植酸酶的测定-关松荫
微生物植酸酶在体外条件下活性的测定
微生物植酸酶在体外条件下活性的测定东北农业大学动物营养研究所 石宝明 单安山 由于添加无机磷导致粪便中磷的排出量增多,污染水源和土壤,同时磷酸氢钙还易导致氟中毒和其他重金属中毒,因此在饲料中添加植酸酶代替直接添加无机磷日益受到重视。
植酸酶的应用效果,关键在于其在消化道中的活性。
自然界有许多不同的植酸酶来源,通过遗传工程技术,利用微生物(黑曲霉—Aspergillus niger)发酵工程技术生产饲用植酸酶,已成功地应用于猪和家禽中。
本试验是应用这种微生物植酸酶,以玉米、豆饼、麦麸为植酸磷载体,模拟畜禽胃肠消化道环境,在体外条件下测定微生物植酸酶的活性。
1 材料与方法111 试验材料 微生物植酸酶,由德国BASF公司提供。
112 试验设计11211 时间与微生物植酸酶的活性 准确称取玉米、豆饼、麦麸各4g,固定温度为40℃,加入pH为515的乙酸溶液10m L和011g植酸酶,振荡混匀,在催化时间分别为2、3、4、5、6、7、8、9、10、11h后,加入4m ol/L盐酸3m L中止反应,然后置烘干箱中烘干,烘干后用TC A法测植酸磷含量,计算出植酸磷降解率。
11212 温度与微生物植酸酶的活性 准确称取玉米、豆饼、麦麸各4g,加入pH515的乙酸溶液10m L和011g植酸酶,振荡混匀,在催化温度分别为25、30、35、40、45、50、55、60、65、70℃下,反应4h后加入4m ol/L盐酸3m L中止反应,然后置烘干箱中烘干,烘干后用TC A法测植酸磷含量,计算出植酸磷降解率。
11213 pH与微生物植酸酶的活性 准确称取玉米、豆饼、麦麸各4g,固定温度40℃,加入011g 植酸酶,振荡混匀,然后分别加入pH为210、215、310、315、410、415、510、515、610、615、710的乙酸溶液10m L,反应4h后加入4m ol/L盐酸3m L中止反应,然后置干燥箱中烘干,烘干后用TC A法测植酸磷含量,计算出植酸磷降解率。
饲料原料为底物_植酸酶体外磷释放量的一种快速测定方法
饲料原料为底物，植酸酶体外磷释放量的一种快速测定方法目前，植酸酶作为饲料添加剂在饲料工业中的应用已经非常广泛，不仅应用于猪和家禽饲料中，而且在水产饲料中的应用也较为广泛。
在饲料中添加植酸酶是一种提高动物利用饲料原料中植酸磷能力的有效途径。
不论是 3-植酸酶（肌醇六磷酸 3-磷酸水解酶）还是 6-植酸酶（肌醇六磷酸 6-磷酸水解酶），都可以有效地从底物中释放出磷。
通常情况下，植酸酶先按照设计比例添加于动物日粮，再调整磷酸氢钙添加量。
因此，正确评估植酸酶释放无机磷的能力具有十分重要的意义。
目前，国内有多种植酸酶活性测定方法，包括国标（GB/T 18634-2002）和不同企业标准，但均有一个共同特点：以植酸钠纯品（Sigma p-0109或 p-8810）为底物评估酶活。
下面着重介绍以饲料原料为底物，快速测定植酸酶体外释放磷的方法。
1材料与方法1.1 试剂及仪器参照 GB/T 18634-2002。
1.2 底物制备将常用饲料原料底物如豆粕、玉米、菜籽粕、棉粕和麸皮分别粉碎至大约 60 目，按照饲料配方中常用的比例配制两种不同比例（表 1）的配方，将其混和，充分搅拌均匀。
表1底物饲料配方原料底物 1 底物 2玉米 65% 62%豆粕 20% 20%棉粕 2% 6%菜籽粕 1% 3%麸皮 5% 4%植酸磷含量 0.28% 0.22%总重 930g 950g1.3 酶样品来源本试验采用的植酸酶产品来自两种不同厂家的植酸酶产品。
酶活保证值：样品 1 为5 000 U/g；样品 2 为 10 000 U/g。
1.4 标准曲线制备准确称取 0.680 4g 在105℃烘至恒重的基准磷酸二氢钾于 100mL 容量瓶中，用乙酸缓冲液（0.25mol/L，pH5.5）溶解，并定容至 100mL，浓度为 50.0mmol/L。
按表 2 的比例稀释成不同浓度，按照表 3 进行操作。
标准空白为 4mL 乙酸缓冲溶液（0.25mol/L，pH 5.5）与 8mL 终止液混合液。
植酸酶酶活测定方法的研究
图,
钼蓝法标磷测定曲线
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以发酵液为酶液， 以灭活酶液作 对照菌种酶活测定方差分析
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表" 以发酵液为酶液以灭活酶液作对照菌种酶活测定结果
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表, 培养液无机磷含量与培养时间的关系
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表& 发酵液透析不同时间的结果
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植酸酶活力的测定方法及应注意问题
２ ． 酸 亚 铁 一钼 蓝 法 ２硫
该方法利用植酸酶可以水解植酸磷释放无 机磷 的原理， 通过加入三 盐酸使水解反应停止， 然后加入钼酸铵及 Ｆ Ｓ ７ ２ ｅ Ｏ ・Ｈ０的混 合液使 溶液 显色， ７ ０ ｍ波长下测定其 吸收值， 在 ２ｎ 以标准酶 为参照物 ， 间接计算 被测 样 品 中 酸 酶 的 含 量 。
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科技信息
博士 ・ 专家论 坛
槽酸酶活力昀测定方法及应注意问题
石 家庄职 业技 术学 院化 学工程 系 郭会灿 石 药 集 团维生 药业 李会 然
［ 摘 要 ］ 活力大小是衡 量酶制 剂质量的主要指标， 酶 选择 具有高度专一性和灵敏 度的酶 活测定 方法是酶制剂质量的保 障。 ［ 关键词 ］ 植酸酶 酶活力 测定 方法
植酸酶活性测定
饲用植酸酶活性的测定分光光度法1范围本标准规定了以分光光度法测定饲用植酸酶活性的方法。
本标准适用于作饲料添加剂用的植酸酶产品，也适用于添加有植酸酶的配合饲料、浓缩饲料和添加剂预混合饲料。
样品最低检出量为90U／kg。
2 引用标准下列标准所包含的条文，通过在本标准中引用而构成为本标准的条文。
本标准出版时，所示版本均为有效。
所有标准都会被修订，使用本标准的各方应探讨使用下列标准的最新版本的可能性。
GB／T 6682—1992 分析实验室用水规格和试验方法(neq ISO 3696：1987)3 植酸酶活性单位定义样品在植酸钠浓度为5.0 mmol／L、温度37℃、PH值5.00的条件下，每分钟从植酸钠中释放1μmol无机磷，即为一个植酸酶活性单位，以U表示。
4 方法原理植酸酶在一定温度和pH条件下，水解底物植酸钠，生成正磷酸和肌醇衍生物，在酸性溶液中，用钒钼酸铵处理会生成黄色的[(NH4)3PO4NH4VO3·16MoO3]复合物，在波长415nm 下进行比色测定。
5 试剂和溶液本标准中所用试剂，在没有注明其他要求时，均指分析纯试剂和符合GB／T 6682中规定的三级水。
清洗试验用容器不要用含磷清洗剂。
5.1 0.25mol／L 乙酸缓冲液(I)称取34.02g三水乙酸钠于1000mL容量瓶中，加入900mL水溶解，用冰醋酸调节pH至5.00±0.01，并用蒸馏水定容至1000mL，室温下存放2个月有效。
5.2 0.25mol／L乙酸缓冲液(Ⅱ)称取34.02g三水乙酸钠，0.5g TritonX-100,0.5g牛血清白蛋白（BSA）于1000mL容量瓶中，加入900mL水溶解，用冰醋酸调节pH至5.00±0.01，并用蒸馏水定容至1000mL，室温下存放2个月有效。
5.3 7.5mmol/L植酸钠溶液 c(C6H6O24P6Na12)为7.5mmol／L称取0.6929g肌醇六磷酸钠(C6H6O24P6Na12)于100mL。
解读饲用植酸酶测定的国标方法
解读GB/T 18634-2002《饲用植酸酶活性的测定分光光度法》武汉新华扬生物有限公司詹连生摘要：国标GB/T18634-2002《饲用植酸酶活性的测定分光光度法》实施四年多来，为国内植酸酶工业的发展作出了重大贡献，但在实施过程中又受到了国内不少人士和企业的质疑，本文拟从实验室试验结果来探讨其科学性和严谨性，以期使更多的人士和企业能对国标有更进一步的全面认识。
关键词：国标植酸酶定义 pH值科学性严谨性国标“GB/T 18634-2002《饲用植酸酶活性的测定分光光度法》”（以下简称“国标”）是我国第一部关于植酸酶的国家推荐标准，实施四年多来，该标准为我国植酸酶工业的发展作出了重大贡献！但由于该标准的制订是基于早期的巴斯夫（BASF）植酸酶活性测定标准及产品特性基础上，而我国植酸酶工业在此阶段却在迅速的发展，通过植酸酶菌种的优选和基因化工程，使植酸酶产品的特性朝着越来越利于动物营养方向优化，致使现行国标在科学性、严谨性和适用性上出现了明显的缺憾，无法体现植酸酶的特性优势，从而在某种程度上又阻碍了我国植酸酶工业的发展！故找来最新版本的《BASF植酸酶活性测定（KC9505第三修订版）》，结合“武汉新华扬生物有限公司Q/XHY0020-2005《饲用植酸酶》”，对现行国标进行认真地解读，并以实验室真实数据来一一验证。
一、首先，对植酸酶活性单位定义科学性的理解，定义中有三个条件：植酸钠的浓度、反应温度和pH 值。
1、植酸钠的浓度植酸酶活性测定的原理是，植酸酶在一定温度和pH条件下，在一定浓度的植酸钠盐溶液中能够从肌醇六磷酸中释放出无机磷；加入钒钼酸铵反应液可以终止反应，并与释放出来的无机磷反应生成黄色的钒钼酸磷复合物。
用分光光度计在415nm波长处检测复合物的浓度，即可计算出样品中的相应酶活。
在试验中，我们注意到，只要所加入的植酸钠的量能足够保证反应所需即对实验结果毫无影响。
也就是说：植酸钠在一定浓度范围内波动，对植酸酶活性的检测没有影响！2、反应温度一般来说，酶在动物体内的活动环境温度均在37℃左右，因此，结合动物体内最适宜酶激活温度，将植酸酶酶活的表现温度定为37℃是合适的。
国标绝对法测定植酸酶产品活性的关键控制点
国标绝对法测定植酸酶产品活性的关键控制点畜禽饲料中添加使用微生物发酵生产的植酸酶可提高植物性饲料中植酸及其盐的利用率, 减少日粮中磷酸氢钙等磷源的添加量, 降低饲料成本, 目前已经被广泛使用。
为了确保实际生产中植酸酶使用效果, 如何准确测定植酸酶产品的酶活性是养殖场、饲料企业和酶制剂生产、经销商所共同关注的问题。
目前, 国内植酸酶产品酶活性测定大多采用国家标准 GB/T 18643—2002《饲料用植酸酶活性的测定分光光度法》。
该方法标准中, 包括两种方法: 绝对法和相对法。
该测定方法的分析步骤不是很复杂, 所涉及的仪器设备饲料企业的实验室也都有配备, 但要获得准确和重复性好的分析结果也不容易, 需要加强对检测原理和步骤的理解。
该方法是基于样品在植酸钠浓度为 5.0 mmol/l、温度37 ℃、pH 值 5.50 条件下, 每分种从植酸钠中释放 1 μmol 无机磷,即为 1 个植酸酶活性(以 U 表示)的定义基础上测定的。
鉴于绝对法应用比较普遍, 现将我们在开展植酸酶产品活性测定过程中一些经验体会总结如下, 供同行们参考。
1 溶液配制植酸酶活性测定直接所用到的溶液主要有 3 种,即乙酸缓冲溶液、植酸钠底物溶液和显色终止液。
1.1 乙酸缓冲溶液国标方法中, 绝对法测定植酸酶产品酶活性所使用的乙酸缓冲溶液浓度为:c(CH3COONa·H2O)=0.25 mol/l。
缓冲溶液是确保整个酶反应体系的 pH 值在规定范围内的关键因素, 必须准确配制。
1.1.1 配制方法称取 34.02 g 三水乙酸钠,0.1 g 吐温 20 于 1 000 ml容量瓶中, 加入 900 ml 水溶解, 用乙酸调节 pH 值至!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!《饲料工业》·2008 年第 29 卷第 14 期检测技术475.50±0.01, 室温下贮存 2 个月有效。
植酸酶的测定
一、测定原理
钼黄法(偏钒酸铵法)原理:植酸酶在一定温度和pH值条件下,水解底物植酸钠,生成正磷酸和肌醇衍生物,在酸性环境中,用钒钼酸铵处理生成黄色复合物,在415nm波长下进行比色分析。
二、反应条件的探讨
1、反应体系的温度及加热时间的探讨
由上图可知，在温度为45摄氏度左右时，植酸酶的活性达到最大，所以在酶促反应时应使温度稳定在45℃左右，植酸酶的作用效率才最大。
标准稀释比例
标准溶液序号
稀释量
浓度/(μmol/ml)
1
0.5→16
1.5625
2
0.5→8
3.1250
3
0.5→4
6.2500
4
0.5→2
12.5000
5
0应顺序进行操作，标准空白加入。2ml乙酸缓冲液。在反应过程中，从加入底物溶液开始，向每只试管中加入试剂的时间间隔要一致，在恒温水浴45℃水解30min。
9、混合
√
√
总体积
10ml
10ml
注：①终止及显色液：移取两份硝酸溶液（1+2水溶液），一份偏巩酸氨溶液混合后使用，现用现配。
②乙酸缓冲液,c=0.25mol/L:称取20.52g无水乙酸钠于1000ml烧杯中，加入900ml水搅拌溶解至刻度。
4、样品测定反应后的溶液在室温下静置10min，如出现浑浊需在离心机上离心去沉淀，上清以磷酸标准曲线空白调零，在分光光度计415波长处测定试样空白（A0）和是试样溶液（A）吸光值，A-A0为实测吸光度值。用直线回归方程计算植酸酶的活性。
2、反应溶液pH的探讨
由上图可知，在PH为5左右时，植酸酶的活性达到最大，所以植酸酶缓冲液提供的的PH环境应在5左右
3、不同的离子及离子浓度对植酸酶活性的影响
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土壤植酸酶的测定
1 分析意义植酸酶参与土壤含磷化合物的主要部分—植酸及其衍生物的脱磷酸化作用。
水解作用产物是植物的磷源。
2 测定原理土壤植酸酶催化肌醇六磷酸化合物，水解成肌醇和六个分子的磷酸。
测定植酸酶常以植酸钠为基质，以酶解所产生的无机磷量表示酶活性。
3 试剂配制
（1）植酸钠
（2）甲苯
（3）钼酸铵溶液25g钼酸铵加热溶于200mL蒸馏水中。
另取1L容量瓶加500mL水，再慢慢加入280mL浓硫酸，再将钼酸铵溶液加入，随加随摇匀，定容至1L，贮于棕色瓶中。
（4）（NH4）2SO4-H2SO4溶液取3g（NH4）2SO4加20mL 0.1N H2SO4，溶于1L 蒸馏水中。
（5）氯化亚锡溶液取2.5gSnCl2·2H2O溶于100mL10%HCl中。
（6）磷的标准溶液准确称取0.4392gKH2PO4，溶于1L水中即成标准液。
再稀释10倍得1mL含0.01mg磷的工作液。
标准曲线的绘制分别取1,3,5,7,9和10mL磷的工作液于50mL容量瓶中，加30mL 蒸馏水和2mL钼酸铵溶液，摇匀加入3滴氯化亚锡液，显色后稀释至刻度，摇匀并在分光光度计上于650nm处比色测定。
4 操作步骤称5g土壤置于100mL三角瓶中，加1mL甲苯，15min后再加10mL 植酸钠溶液，于37℃恒温箱中放置24h。
培养结束后，加50mL（NH4）2SO4-H2SO4溶液在振荡机上振荡50min。
过滤后吸取10mL滤液，置于50mL容量瓶中。
按绘制标准曲线的显色方法比色测定。
由标准曲线求出磷的含量（P2O5mg）表示植酸酶活性。