腺病毒载体的构建-体外连接法快速高效构建表达
大鼠骨桥蛋白重组腺病毒的构建及体外表达
口腔颌 面 外科 杂 志 ２ １ ０２年 ８月 第 ２ ２卷 第 ４期 Ｊｕｎｌ ｆ ａａ ｄＭ ａｉｏａｉ ｕｇ ｒ １ ２Ｎｏ４Ａｕ ｕｔ ０ ２ ｏ ｒａ ｏ ｌ ｎ ｘｌ ｆｃ ｌ ｒｅｙＶｏ． ． ｇ ｓ２ １ Ｏｒ ｌ ａＳ ２ ，
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腺病毒与基因传递载体的构建与应用
腺病毒与基因传递载体的构建与应用腺病毒（Adenovirus）是一种以双链DNA为基础的病毒，主要感染哺乳动物，包括人类。
由于具有较高的感染率和传播速度，在临床治疗和基因治疗等领域，被用作基因载体。
这篇文章将会介绍腺病毒作为基因传递载体的构建和应用。
一、腺病毒作为基因传递载体的构建腺病毒是一个十分复杂的病毒，其基因组由约36 kb的双链DNA组成。
它的基因组被分为两个方向，一个方向编码早期基因（E1A、E1B、E2、E3和E4），另一个方向编码晚期基因（L1-L5）。
早期基因编码的转录产物参与了病毒DNA的复制和转录，晚期基因主要编码病毒颗粒结构和组装所需的蛋白质。
基于这个理论框架，可以利用腺病毒基因组进行基因传递。
首先，必须构建一个适当的腺病毒载体（Adenoviral vector），其基本构造是一个缺少大部分基因组的腺病毒。
在此基础上，将感兴趣的DNA片段插入到腺病毒基因组里。
这需要掌握两种方法：重组技术和确认策略。
以重组技术为例，首先要得到一个带有感兴趣DNA片段的载体核酸。
这个DNA完整地包含了带有专门的重组序列的保护酶切位点，使其能够在目标腺病毒基因组上的互补位点诱导重组。
在这个操作后，形成了一个新的腺病毒基因组，其中包括感兴趣的DNA片段。
然后，改造后的基因组可以转染到腺病毒感染容器中，进行繁殖和扩增。
这一步骤可以提高已经构建的腺病毒载体的数量。
其次，需要构建一种辅助病毒（Adenoviral helper）来帮助前述的重组病毒形成成熟的病毒颗粒。
在这个方法中，辅助病毒中没有任何有价值的基因，因此它不能复制自己。
相反，它确保引入的重组病毒可以在感染容器中成功地产生新的病毒颗粒。
通过这样的步骤，可以构建出一种有效的载体，并用于下一步的实验设计。
二、腺病毒作为基因传递载体的应用腺病毒作为基因传递载体可以应用于基因治疗、疫苗研究、基因注入和细胞治疗等领域。
下面分别介绍一下相关应用的基本技术。
腺病毒载体的构建和应用
腺病毒载体的构建和应用随着生物工程技术的不断发展，越来越多的生物医学研究领域开始趋向于基因治疗和基因编辑等方向。
这些技术的实现需要一种特殊的工具——腺病毒载体。
腺病毒（Adenovirus）是一种不包含RNA病毒的DNA病毒，其表面包裹着许多蛋白质，使其具有较好的基因导入能力。
这使得腺病毒成为一种常用的基因载体，被广泛应用于细胞遗传学、基因治疗等领域。
腺病毒的构成腺病毒包含一个大小为36 kb的线性双链DNA，这条DNA上编码了丰富的基因信息，其中大约包含40个基因左右。
腺病毒分为革兰氏正染色体和非冠状病毒两种类型，目前在研究中应用最多的是非冠状病毒型腺病毒。
腺病毒载体构建的两种方法目前有两种主要的构建腺病毒载体的方法，分别是端到端的法和质粒基因重组的法。
端到端的法端到端的法在构建腺病毒载体时需要把目标基因全长克隆进腺病毒的基因组中。
这种方法在基因克隆、重组和转染等方面比较复杂，对实验人员的操作技能要求较高。
同时，这种方法的构建产物相对来说比较容易受到细胞内DNA修饰和限制性酶的影响。
质粒基因重组的法对比之下，质粒基因重组的法相对来说较为容易，需要构建的重组质粒包括表示目标基因的转录单元以及与腺病毒DNA重组所需的旁路序列等。
通过将质粒DNA转染至腺病毒蛋白质、酶和基因表达产物等组分共同构成的细胞核中，将质粒DNA与腺病毒DNA进行重组，从而构建出目标腺病毒载体。
质粒基因重组法不仅可以有效克服端到端法受到限制性酶和DNA修饰的影响，而且富于设计灵活度，从而满足更多的实验需求。
腺病毒载体的应用腺病毒载体广泛应用于人类和动物细胞体内的基因传递、基因治疗和基因工程方面。
通过腺病毒载体可进行基因敲除、基因转录和基因转译等一系列基因编辑操作。
基因敲除基因敲除是研究腺病毒载体理解生命过程和信号转导途径的重要手段之一。
通过基因敲除的方法可以对特定基因进行敲除，从而寻找与该基因相关联的复杂的生物学催化剂。
目前腺病毒载体敲除方法尤其得到广泛应用，对于生命科学研究者来说具有重要的意义。
CRT_MAGE_A3重组腺病毒载体的构建及体外表达的研究
CRT/MAGE -A3重组腺病毒载体的构建及体外表达的研究刘新莉，陈洋，马萍（中国医科大学附属第一医院肿瘤研究所，沈阳110001）摘要：目的构建钙网织蛋白/黑素瘤抗原基因-A3（CRT/MAGE -A3）双基因重组腺病毒载体，并进行体外表达研究。
方法从表达质粒pcDNA3/CRT 中切取目的片段CRT ，定向克隆至穿梭载体pShuttle -GFP -CMV 。
根据Genbank 中提供的黑素瘤基因序列，设计并合成引物，以人肺癌组织cDNA 文库为模板采用RT -PCR 技术扩增人黑素瘤抗原基因-A3基因片段，测序后将黑素瘤抗原基因-A3基因片段定向克隆至穿梭载体，进而将穿梭载体克隆至Pac Ⅰ限制性内切酶线性化的腺病毒载体pAdxsi 。
结果目的片段CRT 转入穿梭载体后，酶切鉴定pShuttle -（ΔGFP ）-CRT 正确。
人肺癌组织经RT -PCR 扩增出大小约950bp 的基因片段，测序证实为MAGE -A3DNA 后，克隆至穿梭载体pShuttle -（ΔGFP ）-CRT 构建穿梭载体pShuttle -CRT -MAGE -A3，酶切鉴定证实构建正确。
酶切穿梭载体将双基因片段克隆至腺病毒载体pAdxsi 得到Ad -CRT/MAGE -A3病毒载体，酶切鉴定证实构建成功。
转染293LP 细胞并用Western blot 检测到其体外表达。
结论成功构建CRT/MAGE -A3重组腺病毒载体并证实其能在体外有效表达CRT 蛋白及MAGE -A3蛋白。
关键词：钙网织蛋白；黑素瘤抗原基因-Ａ３；腺病毒；基因治疗中图分类号：R73文献标志码：A文章编号：0258-4646（2009）07-0493-04Construction and Expression of Recombinant Adenovirus for CRT/MAGE -A3抗原特异性肿瘤免疫治疗结合抑制肿瘤血管生成治疗的方法能够区分肿瘤与非肿瘤细胞，进而达到系统性治疗肿瘤的目的［1，2］。
4-1BBL重组腺病毒载体的构建及表达
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１Ｂ Ｂ Ｌ表达。结论 成 功构建 了含 ４ １ Ｂ —Ｂ Ｌ基 因的腺病毒载体 ， 该载体可用于前列腺癌的免疫治疗 。
钙网织蛋白重组腺病毒载体构建及体外表达
钙网织蛋白重组腺病毒载体构建及体外表达赵丹刘新莉马萍（中国医科大学附属第一医院肿瘤研究所，辽宁沈阳110001）〔摘要〕目的构建钙网织蛋白（CRT ）基因重组腺病毒载体，并检测其在293LP 细胞中的表达。
方法根据Genbank 中提供的CRT 基因序列，设计并合成引物，以人乳腺癌组织cDNA 文库为模板采用RT-PCR 技术扩增人CRT 基因片段，测序后将CRT 基因片段定向克隆至pShuttle-CMV 重组穿梭载体，进而将穿梭载体克隆至Pac Ⅰ限制性内切酶线性化的腺病毒载体pAdxsi 。
结果重组穿梭载体pShuttle-CRT 经EcoRI /Kpn Ⅰ酶切鉴定连接成功。
酶切穿梭载体将CRT 片段克隆至腺病毒载体pAdxsi 得到Ad-CRT ，鉴定证实Ad-CRT 载体构建成功。
Ad-CRT 转染293LP 细胞并通过Western 印迹法和Real-time PCR 法证实其体外表达。
结论成功构建CRT 重组腺病毒载体Ad-CRT 并证实其在293LP 细胞中表达。
〔关键词〕钙网织蛋白（CRT ）；腺病毒载体；基因治疗〔中图分类号〕R73〔文献标识码〕A〔文章编号〕1005-9202（2012）12-2561-03；doi ：10.3969/j.issn.1005-9202.2012.12.053通讯作者：马萍（1960-），女，教授，博士生导师，主要从事分子肿瘤学研究。
第一作者：赵丹（1986-），女，硕士，主要从事分子肿瘤学研究。
抗原特异性肿瘤免疫治疗和抑制肿瘤血管生成治疗的方法能够区分肿瘤与非肿瘤细胞，进而达到全身系统性治疗肿瘤的目的〔1，2〕。
钙网蛋白（CRT ）是热休克蛋白家族成员，为哺乳动物体内高度保守的Ca 2+结合蛋白。
近期研究表明，由抗原转运蛋白（TAP ）转运到内质腔内的肽段与CRT 相连，成为抗原处理及递呈过程中热休克蛋白（HSP ）的交接分子，参与诱导MHC-Ⅰ类分子限制的抗原特异性的CTL ，产生细胞免疫。
体外连接法快速高效构建表达β-半乳糖苷酶的重组腺病毒载体(一)
体外连接法快速高效构建表达β-半乳糖苷酶的重组腺病毒载体(一) 作者：王家宁,王传成郭凌郧,黄永章摘要]目的:采用体外连接法构建和制备重组腺病毒Adeno-X-LacZ，为构建具有治疗价值的重组腺病毒载体奠定基础。
方法:PI-SceⅠ/I-CeuⅠ酶切pShuttle2-LacZ穿梭质粒，回收4.6kb的LacZ基因表达盒，与经过相同酶切的Adeno-X病毒DNA连接，连接产物用SwaⅠ酶切，最终产物转化DH5α。
重组质粒用PCR法和PI-SceⅠ/I-CeuⅠ酶切鉴定。
pAdeno-X-LacZ用PacⅠ线性化后，用脂质体介导其转染至AD293细胞内包装扩增出重组腺病毒颗粒，采用CsCl密度梯度离心法纯化重组腺病毒Adeno-X-LacZ。
采用X-gal染色观察Adeno-X-LacZ在AD293细胞内包装和HVSMC表达情况。
结果:PCR扩增可见312bp特异性条带，PI-SceⅠ/I-CeuⅠ酶切重组质粒后释放出4.6kbLacZ基因表达盒。
X-gal 染色证实了在AD293细胞内成功扩增包装出重组腺病毒Adeno-X-LacZ 和LacZ基因在HVSMC中得到有效表达。
结论:体外连接法是一种快速、简便、高效的构建重组腺病毒质粒的方法，本研究为构建具有治疗价值的重组腺病毒奠定了基础，Adeno-X-LacZ为研究腺病毒介导的基因转移提供了一良好的对照载体。
关键词]体外连接;腺病毒;β－半乳糖苷酶;PI-SceⅠ;I-CeuⅠAbstract:ObjectiveToconstructrecombinantadenoviralvectorexpressingβ-ga lactosidasebyinvitroligationandprovideabasisforconstructionofrecombinan tadenovirusvectorexpressingtherapeuticgeneofinterest.MethodspShuttle2-LacZwasdigestedwithPI-SceⅠ/I-CeuⅠand4.6KbfragmentofLacZgeneexpre ssioncassettewasrecovered.ThisfragmentwasligatedtopredigestedAdeno-X viralDNAwithPI-SceⅠ/I-CeuⅠ.TheligatedproductwasdigestedwithSwaⅠ.T heresultantDNAwastransformedintoE.Coli.DH5α.Thecorrectrecombinantpl asmid,pAdeno-X-LacZ,wasidentifiedbyPCRandPI-SceⅠ/I-CeuⅠdigestion.T hePacI-digested,linearizedpAdeno-X-LacZwastransfectedintoAD293cellsbyL ipofectamine.Recombinantadenovirus,Adeno-X-LacZ,waspurifiedwithCsCld ensitygradientultracentrifugation.HVSMCwasinfectedwithAdeno-X-LacZ.X-galstainingwasperformedtomonitortheexpressionofβ-galactosidasegene.R esultsTherewasaspecificbandof312bpwhenpAdeno-X-LacZwasamplifiedby PCR.PI-SceⅠ/I-CeuⅠdigestionofpAdeno-X-LacZreleased4.6KbofLacZgenef ragment.X-galstainingconfirmedAdeno-X-LacZwaspackagedsuccessfullywit hinAD293cellsandtheexpressionofβ-galactosidasegeneinHVSMC.Conclusio nInvitroligationisasimple,rapidandefficientmethodforconstructingrecombin antadenoviralvector.Thisstudyprovidesabasisforconstructionofrecombinant adenoviralvectorcarryingtherapeuticgeneofinterest,Adeno-X-LacZisalsoaus efulcontrolvectorfortheresearchofgenetransfermediatedbyrecombinantad enovirus.Keywords:Invitroligation;Adenovirus;β-galactosidase;PI-SceⅠ;I-CeuⅠ重组腺病毒载体具有转染效率高，感染细胞范围广，病毒滴度高，可感染细胞周期中静止期和分裂期细胞，同时可高效介导基因的体内外转移。
腺病毒载体构建的基本原理与应用
腺病毒载体构建的基本原理与应用1. 简介腺病毒（Adenovirus）是一类非常常见的病毒，它可引起呼吸道、眼部和肠道感染等问题。
在基因工程领域，腺病毒被广泛应用作为基因传递载体。
通过对腺病毒进行适当的改造，可以将外源基因有效地传递到目标细胞中，并实现基因的高表达。
本文将介绍腺病毒载体构建的基本原理以及其在实际应用中的主要用途。
2. 腺病毒载体构建的基本原理腺病毒载体构建的基本原理主要包括以下几个步骤：2.1 选择适当的腺病毒亚型腺病毒有多个亚型，其中最常用的是腺病毒2（Ad2）和腺病毒5（Ad5）。
选择适当的腺病毒亚型取决于目标细胞的特点以及需要传递的基因。
2.2 构建质粒载体构建质粒载体是腺病毒载体构建的第一步。
质粒载体通常由多个部分组成，包括腺病毒的核心序列、外源基因表达的启动子和终止子等。
通过合成或PCR扩增等方法，可以将这些部分组装到一起构建质粒载体。
2.3 建立包装细胞系在构建过程中，需要建立一个能够产生包装腺病毒的细胞系。
这些细胞系通常包括两种类型的细胞：一种是质粒携带者，将质粒转染进细胞内；另一种是包装细胞，它们能够提供所需的腺病毒包装蛋白和其他辅助蛋白。
2.4 转染质粒载体将质粒载体转染到包装细胞系中，使其进入细胞内。
转染的方法可以采用常规的化学方法，如钙磷共沉淀法或使用商业化学试剂。
2.5 腺病毒产生与包装质粒载体进入到包装细胞中后，通过转染和转座等过程，腺病毒基因组会产生复制和转录。
最终，腺病毒包装蛋白和基因组会组装成腺病毒颗粒，从而完成腺病毒载体的构建。
3. 腺病毒载体的应用腺病毒载体在基因治疗、疫苗开发、基因功能研究等方面具有广泛的应用。
以下是腺病毒载体的主要应用领域的列点介绍：•基因治疗：腺病毒载体可以用于治疗多种遗传性疾病，如囊性纤维化、遗传性视网膜疾病等。
通过将治疗基因成功地传递到患者细胞中，可以恢复或增强正常基因的功能，从而治疗相关疾病。
•疫苗开发：腺病毒载体在疫苗开发中具有重要的作用。
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体外连接法快速高效构建表达β-半乳糖苷酶的重组腺病毒载体作者：王家宁, 王传成郭凌郧, 黄永章[摘要] 目的: 采用体外连接法构建和制备重组腺病毒Adeno-X-LacZ，为构建具有治疗价值的重组腺病毒载体奠定基础。
方法: PI-Sce Ⅰ/I-Ceu Ⅰ酶切pShuttle2-LacZ穿梭质粒，回收4.6 kb 的LacZ基因表达盒，与经过相同酶切的Adeno-X病毒DNA连接，连接产物用SwaⅠ酶切，最终产物转化DH5α。
重组质粒用PCR法和PI-Sce Ⅰ/I-Ceu Ⅰ酶切鉴定。
pAdeno-X-LacZ用PacⅠ线性化后，用脂质体介导其转染至AD293细胞内包装扩增出重组腺病毒颗粒，采用CsCl 密度梯度离心法纯化重组腺病毒Adeno-X-LacZ。
采用X-gal染色观察Adeno-X-LacZ在AD293细胞内包装和HVSMC表达情况。
结果: PCR扩增可见312 bp特异性条带，PI-Sce Ⅰ/I-Ceu Ⅰ酶切重组质粒后释放出4.6 kb LacZ基因表达盒。
X-gal染色证实了在AD293细胞内成功扩增包装出重组腺病毒Adeno-X-LacZ和LacZ基因在HVSMC中得到有效表达。
结论: 体外连接法是一种快速、简便、高效的构建重组腺病毒质粒的方法，本研究为构建具有治疗价值的重组腺病毒奠定了基础，Adeno-X-LacZ为研究腺病毒介导的基因转移提供了一良好的对照载体。
[关键词] 体外连接;腺病毒;β－半乳糖苷酶;PI-SceⅠ;I-CeuⅠAbstract: Objective To construct recombinant adenoviral v ector expressing β-galactosidase by in vitro ligation and provide a basis for construction of recombinant adenovirus vector expressing therapeutic gene of interest.Methods pShuttle2-LacZ was digested with PI-Sce Ⅰ/I-Ceu Ⅰand 4.6 Kb fragment of LacZ gene expression cassette was recovered .This fragment was ligated to predigested Adeno-X viral DNA with PI-Sce Ⅰ/I-Ceu Ⅰ. The ligated product was digested with Swa Ⅰ.The resultant DNA was transformed into E. Coli. DH5α.The correct recombinant plasmid, pAdeno-X-LacZ ,was identified by PCR and PI-Sce Ⅰ/I-Ceu Ⅰdigestion. The Pac I-digested, linearized pAdeno-X-LacZ was transfected into AD293 cells by Lipofectamine. Recombinant adenovirus , Adeno-X-LacZ, was purified with CsCl density gradient ultracentrifugation. HVSMC was infected with Adeno-X-LacZ. X-gal staining was performed to monitor the expression of β-galactosidase gene. Results There was a specific band of 312bp when pAdeno-X-LacZ was amplified by PCR. PI-SceⅠ/I-CeuⅠdigestion of pAdeno-X-LacZ released 4.6Kb of LacZ gene fragment. X-gal staining confirmed Adeno-X-LacZ was packaged successfully within AD293 cells and the expression of β-galactosidase gene in HVSMC. Conclusion In vitro ligation is a simple, rapid and efficient method for constructing recombinant adenoviral vector. This study provides a basis for construction of recombinant adenoviral vector carrying therapeutic gene of interest, Adeno-X-LacZ is also a useful control vector for the research of gene transfer mediated by recombinant adenovirus.K ey words: In vitro ligation; Adenovirus; β-galactosidase; PI-Sce Ⅰ; I-Ceu Ⅰ重组腺病毒载体具有转染效率高，感染细胞范围广，病毒滴度高，可感染细胞周期中静止期和分裂期细胞，同时可高效介导基因的体内外转移。
因而腺病毒载体是目前后基因组时代基因功能研究和基因治疗研究普遍运用的载体[1-6]。
但腺病毒载体的构建是一项费时费力具有挑战性的工作。
过去细胞内同源重组方法构建和制备携带目的基因的重组腺病毒，由于同源重组率低和需要对重组体进行多轮费时费力的筛选鉴定，限制了重组腺病毒载体在研究中的应用[7-8]。
细菌内同源重组法构建和制备重组腺病毒，由于操作相对复杂以及需要两种特殊的大肠杆菌（BJ5183, XL10-gold），使得构建重组腺病毒的效率相对低下[9-13]。
本研究介绍体外连接方法构建和制备表达β－半乳糖苷酶的重组腺病毒载体，为构建重组腺病毒载体建立一新的技术平台，为构建携带目的基因的重组腺病毒载体奠定基础。
1 材料和方法1.1 主要材料BD Adeno-X Expression system（购自BD Biosciences Clontech公司）包括Adeno-X Viral DNA(PI-Sce Ⅰ/I-Ceu Ⅰ已消化)，pShuttle2穿梭质粒（含有多克隆位点及PI-Sce Ⅰ/I-Ceu Ⅰ酶切位点），pShuttle2-LacZ,PI-Sce Ⅰ和I-Ceu Ⅰ内切酶，Adeno-X扩增引物(Forward primer:5’-TAGTGTGGCGGAAGTGTGATGTTGC-3’; Reverse primer: 5’-TCGACCATAGGGGATCGGGAGATC-3’)。
X-gal（Sigma公司产品），Lipofectamine 2000（Invitrogen公司产品），λDNA/HindⅢ marker(华美生物工程公司产品)，DH5α为本研究所保存，SwaⅠ（New England Biolabs公司产品）。
LigaFast Rapid DNA ligation sysrem（Promega 公司产品）。
AD293细胞（Stratagene公司）。
1.2 主要仪器高速冷冻离心机（Hettich,Universal 32R，德国），超速冷冻离心机（Hitach，CP80MX，日本），紫外/可见光分光光度计（Cecil，CE2041，英国），倒置相差显微镜（Nikon，TE2000-U，日本），二氧化碳培养箱（Binder，德国），超净工作台（苏净集团安泰公司），超低温冰箱（-80 ℃，Sanyo，日本），凝胶图像分析系统（Touching 995 gel document system，天呈科技公司）。
1.3 构建策略见图1。
1.4 携带LacZ基因的重组腺病毒质粒pAdeno-X-LacZ的构建pShuttle2-LacZ用PI-Sce Ⅰ/I-Ceu Ⅰ酶切后进行低熔点琼脂糖凝胶电泳，回收4.6 kb含LacZ基因的表达盒。
将回收片段与预先用PI-Sce Ⅰ/I-Ceu酶切的Adeno-X Viral DNA采用快速连接体系连接。
将连接产物用Swa Ⅰ酶切，以去除腺病毒骨架质粒自身环化和酶切不完全所引起不携带LacZ基因片段的质粒。
将Swa Ⅰ酶切后的产物用酚/氯仿抽提，纯化连接产物。
将纯化后的连接产物转化感受态DH5α，将其铺于含氨苄青霉素（100 μg/ml）的LB平板上37 ℃倒置培养24 h。
挑选菌落扩增，采用碱裂解法小量抽提质粒，用PCR方法和PI-Sce Ⅰ/I-Ceu Ⅰ酶切鉴定重组质粒是否携带有LacZ基因表达盒。
若携带有LacZ基因表达盒的重组腺病毒质粒采用PCR扩增后则出现一特异性312 bp片段，采用PI-Sce Ⅰ/I-Ceu Ⅰ双酶切后会出现一4.6 kb的片段。
1.5 Lipofectamine 2000介导pAdeno-X-LacZ转染AD293细胞取20 μg pAdeno-X-LacZ用Pac 酶切37 ℃过夜，采用酚/氯仿抽提酶切片段，乙醇沉淀，高压三蒸水溶解，加50 μl Lipofectamine 2000脂质体，室温30 min，置4 ℃保存备用。
AD293细胞培养于25 cm2塑料培养瓶，待60％融合时，进行转染。
弃培养液，用PBS洗1次，加4 ml 10％FCS.DMEM培养液，加入预先准备好的DNA/脂质体复合物至培养瓶中，每3 d换培养液1次，观察细胞病变情况，至AD293细胞80％出现病变时收集细胞，37 ℃/-80 ℃反复冻融3次，12 000 g离心10 min，收集上清。
1.6 重组腺病毒的扩增、纯化及滴度测定[14]取原代重组腺病毒上清，反复感染AD293细胞，37 ℃ 5％ CO2培养箱中培养，镜下观察到出现95％~100％病变时，收集细胞，以5 000 g 离心，弃上清，沉淀重悬于适量PBS中，在37 ℃/-80 ℃反复冻融3次，以12 000 g离心收集上清，按照文献方法对重组腺病毒上清进行CsCl密度梯度离心纯化[14]，并将纯化后的腺病毒在透析液中（10 mmol/L Tris・HCl，1 mmol/L MgCl2，10%甘油）4 ℃透析2次，每次24 h。