水溶解，送上海生工公司测序。

1.2.3 系统进化树的构建和分析将实验菌株所得的LSU rDNA D1/D2 区序列与GenBank 数据库中的已知序列进行BLAST比较，确定与实验菌株亲缘关系最近的种属。

从数据库获得相关种属的序列，并结合真菌生物多样性研究中心数据库（http：//www.cbs.knaw.nl/databases/）的标准模式菌序列，利用MEGA 5.0 软件包[17]采用邻接法（Neighbor-Joining method）进行聚类分析和系统进化树构建，确定菌种生物学分类地位。

1.2.4 黑色素的提取从新鲜斜面上挑取一环菌苔接种于液体PDA发酵瓶中，于28℃180 r/min 震荡培养7 d 后，10 000 r/min 离心5 min，去上清，并用无菌水洗涤3 遍，加入与发酵液等等体积的1 mol/L NaOH溶液充分振荡后，加热沸腾回流浸提2 h 后，10 000 r/min 离心5 min，收集上清液，用浓HCl调pH值至2 ～3 左右，静置过夜，然后10 000 r/min 离心5 min，弃上清。

色素沉淀再次使用1 mol/L NaOH 溶解，HCl沉淀后，将黑色素粗提物于100℃真空干燥至恒重。

1.2.5 黑色素的纯化将上述黑色素粗品重新溶于1 mol/L NaOH水溶液中，8 000 r/min 离心10 min 所得上清液用6 mol/L HCL酸化至pH为2 ～3 左右，6 000 r/min 离心10 min 所得沉淀用蒸馏水洗涤至中性烘干，再经DMSO溶解，5 000 r/min 离心10min，用酸性甲醇（pH=2）做沉淀剂并重复2 次，最后的沉淀用丙酮洗涤3 次，烘干备用。

1.2.6 黑色素的紫外光谱测定将色素溶于1 mol/L的NaOH中，并以1 mol/L的NaOH溶液作参比液，用紫外分光光度计于200 ～800 nm进行光谱扫描，测定黑色素的光吸收曲线。

1.2.7 温度对黑色素的影响分别取10 mL色素碱溶液置于比色管中，封口置于不同温度下的恒温水浴中保温，每隔30 min 取样一次，自来水冷却后，在400 nm处测定OD，观察温度对色素的影响。

1.2.8 自然光对黑色素溶液的影响分别取两份10 mL色素碱溶液置于9 cm培养皿中，1 份置于自然光下放置5 d，每间隔1 d 取样，另1 份在紫外灯下（15 W，30 cm下，敞口）处理30 min，60 min 和1.5 h 后，在400 nm处测定OD，观察自然光对色素的影响。

1.2.9 黑色素对E.coli耐辐射特性的影响向E.coli菌悬液中加入黑色素提取物，使其终浓度为0.01 g/L，置15 W UV紫外灯下30 cm处振荡辐照处理，每隔一定时间取样1 次，以平板涂布法检测E.coli的存活量，以未进行发酵培养的PDA培养基提取物为对照。

2 结果与分析2.1 菌株的筛选和鉴定2.1.1 菌株的筛选和形态观察通过色素形成时间和菌落形态特征观察，从辐照处理过的土壤样本中分离出一株黑色酵母状真菌，编号F19。

该菌株可在4 ～30℃正常生长，最佳培养温度28℃，可耐15%NaCl。

在PDA培养基，28℃培养条件下，菌落初期均为酵母样，粘稠、污白色。

菌落后期真菌菌丝体嵌入培养基，菌落转暗为黑色或棕黑色，凸起，菌落大小为2.0 ～3.0 cm。

显微镜下观察具有丝状体，培养过程中未见菌体产多糖。

图1，22.1.2 菌株的分子鉴定为进一步确定菌种的分类地位，通过对菌株LSU区序列的比对分析，调取相应的模式菌序列，利用MEGA 5.0 进行系统发育树的构建及分析。

结果表明，实验菌株为Aureobasidium属，与A.pullulans var.melano-genum CBS 105.22T和CBS 621.80 聚在一个分支中，支持率为94%，最大同源性99.8%。

图3图1 菌落形态Fig.1 The morphology of colonies图2 菌丝体显微形态Fig.2 The morphology of mycelium图3 依据LSU r DNA D1/D2 区序列的N-J 法构建的系统进化树Fig.3 Neighbor-Joining tree of isolates and related species based on LSU D1/D2 domainsequences2.2 黑色素的紫外光谱分析研究表明，黑色素在测定全波长中具有明显的吸收，特别在紫外光谱下具有一定的吸收作用，在275 nm处有一特殊吸收峰，与此前报道Aureobasidium属来源的黑色素有明显的差异。

说明该黑色素不具有共轭双键体系或芳环结构。

并且可能受黑色素中蛋白、多肽及核酸等杂质影响。

原因可能是由于黑色素为高度聚合的阴离子化合物，极易与带电荷的蛋白结合而不易分开。

图4图4 黑色素光吸收扫描曲线Fig.4 UV spectrum of melanin2.3 温度对黑色素溶液的影响研究表明，色素溶液在40、60、80℃下，色素的吸光值随着测定时间的延长而出现升高趋势，可能是在水浴加热过程中有水分丢失，或在高温下引起色素的聚合，吸光值增大。