C. 测序结果的分析
测序结果分析及序列拼接
3、拼接序列
点击 Show result
序列拼接效果图
点击 Export
4、导出结果
点击“是”
数据的保存
数据的比对验证
/
数据的比对验证
数 据 的 比 对 验 证
数据的比对验证
考核操作题（二）
利用DNAman软件拼接“1.seq”、“2.seq”、“3.seq”
四、引物的评估
• Oligo 6
3.2 测序结果分析(p60)
测序图谱分析
理想的测序图谱峰形尖锐，峰间距均匀，信噪比高，各种颜
色的峰高度均匀，基线平直。
以ABI3730x进行测序，在反应良好时，30～800bp间的序列
为可信区。
1、测序反应个序列,要求如下（10分）。
新建一个word文档，报告三个序列拼接后cDNA总长 度及可能的基因名称 ，附上NCBI blast窗口图。
3、测序出现套峰的结果
3.3 序列拼接实例分析
一、序列拼接软件
DNAman
Vector NTI中的ContiExpress
Lasergene中的SeqMan
二、利用DNAman软件拼接序列
1、启动DNAman软件 2、导入序列
导入待拼接序列及参数设置
1.点击 Add file
2. 点击 Assemble
全基因组重测序数据分析详细说明
全基因组重测序数据分析详细说明全基因组重测序（whole genome sequencing, WGS）是一种高通量测序技术，用于获取个体的整个基因组信息。
全基因组重测序数据分析是指对这些数据进行处理、分析和解读，以获得有关个体的遗传变异、基因型、表达和功能等信息。
下面详细说明全基因组重测序数据分析的过程和方法。
首先，全基因组重测序数据的质量控制是必不可少的。
这一步骤包括对测序数据进行质量评估、剔除低质量序列，并进行去除接头序列和过滤序列等预处理操作，以确保后续分析的准确性和可靠性。
接下来，需要对全基因组重测序数据进行序列比对，将读取序列与参考基因组进行比对，以确定每个读取序列在参考基因组上的位置。
常用的比对工具包括Bowtie、BWA、BLAST等。
比对的结果将提供每个读取序列的基因组位置信息。
在序列比对完成后，就可以进行个体的变异检测。
变异检测的目的是识别个体的单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphisms, SNPs）、插入缺失变异（insertions/deletions, indels）和结构变异（structural variations, SVs）等基因组变异。
通常，变异检测分为两个步骤：变异发现和变异筛选。
变异发现即根据比对结果，通过一定的算法和统计学原理，找到潜在的变异位点。
然后，利用临床数据库、已知变异数据库和基因功能注释数据库等，进行变异筛选，剔除假阳性和无功能变异，筛选出最有可能的致病变异。
接着，对筛选出的变异位点进行基因型確定。
基因型的确定可以通过直接从比对结果中读取碱基信息，或者通过再次测序来获取高度精确的基因型，以获得更可靠的变异信息。
随后，对变异位点进行注释和功能预测。
注释是指对变异位点进行功能和可能影响的基因、基因组区域和调控元件等进行注释。
常用的注释工具包括ANNOVAR、SnpEff、VEP等。
功能预测则是根据变异位点的位置和可能影响的功能进行预测，如是否影响蛋白质功能、是否在编码序列、是否在启动子或增强子区域等。
基因测序仪器使用说明书
基因测序仪器使用说明书一、前言基因测序仪器是一种用于测定DNA或RNA序列的设备，它在生物科学研究、医学诊断等领域具有重要应用价值。
本使用说明书将详细介绍基因测序仪器的组成、使用方法以及注意事项，以帮助用户正确、安全地操作仪器，获得准确的测序结果。
二、仪器组成1. 主机：基因测序仪器的主要组成部分，包括光学系统、电子系统、激光系统等。
2. 数据分析软件：用于对测序结果进行分析和解读的计算机软件。
3. 数据存储设备：用于存储测序原始数据和分析结果的设备，如硬盘、U盘等。
三、操作步骤1. 准备工作a. 确保基因测序仪器处于水平放置的稳定表面上，有足够的工作空间和通风条件。
b. 检查仪器的供电情况，确保电源线连接牢固且通电正常。
c. 检查仪器内部的耗材和试剂，确保有足够的库存，并检查其有效期。
2. 样本处理a. 根据实验设计，准备待测样本。
b. 提取DNA或RNA，并进行纯化和浓缩处理。
c. 根据实验要求，进行必要的片段扩增、连接和修复。
3. 测序准备a. 根据测序类型选择合适的芯片或测序流程。
b. 准备所需的引物和试剂，并按照说明书中的要求进行稀释和配置。
c. 将样本与引物和试剂按照比例混合，并尽快投入仪器进行测序。
4. 仪器操作a. 打开仪器主机电源，待仪器启动完成后，进入操作界面。
b. 将样本混合液注入仪器芯片中，并按照仪器界面指引进行操作。
c. 在测序过程中，注意仪器显示的实时数据，并根据需要调整相关参数。
5. 数据分析与结果解读a. 测序完成后，将测序结果数据导出到计算机上。
b. 打开数据分析软件，导入测序结果数据。
c. 根据实验目的，选择相应的分析方法，对数据进行处理和解读。
d. 结果解读时，结合实验设计和相关文献，对数据进行合理的解释。
四、注意事项1. 安全操作：在操作过程中，务必佩戴手套和口罩，避免接触样本和试剂。
2. 仪器维护：定期检查仪器的光学系统和电子系统，保持清洁，并按照维护手册进行维护和保养。
生物信息学中的转录组测序数据分析流程解析
生物信息学中的转录组测序数据分析流程解析转录组测序是一种基于高通量测序技术的生物学研究方法，用于研究特定物种在特定生理或环境条件下所产生的所有转录本（mRNA）。
转录组测序数据分析是将原始的测序数据转化为有意义的生物学信息的过程。
本文将解析转录组测序数据分析的基本流程。
1. 数据质量控制（Quality Control，QC）数据质量控制是在转录组测序数据分析中非常重要的一步，它能够及早发现并剔除测序过程中产生的低质量测序数据，保证后续分析的准确性。
常用的QC工具包括FastQC和Trimmomatic。
FastQC用于检查测序数据的质量分布情况，发现可能存在的测序错误和污染问题。
Trimmomatic则用于去除低质量的测序片段和接头，提高数据的质量。
2. 数据比对数据比对是将测序数据与参考基因组进行比对的过程。
比对的目的是将测序片段精确地定位到基因组上，并获得每个基因组区域的覆盖度和深度等信息。
常用的比对工具包括Bowtie2和TopHat。
Bowtie2是一种基于Burrows-Wheeler Transform的短序列比对工具，适用于低错配率的比对。
TopHat则是一种用于对转录组数据进行比对和注释的工具，可以检测新基因和外显子剪接事件。
3. 定量分析定量分析是研究不同转录本在不同条件下的表达水平差异的过程。
常用的定量工具包括Cufflinks和HTSeq。
Cufflinks是一种用于估计转录本表达水平和发现新的转录本的工具。
它可以根据RNA-Seq数据拼接转录本，并计算不同基因或转录本的表达水平。
HTSeq则是一种用于计算不同基因的读数的工具，读数可以用来估计基因的表达水平。
4. 差异分析差异分析是研究在不同处理条件下，基因或转录本的表达水平是否存在显著差异的过程。
常用的差异分析工具包括DESeq2和edgeR。
DESeq2是一种基于负二项分布模型的差异表达分析工具，它可以对转录本进行差异分析，并计算基因的表达水平在不同条件下的折叠变化。
全基因组重测序数据分析
全基因组重测序数据分析全基因组重测序是一种高通量测序技术，可以获取一个个体的整个基因组的序列信息。
全基因组重测序数据分析是从这些序列数据中提取有用信息的过程，包括基因组装、变异检测和功能注释等。
本文将详细介绍全基因组重测序数据分析的步骤和一些常用的分析方法。
全基因组重测序数据分析的第一步是基因组装。
基因组装是指将测序得到的片段序列根据其重叠关系拼接成连续的序列。
目前有许多基因组装软件可供选择，如SOAPdenovo和SPAdes等。
这些软件会将测序片段根据其序列重叠情况进行集成，以获取最长的连续序列。
基因组装后，下一步是进行变异检测。
变异是指个体基因组与参考基因组之间的差异，可以分为单核苷酸变异（SNV）和结构变异（SV）两种类型。
SNV是指个体基因组中的单个碱基发生改变，包括单碱基插入、缺失和替换等。
SV则是指较大的基因组片段发生改变，包括插入、缺失、倒位和重组等。
变异检测的主要目标是通过比对个体的测序数据与参考基因组的序列，识别和注释这些变异。
为了提高变异检测的准确性，通常需要进行数据预处理和质量控制。
数据预处理包括去除接头序列、低质量序列和重复序列等，以提高后续分析的准确性和效率。
质量控制则是评估测序数据的质量，如测序深度、覆盖度和错误率等，以保证分析结果的可靠性。
除了变异检测，全基因组重测序数据还可以用于其他类型的分析，如基因表达分析和基因组结构分析。
基因表达分析可以通过比对测序数据和转录组数据库，识别并定量基因的表达水平。
基因组结构分析可以揭示染色体水平的变异和基因组结构的演化。
这些分析可以帮助研究人员研究基因组的功能和进化等问题。
总之，全基因组重测序数据分析是一个复杂的过程，涉及到多个步骤和分析方法。
通过对测序数据的组装、变异检测和功能注释等分析，可以获得有关个体基因组的详细信息，为基因功能研究和遗传疾病诊断提供重要参考。
随着测序技术的不断发展，全基因组重测序数据分析将会变得更加高效和准确。
crpa的mlst分型步骤流程
crpa的mlst分型步骤流程CRPA（C. jejuni and C. coli multi-locus sequence typing）是一种用于分析和比较耐药性菌株的方法。
以下是CRPA的MLST分型步骤流程。
1. 收集样品首先，需要从不同来源收集C. jejuni和C. coli的菌株样品。
这些样品可以来自于不同的动物、人类或环境中。
2. 提取DNA从收集到的菌株中提取DNA。
DNA提取是将菌株中的基因组DNA分离和纯化的过程。
可以使用商业化的DNA提取试剂盒或自制的DNA提取方法。
3. PCR扩增使用引物对感兴趣的基因进行PCR扩增。
在CRPA的MLST分型中，会选择7个内稳基因进行扩增，包括aspA、glyA、pgm、tkt、uncA、hipO和cjj81176。
4. 凝胶电泳将PCR扩增产物进行凝胶电泳分析，以确认扩增是否成功。
可以根据扩增片段的大小来判断PCR反应是否正确。
5. 测序对PCR扩增产物进行测序。
可以选择将测序样品送到商业实验室进行测序，或者在实验室内使用自动测序仪进行测序。
6. 序列分析对测序结果进行序列分析，包括序列编辑、比对和设计引物。
可以使用专业的序列分析软件进行分析，如BioEdit、MEGA等。
7. 序列比对对测序结果进行比对，将不同菌株的序列进行比较。
可以使用比对软件进行比对，如CLUSTAL W、BLAST等。
8. 分型根据不同基因的序列差异，对菌株进行分型。
可以使用分型数据库进行比对，如PubMLST，以确定菌株的类型。
9. 结果解读根据分型结果，可以对菌株进行进一步的分析和解读。
可以比较不同菌株的分型结果，分析它们的遗传关系和进化关系。
CRPA的MLST分型方法可以用于研究不同来源的C. jejuni和C. coli菌株的遗传多样性和传播途径。
通过分析不同基因的序列差异，可以揭示菌株的遗传特征和耐药性。
这种分型方法对于流行病学研究和疫苗研发具有重要意义，可以帮助我们更好地了解和控制这些病原菌的传播和感染。
3_引物设计及测序结果分析(2016教案)
28对引物
搜索结果
每对引物的信息
引物分值 100分为满分
双击选中一对引物
回到主窗口
引物信息
引物及产物信息
是否出现 hairpin,dimer,false priming and cross dimer
引物编辑
引物分析
• 首先检查引物二聚体尤其是3’端二聚体 形成的可能性。 • 二项检查是发夹结构（hairpin）；与 二聚体相同，发夹结构的能值越低越 好。 • 第三项检查为GC 含量，以45-55％为 宜。 • 第四False priming 检查
• 发夹结构（引物自身连续互补碱基不能大于3bp ） • 发夹结构：DNA通过自身回折使得互补的碱基对相遇，也
就是引物有部分可以自身配对
– 尤其是要避免引物3’端形成发夹结构，否则将严重影响 DNA聚合酶的延伸。 – 两引物之间不应该存在互补性，尤应避免3′端的互补重 叠以防引物二聚体的形成。一般情况下，一对引物间
8.自由能分布
• ΔG值(自由能)反映了引物与模板结合的强弱 程度。一般3’端ΔG值不要超过9（ΔG值为负 值，这里取绝对值），如此则有利于正确引发 反应而可防止错误引发。3′末端双链的ΔG是 0～－2 kcal/mol时，PCR产量几乎达到百分 之百，随着其绝对值的增加产量逐渐下降，在 －6时只有40%、到－8时少于20%、而－10 时接近于0。 • 引物的3’端的∆G 值过高，容易在错配位点形 成双链结构并引发DNA 聚合反应。
7.引物的内部稳定性
• 过去认为，引物3’端应牢牢结合在模板上才能有 效地进行延伸，故3’端最好为G或C。 • 现在的观点认为，引物的5’端应是相对稳定结构， 而3’端在碱基配对的情况下最好为低稳定性结构， 即3’端尽可能选用A或T（有说不适宜用A），少 用G或C。 • 若模板不很清楚，引物3’端最后一个碱基最好为 T，其次是G或C，而不选A，国外资料表明，当 末位为T时，即使在错配的情况下也能引发链的 合成，而末位为A时，错配时引发大大降低，G或 C居中，可见，模板很清楚时选A可以提高特异性
如何分析测序结果
4、Contig文件打开就是下图的overview形式，如果序列之间 能连通，说明目标序列完整测通了，如果有缺口则需要加测。
要把Contig文件拆散重组，则点击菜单栏的Contig→Dissolve Contig…即可
4、第一个按钮Assembly Parameters是调整比对的参 数，右图表示至少有85%相 似性和20bp的overlap才能比
软件和文件
用Sequencher软件Demo版看序列，Demo版不能保存序列，但其实绝大部分时候 并不需要保存，只要简单看一下测序结果是否正确即可，用这个软件是最方便的。
测序返回两种格式的文件，ABI和SEQ。ABI是原始文件，SEQ是根据ABI结果导出 的，未必完全正确，建议只看ABI，有需要再拿SEQ去修改、拼接。
以上两个点的出现是由于测序质量下降导致，因为四条序列，1和2号克隆各测 到两次，其中三条序列一样，说明两个克隆是相同的。
左图四个克隆中，第四个与另外三个不同， 说明第四个在PCR扩增中有碱基错配。
也有发生碱基缺失的、
碱基插入的。 以上出现差异的点都是位于浅蓝色的可信区段，通常不会有读峰错误的问题， 可以不用理会峰图。
对到一起，如果要比对引物 且引物少于20bp，则要调低 minimum overlap的值；如果
序列有某一段差异较大比对 不上，也可调低minimum match percentage的值，但调
得太低可能会比对到错误的 位置。
5、点击Bases按钮，可查看具体的序列信息
5、一个载会在底下出现一个点（按Ctrl+D可以快速定位到 有点的地方），这些点就是需要我们自己判断正误的地方。
这一条序列可信的长度只有880bp，而相应的SEQ 文件并没有删除前后不可信的序列，仍然给出了 1225bp的长度，因此不能用SEQ去判断测序结果。 同时，在可信的序列中仍然存在个别深蓝色的碱 基，这些碱基是否可信，也要根据峰图自行判断。