2.2土壤植酸酶测定
植酸酶酶活测定
四.实验步骤： 实验步骤：
1. 标准曲线的制作
(1)按下表的比例稀释成不同磷浓度溶液 (1)按下表的比例稀释成不同磷浓度溶液
标准符 标准 号 磷液 /ml 蒸馏 水/ml 相当于 无机磷 /ug 显色液 /ml OD660nm
1 2 3 4 5 6
0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0
3.0 2.8 2.6 2.4 2.2 2.0
0.9ml（TCA） 0.9ml（植酸 （ ） （ 钠） 3ml √ 3ml √
水浴显色20min 水浴显色
20分钟后， 20分钟后，四只 分钟后 试管中现象
用分光光度 计测OD值 计测 值
实验得到四只试管中的样液的OD值 值 实验得到四只试管中的样液的
A0(参照 = 0 A1= 0.547 参照) 参照 A2= 0.490 A3= 0.523
实验用品： 三.实验用品： 实验用品
• 试剂 乙酸缓冲液、植酸钠溶液、10%三 试剂：乙酸缓冲液、植酸钠溶液、 乙酸缓冲液 三 氯醋酸溶液、 钼酸铵溶液、 氯醋酸溶液、2.5%钼酸铵溶液、10%Vc 钼酸铵溶液 溶液、 硫酸溶液、 溶液、17%硫酸溶液、磷酸二氢钾、显色 硫酸溶液 磷酸二氢钾、 液配制： ） 液配制：（6）︰（水）︰（4）︰（5）=1︰2︰1︰1 ） ） ︰ ︰ ︰ • 仪器：恒温水浴锅、分光光度计、离心机、 仪器：恒温水浴锅、分光光度计、离心机、 烧杯、容量瓶、 烧杯、容量瓶、移液管
摇瓶
3000r/min离心 min 离心15
（2） 酶活测定 ）
反应顺序
1. 加酶液 2. 加植酸钠 加植酸钠/TCA溶液 溶液 3. 加乙酸缓冲液 4. 混合均匀 5. 37℃水解 ℃
样品
0.3ml 0.9ml（植酸钠） （植酸钠） 0.9ml √
植酸酶活力的测定方法及应注意问题(精)
科技信息植酸酶是催化植酸及植酸盐水解成肌醇与磷酸的一类酶的总称 [1]。
植酸酶是一种胞外酶 [2], 广泛存在于自然界中, 植物、动物、微生物均可产生植酸酶。
植酸酶的活性因来源不同而有差异。
植酸酶能将肌醇六磷酸 (植酸分解成为肌醇和磷酸。
植酸酶可以专一性地水解植酸中的磷酯键, 使磷酸游离出来, 植酸酶将植酸分子上的磷酸基团逐个切下, 形成中间产物肌醇五磷酸、肌醇四磷酸、肌醇三磷酸、肌醇二磷酸、肌醇一磷酸、终产物为肌醇和磷酸 [3]。
植酸酶的作用机理见图 1。
图 1植酸酶的作用机理1. 植酸酶酶活力测定的意义酶活力也称酶活性, 是指酶催化一定化学反应的能力, 用在一定条件下, 酶所催化某一反应的速率表示。
酶活性是研究酶的特性, 分离纯化以及酶制剂生产和应用时的一项不可缺少的指标。
酶活力单位是以酶活力为根据而定义的。
国际生化协会酶委员会规定, 1min 内将1μmol 的底物转化为产物的酶量定为 1个单位,称为标准单位, 同时规定了酶作用的条件。
因标准单位在实际应用时不够方便, 故在生产上往往根据不同的酶, 制定各自不同的酶活力单位。
在测定酶活力时, 对反应温度、 pH 、底物浓度、作用时间都有统一规定, 以便同类产品互相比较。
但是酶活力单位并不能直接反映酶的绝对数量, 只不过是一种相对比较的依据 [4]。
植酸酶活性的定义为:在最适宜条件下, 每分钟从一定浓度的植酸钠溶液中释放1μmol 的无机磷所需要的酶量为一个酶活力单位。
确定植酸酶的酶活, 可以提高实验的标准性和效率。
2. 植酸酶活力测定的原理及方法酶活力测定的原理都是利用酶水解植酸钠形成无机磷,然后测定无机磷的释放量。
植酸酶活性的测定方法较多 , 但至今尚没有被世界普遍公认的植酸酶的定量分析方法。
方法包括:钒 -钼酸铵法、硫酸亚铁 -钼蓝法、 Vc-钼蓝法、丙酮 -磷钼酸铵法、微板法和微量比色法等 [5]。
可根据实验需要选择不同的方法。
2.1钒 -钼酸铵法该方法是利用植酸酶可以水解植酸磷释放出无机磷的原理。
饲用植酸酶活性测定关键控制点
饲用植酸酶活性测定关键控制点于洪莲【期刊名称】《《饲料博览》》【年(卷),期】2019(000)008【总页数】4页(P38-40,44)【关键词】饲用植酸酶; 酶活性; 测定方法【作者】于洪莲【作者单位】广东溢多利生物科技股份有限公司广东珠海 519060【正文语种】中文【中图分类】S816.7随着畜牧业的发展和饲料生产水平的提高，植酸酶作为一种绿色环保型添加剂广泛应用于单胃动物饲料中，其通过催化将饲料原料中丰富的植酸及植酸盐分解为能被动物利用的无机磷和肌醇，可有效提高植物性饲料中磷、矿物质元素和蛋白质的可利用率，提高动物生产性能，因此植酸酶在饲料生产中可定量取代或减少无机磷的添加量，在降低畜禽养殖成本的同时还减少了动物粪便中磷的排放量，减轻磷对环境污染。
植酸酶的研究对解决环境污染和满足营养需求方面有着重要意义。
饲用酶制剂活性分析与检测在饲料工业中具有重要的作用，酶制剂生产企业通过检测产品酶活力来监控产品稳定性，保证酶制剂产品品质，饲料生产企业需要通过检测饲料产品中酶制剂的含量来验证其添加效果（即饲料中酶的活力保存率），以保障饲料品质，因此酶活力的测定是控制酶制剂产品质量的关键环节，也是使用效果的基本保障。
如何准确检测植酸酶含量是许多饲用酶制剂工作者普遍关心的问题。
本文以国标检测方法为依据，综述了植酸酶活力测定方法及检测中关键控制点，以期为植酸酶的检测提供可行性参考。
1 植酸酶活性测定的方法及原理1.1 测定方法《饲用植酸酶活性的测定分光光度法》是现行有效的饲用植酸酶活性测定的国标方法，即GB/T 18634-2009。
本文以国标检测方法为依据。
1.2 测定原理依据国标检测方法，其原理为：植酸酶在一定温度和pH条件下，将底物植酸水解，生成正磷酸和肌醇衍生物。
在酸性溶液中，能与钒钼酸铵生成黄色的复合物，可于波长415 nm下进行比色测定[1]。
1.3 植酸酶活性单位酶活性单位定义为：样品在37 ℃、pH 5.5 的条件下，每分钟从浓度为5.0 mmol·L-1植酸钠溶液中释放出1 μmol 无机磷，即为一个植酸酶活性单位，以U 表示[1]。
植酸酶测定
植酸酶活性测定植酸(Phyticacid).其化学名称为六磷酸肌醇，由1分子肌醇和6分于鳞酸结合而成，分子式是C6H18O24P6,通式为C6H6[OPO(OH)2]6,分子660.8。
植酸及植酸盐中的磷即为植酸磷，植酸广泛存在于谷物籽实和油料作物种子。
植酸酶(phytases)能将磷酸残基从植酸上水解下来，因此破坏了植酸对矿物元素强烈的亲和力，所以说植酸酶能增加矿物元素的营养效价，而且由于释放出的Ca2÷可参加交联或其他反应中去，从而改变了植物性食品的质地。
植酸酶一般只适于在单胃动物中使用。
反刍动物由于瘤胃微生物能合成植酸酶，因此在饲料中一般不需要使用植酸酶。
植物体中的植酸一般不以游离形式存在，而是与钙、镁、钠、钾等结合形成复合盐，植酸盐在多数植物中以植酸钙镁复盐的形式存在，但大麦中主要是植酸钾镁复盐，小麦中主要是植酸铁。
饲料中的无机磷可直接为肠道所吸收，而有机磷则需要先经酶的作用水解为无机磷，然后方能为肠道吸收。
单胃动物消化道中无分解植酸的植酸酶，故对植酸磷的利用率很低。
植酸的抗营养作用不仅表现在植酸磷的低利用率上，还通过整合或络合作用影响其它矿物元素如铁、锌、铜、钙以及蛋白质的可消化性，并抑制淀粉酶、胰蛋白酶、胄蛋白酶的活性。
测定原理植酸酶可以水解植酸钠释放出无机磷，通过加入锐铝酸核显色/终止液使水解反应停止，同时与水解释放出的无机磷产生颜色反应，形成黄色的帆铝磷络合物(NHQ PO4NH4VO3-16M O O3;,在415nm波长下测定磷的含量，以标准磷溶液为参照，计算酶活。
植酸酶的含量以酶活性单位表示。
1植酸酶单位定义为:在37℃、pH5.5的条件下，1分钟内从0.005ImOIL的植酸钠溶液中释放出1微摩尔(UmoD无机磷所需要的植酸酶量。
操作步骤样品准备样品粉碎过后过60目筛。
称取2.0g左右粉碎样品，放入4个IOomL烧杯中(每种样品4个重复)。
加入50 mL浓度为0.25 mL、PH为5.50、在冰箱中冷却的乙酸缓冲液并用磁力搅拌器搅动60分钟，使酶蛋白充分溶出，制成一个悬浮液。
植酸酶活性的测定——钼蓝法(精)
植酸酶活性的测定——钼蓝法1 原理针对预混料复杂的物料体系，用不同的缓冲液对其进行抽提，最大限度的减少饲料中无机磷，微量元素，多维及其他成分对植酸酶测定的影响，用钼蓝法对抽提液中植酸酶活性进行定量。
植酸酶在一定温度和pH条件下，水解底物植酸钠生成正磷酸和肌醇衍生物，在酸性环境中与钼酸铵显色剂反应生成蓝色的（Mo2O3•MoO3）复合物，在波长700nm下比色测定。
酶活力单位定义：在37℃、pH5.0条件下，每分钟从5.0mM植酸钠溶液中释放出1微摩尔的无机磷定义为1个酶活力单位（U）2 试剂本规定中所用试剂，在没有注明其它要求时，均指分析纯试剂；所用溶剂和水无注明时，均指蒸馏水。
清洗实验用容器不要用含磷清洗剂。
2.1 乙酸缓冲液A（0.25mol/L）：称取14.355g无水乙酸钠，加入0.5gTriton X-100和0.5g牛血清白蛋白，900ml水溶解，冰乙酸调pH值至5.00±0.01，水定容至1000ml。
2.2乙酸缓冲液B（0.25mol/L）：称取14.355g无水乙酸钠，加入1.0g吐温-20和30gEDTA，900ml水溶解，冰乙酸调pH值至5.00±0.01，水定容至1000ml。
2.3 植酸钠溶液（6.25mmol/L）：称取577.4mg肌醇六磷酸钠，加入574.2mg无水乙酸钠，90ml水溶解，冰乙酸调pH值至5.00±0.01，水定容至100ml，现用现配（实际反应液中的最终浓度为5.0mmol/L）。
2.4 终止液：5%三氯乙酸（5%TCA）。
2.5 1.5％钼酸铵（试剂A）：7.5g钼酸铵溶于400ml水中，慢慢加入22ml浓硫酸，水定容到500ml，冰箱储存，有效期1个月。
2.6 2.7％硫酸亚铁（试剂B）：冰箱储存，有效期1个月。
2.7 显色剂：移取4份试剂A（2.5），1份试剂B（2.6）混合后使用，现用现配。
2.8 磷酸二氢钾：称量前于烘箱中烘至恒重，用乙酸缓冲液（2.2）配制50mmol/L标准液，再用50mmol/L 配制成4.0mmol/L磷酸二氢钾，溶剂为乙酸缓冲液（2.2），冰箱储存。
饲料中植酸酶活性测定方法探讨
饲料中植酸酶活性测定方法探讨摘要:参照国标测定植酸酶活性的方法,研究了钼黄法和钼蓝法的稳定性及植酸酶活性测定时反应体系中缓冲液、pH值以及Cu、Zn、Mn金属离子对酶活性的影响。
结果表明:钼黄法与改进后的钼蓝法稳定性没有明显差异,但钼蓝法更适合微量磷的测定;柠檬酸盐缓冲液作为植酸酶酶解反应的缓冲体系时显色的稳定性较差;反应温度、pH及Cu、Zn金属离子对酶活性影响较大,测定植酸酶活性时需要严格控制反应条件,屏蔽金属离子的干扰。
关键词:饲料;植酸酶;活性;测定目前,植酸酶制剂在畜禽饲料生产中已得到广泛应用,但饲料中植酸酶活性的测定方法还存在一些争议。
2002年,国家颁布了饲用植酸酶活性的测定方法标准(GB/T 18634)2002),该标准注明其适用于饲料添加剂用的植酸酶产品,也适用于添加有植酸酶的配合饲料、浓缩饲料和添加剂预混合饲料,但配合饲料、浓缩饲料和添加剂预混合饲料成分显然更为复杂,其适用性受到质疑[1]。
因此,关于饲料中植酸酶活性测定方法问题有待进一步研究。
1 试验材料与方法1.1 主要仪器与设备电热恒温水浴锅(室温-100e,控温精度?1e)、离心机(最高转速6 000 r/min)、721型分光光度计、分析天平、pH计、磁力搅拌器、0. 22Lm微孔滤膜。
1.2 试剂1.2.1 偏钒酸铵-钼酸铵-硝酸显色液方法见GB/T 18634)2002。
1.2.2 盐酸-乙酸钠缓冲液方法见GB/T 18634)2002乙酸缓冲液(I)的配制。
1.2.3 磷标准溶液将磷酸二氢钾于105e恒温箱中干燥2 h,在干燥器中保存;称取磷酸二氢钾0. 020 3 g,溶解于蒸馏水中定容至100 ml。
1.2.4 植酸酶溶液方法见GB/T 18634)2002。
1.2.5 植酸钠溶液方法见GB/T 18634)2002。
1.2.6 硫酸-钼酸铵溶液量取20 ml浓硫酸(98% )于100 ml蒸馏水中,称取1. 500 g钼酸铵微热溶解于50 ml蒸馏水中,按比例混合待用。
《2.1土壤酸性磷酸酶活性测定》
《2.1土壤酸性磷酸酶活性测定》土壤酸性磷酸酶活性测定土壤有机磷转化受多种因子制约，尤其是磷酸酶的参与，可加速有机磷的脱磷速度。
在ph4-9的土壤中均有磷酸酶。
积累的磷酸酶对土壤磷素的有效性具有重要作用。
研究证明，磷酸酶与土壤碳、氮含量呈正相关，与有效磷含量及ph也有关。
磷酸酶活性是评价土壤磷素生物转化方向的强度的指标。
磷酸苯二钠比色法1.试剂配制（1）0.5%磷酸苯二钠（用缓冲液配制）。
（2）ph5醋酸盐缓冲液。
a.醋酸盐缓冲液（ph=5.0）a：0.2mol/l醋酸溶液（11.5ml，稀释至1000ml）b：0.2mol/l醋酸钠溶液（16.4gc2h3o2na或27.2gc2h3o2na·3h2o 定容至1000ml）14.8mla+35.2mlb混合即得（3）氯代二溴对苯醌亚胺试剂。
取0.125g2，6-二溴苯醌氯酰亚胺，用10ml96%乙醇溶解，贮于棕色瓶中，存放在冰箱里。
保存的黄色溶液未变褐色之前均可使用。
（4）酚的标准溶液：酚原液——取1g重蒸酚溶于蒸馏水中，稀释至1l，贮于棕色瓶中。
酚工作液——取10ml酚原液稀释至1l（每毫升含0.01mg酚）。
（5）甲苯。
（6）0.3%硫酸铝溶液。
标准曲线绘制。
取1、3、5、7、9、11、13ml酚工作液，置于50ml容量瓶中，每瓶加入5ml缓冲液和4滴氯代二溴对苯醌亚胺试剂，显色后稀释至刻度，30min后比色测定。
以吸光度为横坐标，浓度为纵坐标（mg）绘成标准曲线。
2.操作步骤称5g风干土置于200ml三角瓶中，加2.5ml甲苯，轻摇15min 后，加入20ml0.5%磷酸苯二钠（用醋酸盐缓冲液配制），仔细摇匀后放入恒温箱，在37℃下培养24h后于培养液中加100ml0.3%硫酸铝溶液并过滤。
吸取3ml滤液于50ml容量瓶中，然后按绘制标准曲线所述方法显色。
用硼酸缓冲液时，呈现蓝色，在分光光度计上于660nm处比色。
3.结果计算磷酸酶活性，以24h后1g土壤中释出的酚的毫克数表示。
植酸酶活性的测定——钼蓝法(精)
植酸酶活性的测定——钼蓝法1 原理针对预混料复杂的物料体系，用不同的缓冲液对其进行抽提，最大限度的减少饲料中无机磷，微量元素，多维及其他成分对植酸酶测定的影响，用钼蓝法对抽提液中植酸酶活性进行定量。
植酸酶在一定温度和pH条件下，水解底物植酸钠生成正磷酸和肌醇衍生物，在酸性环境中与钼酸铵显色剂反应生成蓝色的（Mo2O3•MoO3）复合物，在波长700nm下比色测定。
酶活力单位定义：在37℃、pH5.0条件下，每分钟从5.0mM植酸钠溶液中释放出1微摩尔的无机磷定义为1个酶活力单位（U）2 试剂本规定中所用试剂，在没有注明其它要求时，均指分析纯试剂；所用溶剂和水无注明时，均指蒸馏水。
清洗实验用容器不要用含磷清洗剂。
2.1 乙酸缓冲液A（0.25mol/L）：称取14.355g无水乙酸钠，加入0.5gTriton X-100和0.5g牛血清白蛋白，900ml水溶解，冰乙酸调pH值至5.00±0.01，水定容至1000ml。
2.2乙酸缓冲液B（0.25mol/L）：称取14.355g无水乙酸钠，加入1.0g吐温-20和30gEDTA，900ml水溶解，冰乙酸调pH值至5.00±0.01，水定容至1000ml。
2.3 植酸钠溶液（6.25mmol/L）：称取577.4mg肌醇六磷酸钠，加入574.2mg无水乙酸钠，90ml水溶解，冰乙酸调pH值至5.00±0.01，水定容至100ml，现用现配（实际反应液中的最终浓度为5.0mmol/L）。
2.4 终止液：5%三氯乙酸（5%TCA）。
2.5 1.5％钼酸铵（试剂A）：7.5g钼酸铵溶于400ml水中，慢慢加入22ml浓硫酸，水定容到500ml，冰箱储存，有效期1个月。
2.6 2.7％硫酸亚铁（试剂B）：冰箱储存，有效期1个月。
2.7 显色剂：移取4份试剂A（2.5），1份试剂B（2.6）混合后使用，现用现配。
2.8 磷酸二氢钾：称量前于烘箱中烘至恒重，用乙酸缓冲液（2.2）配制50mmol/L标准液，再用50mmol/L 配制成4.0mmol/L磷酸二氢钾，溶剂为乙酸缓冲液（2.2），冰箱储存。
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植酸酶
1.分析意义
植酸酶参与土壤含磷化合物的主要部分——植素及其衍生物的脱磷酸化作用。
水解作用产物是植物的磷源。
2.测定原理
土壤植酸酶催化肌醇六磷酸化合物，水解成肌醇和六分子的磷酸。
测定植酸酶常以植酸钠为基质，以酶解所产生的无机磷量表示酶活性。
3.试剂配制
（1）植酸钠溶液：植酸钠由植素制备。
取50g纯植素，溶于2%盐酸中，加浓三氯化铁溶液至微黄色，使之以铁盐的形式沉淀，将析出的植酸铁白色沉淀移在大瓷漏斗上减压抽滤，并用2%盐酸（约4L）洗涤漏斗，以除去植素的衍生物。
将沉淀悬浮于水中并用氢氧化钠水解。
滤去析出的氢氧化铁沉淀。
滤液中参与的氢氧化钠用盐酸中和。
然后，用过量的（CH3COOH)2Cu溶液处理，使植酸盐以铜盐的形式沉淀出来。
滤出沉淀，仔细用热水洗涤，悬浮于水，并通入硫化氢（H2S）使之分解。
滤去析出的CuS，滤液中过量的H2S，通过加热蒸发除去（12h）。
所得的植酸溶液，用NaOH处理至pH8.0。
最后测定制剂中肌醇与磷酸的比值，以检查植酸钠的纯度，理论上的比值为0.968。
测出植酸钠溶液中磷含量后，用HCl滴定该溶液至pH 5.0，然后用水稀释至1ml含0.25mg P2O5。
（2）甲苯。
（3）钼酸铵溶液：25g钼酸铵加热溶于200ml蒸馏水中。
另取1L容量瓶加500ml水，再慢慢加入280ml浓H2SO4，再将钼酸铵溶液加入，随加随摇匀，定容至1L，贮于棕色瓶中。
（4）（NH4)2SO4-H2SO4溶液：取3g（NH4)2SO4加20ml 0.1N H2SO4，溶于1L蒸馏水中。
（5）氯化亚锡溶液：取2.5g SnCl2·2H2O溶于100ml 10%HCl中。
（6）磷的标准溶液：准确称取0.4392g KH2PO4，溶于1L水中即标准液。
再稀释10倍得1ml含0.01g磷的工作液。
标准曲线的绘制：分别取1、3、5、7、9、11ml磷工作液移于50ml容量瓶中，加30ml 蒸馏水和2ml钼酸铵液，摇匀加入3滴氯化亚锡液，显色后稀释至刻度，摇匀并在分光光度计上于650nm处比色测定。
以光密度为纵坐标，磷的浓度为横坐标，绘制标准曲线。
4.操作步骤
称5g土壤置于100ml三角瓶中，加1ml甲苯，15min后再加10ml植酸钠溶液，于37℃恒温箱中放置24h。
培养结束后，加50ml（NH4)2SO4-H2SO4溶液在振荡机上震荡提取50min。
过滤后吸取10ml滤液，置于50ml容量瓶中。
按绘制标准曲线的显色方法比色测定。
由标准曲线查出含量（P2O5 mg）表示植酸酶活性。