谷氨酰胺合成酶
谷氨酰胺合成酶（GS）
1、培养条件：将菌株转接到斜面培养基上，在30℃下培养3 d，再从种子培养基接种到产酶培养基上，摇床培养条件为28℃下培养36 h，液体培养摇床的转速为160 r/min。
2、无细胞抽提液的制备
（1）菌体收集。菌株在摇床培养36 h，在转速8 000 r/min 下离心20 min，以质量分数为1%的KCl溶液洗涤2次，得到湿菌体，放入-20℃冰箱中保存，备用。
（2）超声波破碎。融化冻存的菌体，加入3倍体积的浓度为0.05 mol/L 咪唑-HC1缓冲液(pH 值7.0，含浓度2 mmol/L的DTT，用于保护酶蛋白的二硫键，免受超声波的破坏；含浓度2 mmol/L 的Mg 2+，用于稳定酶活力），制成菌悬液，用超声波破碎器于冰浴中在功率400 W，工作1 s，间歇3 s 条件下处理20 min。然后在温度4℃，转速8 000 r/min 下离心30 min，上清部分即为无细胞抽提液。
3、酶活测定[1]：反应总体积为3 mL，1.6 mL的反应混合液（pH 值7.0）
0.1 mol/L的Tris- HCl 80mmol/L的Mg 2+
20 mmol/L的谷氨酸钠盐20 mmol/L的半胱氨酸
2 mmol/L的EDTA 80 mmol/L的盐酸羟胺
再加入0.7 mL的浓度40 mmol/L的ATP溶液，最后加入0.7 mL的粗酶液，混匀。于37℃下保温0.5 h。
加入显色液（含浓度0.2 mol/L的TCA，0.37 mol/L 的FeCl 3和0.6
mol/L的HCl混合液）1 mL，终止反应并显色。空白对照采用上述反应液体系，不加酶液蒸馏水补足反应体积。
在波长540 nm 处比色测定形成的γ-谷氨酰羟肟酸。在上述条件下，1 min催化形成1μmolγ-谷氨酰羟肟酸所需要的酶量定义为1个酶活力单位，比活力为U/mg 蛋白。
A
计算公式为：GS 酶活力=t?
?V
P
式中：A———540 nm 处的吸光度；
P———粗酶液中可溶性蛋白含量，mg/mL；
V———反应体系中加入的粗酶液体积，mL；
t ———反应时间，h。
4、粗酶液中蛋白含量测定：
采用考马斯亮蓝法，以牛血清蛋白为标准蛋白。
试剂：
100mg考马斯亮蓝G-250溶于50mL 95% 乙醇中，然后加入100mL 85%（w/v）磷酸，最后定容到1升。
测定：
将10μL待测样品用90μL蒸馏水稀释到0.1mL，加到试管中，然后加入5mL 测定试剂，摇匀2min后在595nm下测光吸收值。
参照蛋白标准曲线，计算蛋白浓度，即0.050 A 595相当于1mg/mL 的蛋白浓度。
参考文献：
1.刘川顺，李平等.谷氨酰胺合成酶产酶菌株的筛选及酶学性质[J].农
产品加工·学刊.2010(7):4~7
2.肖钢等.一株谷氨酰胺合成酶高产菌株的酶学分析及其基因的克隆分析[J].湖北大学学报( 自然科学版).2010.9:326-329
3.Nakanishi T.Enzymes concerned in the conversion of L-glutamic acid fermentation to L-glutamine and N-acetyl-L-glutamine fermentation by Corynebacterium glutamicum [J] . Ferment Tech,1975,56(6) : 573-585
4.Shapiro B M,Stadtman E R.Glutamine sythetase
（Escherichiacoli)[J].Methods Enzymol，1970，17 (4）:910-922．
谷氨酰胺合成酶(Glutamine synthetase,GS)试剂盒说明书
货号: QS1807 规格：50管/24样谷胺酰胺合成酶（Glutamine synthetase，GS）试剂盒说明书 可见分光光度法 正式测定前务必取2-3个预期差异较大的样本做预测定 测定意义： GS（EC6.3.1.2）主要存在于植物中，是生物体内氨同化的关键酶之一，催化铵离子和谷氨酸合成谷氨酰胺，不仅可以防止过多的铵离子对生物有毒性，而且谷氨酰胺也是氨的主要储存和运输形式。 测定原理： GS在ATP和Mg2+存在下，催化铵离子和谷氨酸合成谷氨酰胺；谷氨酰胺进一步转化为γ─谷氨酰基异羟肟酸，在酸性条件下与铁形成红色的络合物；该络合物在540nm处有最大吸收峰，可用分光光度计测定。 自备实验用品及仪器： 可见分光光度计、水浴锅、台式离心机、可调式移液器、1 mL玻璃比色皿、研钵、冰和蒸馏水。 试剂的组成和配制： 提取液：30mL×1瓶，4℃保存。 试剂一：10mL×1瓶，-20℃保存。 试剂二：10mL×1瓶，-20℃保存。 试剂三：粉剂×2瓶，-20℃保存。用时每瓶加入5mL蒸馏水充分溶解备用，用不完的试剂仍-20℃保存。 试剂四：10mL×1瓶，4℃避光保存。 样本测定的准备： 1、细菌、细胞或组织样品的制备： 细菌或培养细胞：先收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清；按照细菌或细胞数量（104个）：提取液体积（mL）为500~1000：1的比例（建议500万细菌或细胞加入1mL提取液），超声波破碎细菌或细胞（冰浴，功率20％或200W，超声3s，间隔10s，重复30次）；8000g 4℃离心10min，取上清，置冰上待测。 组织：按照组织质量（g）：提取液体积(mL)为1：5~10的比例（建议称取约0.1g组织，加入1mL提取液），进行冰浴匀浆。8000g 4℃离心10min，取上清，置冰上待测。 2、血清（浆）样品：直接检测。 测定步骤： 1、分光光度计预热30min以上，调节波长至540nm，蒸馏水调零。 第1页，共2页
实验三预习报告硝酸还原酶和谷氨酰胺合成酶活性的测定
实验三预习报告硝酸还原酶和谷氨酰胺合成酶活性的测定实验三、硝酸还原酶和谷氨酰胺合成酶活性的测定一、硝酸还原酶的测定[原理]: 硝酸还原酶(NR)是植物氮素同化的关键酶，它催化植物体内的硝酸盐还原为亚硝酸盐，产生的亚硝酸盐与对-氨基苯磺酸(或对-氨基苯磺酰胺)及α-萘胺(或萘基乙烯胺)在酸性条件下定量生成红色偶氮化合物。 生成的红色偶氮化合物在540nm有最大吸收峰，可用分光光度法测定。硝酸还原酶活性可由产生的亚硝态氮的量表示。一般以每克鲜重含氮量表示，即以-1-1ug.g.h为单位。NR的测定可分为活体法和离体法。活体法步骤简单，适合快速、多组测定。离体法复杂，但重复性较好。 [试剂] 1(亚硝酸钠标准溶液:准确称取分析纯NaNO0.9857g溶于去离子水后定容至1 2-1000ml，然后再吸取5ml定容至1000ml，即为含亚硝态氮1ug.ml的标准液; 2(0.1molpH7.5的磷酸缓冲液:NaHPO.12HO30.0905g与NaHPO.2HO 242242 2.4965g加去离子水溶解后定容至1 000ml; -13(1%(W/V)溶液:1.0g 对氨基苯磺酸溶于100ml 3 mol.LHCL中(25ml浓-1盐酸加水定容至100ml 即为 3 mol.LHCL); (0.02%(W/V)萘基乙烯胺溶液:0.020g萘基乙烯胺溶于100ml 去离子水中，4 贮于棕色瓶中; -1-15(0.1mol.LKNO溶液:2.5275g KNO溶于250Ml 0.1mol.LPh7.5的磷酸缓冲33 液中; -16(0.025mol.LPh 8.7 的磷酸缓冲液:8.864 0g NaHPO12HO，0.0570g 24.2
植物体内谷氨酰胺合成酶活力的测定
实验27 植物体内GS 谷氨酰胺合成酶活力的测定 【原理】 谷氨酰胺合成酶（GS ）是植物体内氨同化的关键酶之一，在A TP 和Mg 2+存在下，它催化植物体内谷氨酸形成谷氨酰胺。在反应体系中，谷氨酰胺转化为γ─谷氨酰基异羟肟酸，进而在酸性条件下与铁形成红色的络合物，该络合物在540nm 处有最大吸收峰，可用分光光度计测定。谷氨酰胺合成酶活性可用产生的γ─谷氨酰基异羟肟酸与铁络合物的生成量来表示，单位μmol ·mg ﹣1protein ·h ﹣1。也可间接用540nm 处吸光值的大小来表示，单位A ·mg ﹣1 protein ·h ﹣1。 【仪器与用具】 冷冻离心机；分光光度计；天平；研钵；恒温水浴；剪刀；移液管（2ml 、1ml ）。 【试剂】 提取缓冲液： 0.05mol/L Tris-HCl ，pH8.0，内含2mmol/L Mg 2+ ，2mmol/L DTT ，0.4mol/L 蔗糖。称取Tris （三羟甲基氨基甲烷）1.5295g ，0.1245g MgSO 4·7H 2O ，0.1543g DTT （二硫苏糖醇）和34.25g 蔗糖，去离子水溶解后，用0.05 mol/L HCl 调至pH8.0，最后定容至250ml ； 反应混合液A （0.1mol/L Tris-HCl 缓冲，pH7.4）： 内含80mmol/L Mg 2+ ，20mmol/L 谷氨酸钠盐，20mmol/L 半胱氨酸和2mmol/L EGTA ，称取 3.0590g Tris ，4.9795 gMgSO 4·7H 2O, 0.8628g 谷氨酸钠盐，0.6057g 半胱氨酸，0.1920gEGTA ，去离子水溶解后，用0.1mol/L HCl 调至pH7.4，定容至250ml ； 反应混合液B （含盐酸羟胺，pH7.4）： 反应混合液A 的成分再加入80mol/L 盐酸羟胺，pH7.4； 显色剂（0.2mol/L TCA, 0.37mol/L FeCl 3和0.6mol/L HCl 混合液）： 3.3176g TCA （三氯乙酸），10.1021g FeCl 3·6H 2O ，去离子水溶解后，加5ml 浓盐酸，定容至100ml ； 40mmol/L A TP 溶液：0.1210g A TP 溶于5ml 去离子水中（临用前配制）。 【方法】 1.粗酶液提取 称取植物材料1g 于研钵中，加3ml 提取缓冲液，置冰浴上研磨匀浆，转移于离心管中，4℃下15,000g 离心20min ，上清液即为粗酶液。 2.反应 1.6ml 反应混合液B ，加入0.7ml 粗酶液和0.7ml A TP 溶液，混匀，于37℃下保温半小时，加入显色剂1ml ，摇匀并放置片刻后，于5,000g 下离心10min ，取上清液测定540nm 处的吸光值，以加入1.6ml 反应混合液A 的为对照。 3.粗酶液中可溶性蛋白质测定 取粗酶液0.5ml ，用水定容至100ml ，取2ml 用考马斯亮蓝G-250测定可溶性蛋白质（见实验28）。 4.原始数据记载 5.结果计算： GS 活力(A ·mg ﹣1 protein ·h ﹣1)＝t V P A ?? 式中 A —540nm 处的吸光值； P —粗酶液中可溶性蛋白含量（mg/ml ）； V —反应体系中加入的粗酶液体积（ml ）； T —反应时间（h ）。
谷氨酰胺合成酶活性的测定
谷氨酰胺合成酶活性的测定 一．试剂 （1）酶提取缓冲液（0.05mol/L Tris- HCl，pH 8.0；内含2mmol/L Mg2+、2mmol/L DTT、0.4mol/L蔗糖） 称取 Tris[三（羟甲基）氨基甲烷]1.5295 g，MgSO4·7H2O 0.1245g，DTT（二硫苏糖醇）0.1543 g和蔗糖34.23 g，去离子水溶解后，用0.5~1.0 mol/L HCl调至pH 8.0，最后定容至250 mL。 （2）酶反应液 1.对照反应液A（0.1mol/L Tris- HCl缓冲液，pH 7.4；内含80mmol/L Mg2+、20mmol/L谷氨酸钠盐、20mmol/L半胱氨酸和2mmol/L EDTA-Na2）称取1.2236 g Tris、1.9918 g MgSO4·7H2O、0.3451 g谷氨酸钠盐、0.2422 g半胱氨酸、0.0744 g EDTA-Na2，分别用去离子水浴解后，用0.5~1.0mol/L HCl调至pH 7.4，定容至100mL。 2.完全反应液B（含盐酸羟胺、pH 7.4的0.1mol/L Tris- HCl缓冲液） 除了反应混合液A的成分外，再添加80mmol/L盐酸羟胺（每100 mL 中含0.5560 g盐酸羟胺）。 （3）显色剂（0.2mol/L TCA、0.37mol/L FeCl3和0.6mol/L HCl混合液） 称取3.3176 g TCA（三氯乙酸）和10.1021 g FeCl3·6H20，用去离子水溶解后，加5mL浓盐酸，定容至100mL。 （4）40mmol/L ATP溶液
称取0.2420 g ATP溶于10 mL去离子水中（临用前配制）。 二．实验步骤 （1）粗酶液的提取 取10mL藻液，在4500r/min离心15分钟，去掉上清液，加5mL酶提取液，超声波破碎10min，4℃,12000g离心20min,上清液即为粗酶提取液 （2）GS活性的测定 取1.0mL完全反应液B于10mL离心管中，加入0.5mL粗酶液和0.5mL ATP溶液，混匀，于37℃下保温0.5 h，加入1mL显色剂终止反应，摇匀，室温下放置5min后，于3500r/min下离心10min，取上清液于540nm下测定吸光度，以加入1.0mL对照反应液A的为对照。三．结果处理及计算 GS活性[A540/(g·h）]= A540为540nm处的吸光度； m 为样品质量（g）； Vt为粗酶液总体积（mL）； Vs为反应体系中加入的粗酶液体积（mL）； t 为反应时间（h）。
乳糖诱导大肠杆菌中重组谷氨酰胺合成酶的表达
乳糖诱导大肠杆菌中重组谷氨酰胺合成酶的表达 刘俊红1,2,刘顺谊2,殷志敏2 (1.安徽师范大学生命科学学院,安徽芜湖241000) (2.南京师范大学生命科学学院,江苏南京210097) [摘要] 以重组枯草芽孢杆菌谷氨酰胺合成酶(L 2谷氨酸:氨连接酶,Glutam ine Synthetase,GS EC 6131112)蛋 白表达宿主菌株BL21(DE3)(pET3C /谷氨酰胺合成酶)作为研究对象,借助S DS 2P AGE 分析方法,对于用乳糖 诱导由T7lac 启动子控制的重组目的产物蛋白的表达规律进行了优化研究,分别比较了最佳诱导起始生长量、 所需乳糖的浓度、诱导持续时间、补加乳糖和氨苄青霉素及不同培养基等参数对重组产物表达的影响.实验结 果表明,对于T7lac 启动子控制的重组目的产物,乳糖作为诱导剂也可以起到很好的诱导表达效果,诱导产物的 表达量、可溶性及酶活与I PTG 诱导产物基本接近.本研究结果为乳糖作为诱导剂应用于重组大肠杆菌谷氨酰 胺合成酶工业化生产提供了一定的参考依据. [关键词] 谷氨酰胺合成酶,原核表达,乳糖,I PTG [中图分类号]Q 78 [文献标识码]A [文章编号]100124616(2006)0320066205 Expressi on of Reco m b i n an t Glut am i n e Syn thet a se i n Escherich ia coli I nduced by Lactose L i u J unho ng 1,2,L i u S hunyi 2,Yi n Zh i m in 2 (1.College of L ife Science,Anhui Nor mal University,W uhu 241000,China ) (2.School of L ife Science,Nanjing Nor mal University,Nanjing 210097,China ) Abstract:L 2Glutam ine is mainly p r oduced by fer mentati on,rarely by enzy me reacti on .Gluta m ine Syn 2 thetase gene is a mp lified fr om Bacillus Subtilis gnd cl oned int o p r okaryotic exp ressi on vect or pET3C .Af 2 ter the transf or mati on of this recombinant p las m id int o BL -21(DE3),Lact ose and I PTG (is op r opyl 2 β2D 2thi ogalact o 2pyranoside is op r opylthi o 2β2D 2galact oside )are used t o induce gene exp ressi on at 37℃re 2 s pectively .Both of the m can induce the exp ressi on of the Gluta m ine Synthetase gene efficiently .The in 2 fluences of culture conditi on such as the lact ose concentrati on,gr owth mediu m compositi on,the durati on of the inducti on and the re -additi on of lact ose on the exp ressi on of the recombinant p r otein are analyzed in detail .The inducti on efficiency of lact ose is basically the sa me as that of I PTG,which p r ovides the evi 2 dence that lact ose could be a p r om ising inducer in the future large scale p r oducti on of recombined Gluta 2 m ine Synthetase . Key words:Gluta m ine Synthetase,p r okaryotic exp ressi on,lact ose,I PTG 收稿日期:2005211228. 基金项目:国家教委留学回国人员基金(2002S WXS BJBC22)、南京师范大学人才基金(2001S WXXG QB914)资助项目. 作者简介:刘俊红,女,1970—,博士研究生,讲师,主要从事细胞生物学的学习与研究.E 2mail:liujunhong700911@yahoo https://www.360docs.net/doc/149193469.html, 通讯联系人:殷志敏,1963—,教授,博士生导师,主要从事生物化学及细胞生物学的教学与研究.E 2mail:yinzhi m in@njnu .edu .cn 0 引言 L 2谷氨酰胺是一种对人体十分有益的氨基酸衍生物,它在氨基酸代谢中具有极其重要的地位,已广泛应用于营养补给、抗疲劳、胃肠道功能修复和提高人体免疫等方面,其市场需求量日渐增长. 目前国内外主要以发酵法生产L 2谷氨酰胺.近年来,酶法合成L 2谷氨酰胺已开始有少量研究[1,2],在 第29卷第3期2006年9月 南京师大学报(自然科学版)JOURNAL OF NANJ I N G NOR MAL UN I V ERSI TY (Natural Science ) Vol .29No .3Sep,2006
谷氨酸合成酶(Glutamate synthase,GOGAT)试剂盒说明书
货号：MS1801 规格：100管/96样谷氨酸合成酶（Glutamate synthase，GOGAT）试剂盒说明书 微量法 正式测定前务必取2-3个预期差异较大的样本做预测定 测定意义： GOGAT广泛分布于植物中，和谷氨酰胺合成酶共同构成GS/GOGAT循环，参与氨同化的调控。 测定原理： GOGAT催化谷氨酰胺的氨基转移到α-酮戊二酸，形成两分子的谷氨酸；同时NADH氧化生成NAD+，340nm吸光度的下降速率可以反映GOGAT活性大小。 自备实验用品及仪器： 紫外分光光度计/酶标仪、台式离心机、水浴锅、可调式移液器、微量石英比色皿/96孔板、研钵、冰和蒸馏水。 试剂组成和配制： 提取液：液体100mL×1瓶，4℃保存； 试剂一：液体20mL×1瓶，4℃保存； 试剂二：粉剂×2瓶，4℃保存； 粗酶液提取： 细菌或培养细胞：先收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清；按照细菌或细胞数量（104个）：提取液体积（mL）为500~1000：1的比例（建议500万细菌或细胞加入1mL提取液），超声波破碎细菌或细胞（冰浴，功率20％或200W，超声3s，间隔10s，重复30次）；8000g 4℃离心10min，取上清，置冰上待测。 组织：按照组织质量（g）：提取液体积(mL)为1：5~10的比例（建议称取约0.1g组织，加入1mL提取液），进行冰浴匀浆。8000g 4℃离心10min，取上清，置冰上待测。 测定步骤： 1、分光光度计或酶标仪预热30min以上，调节波长至340nm，蒸馏水调零。 2、样本测定 （1）在试剂二中加入9mL试剂一充分溶解混匀，置于37℃（哺乳动物）或25℃（其它物种）水浴5min；现配现用（配好后3h内用完）； （2）在微量石英比色皿或96孔板中加入20μL样本和180μL试剂二，混匀，立即记录340nm 处20s时的吸光值A1和 5min20s后的吸光值A2，计算ΔA=A1-A2。 GOGAT活性计算： a.用微量石英比色皿测定的计算公式如下 （1）按样本蛋白浓度计算： 单位的定义：每mg组织蛋白每分钟消耗1 nmol的NADH定义为一个酶活力单位。 GOGAT（nmol/min/mg prot）＝[ΔA×V反总÷（ε×d）×109]÷(V样×Cpr) ÷T=321×ΔA÷Cpr （2）按样本鲜重计算： 单位的定义：每g组织每分钟消耗1 nmol NADH定义为一个酶活力单位。 第1页，共2页
谷氨酰胺合成酶活性测定
谷氨酰胺合成酶活性测定 原理谷氨酰胺合成酶（GS）是植物体内氨同化的关键酶之一，在ATP 和M g 2+ 存在下，它催化植物体内谷氨酸形成谷氨酰胺。在反应体系中，谷氨酰胺转化为γ—谷氨酰基异羟肟酸，进而在酸性条件下与铁形成红色的络合物，该络合物在540nm 处有最大吸收峰，可用分光光度计测定。谷氨酰胺合成酶活性可用产生的γ—谷氨酰基异羟肟酸与铁络合物的生成量来表示，单位μmol·mg －1 protein·h －1 。也可间接用540nm 处吸光值的大小来表示，单位A·mg －1 protein·h －1 。【仪器与用具】冷冻离心机；分光光度计；天平；研钵；恒温水浴；剪刀；移液管（2 ml、1ml）。【试剂】提取缓冲液：0.05mol/L Tris-HCl，pH8.0，内含2mmol/L Mg 2+ ，2mmol/L DTT，0.4 mol/L 蔗糖。称取Tris（三羟甲基氨基甲烷）1.5295g，0.1245g MgSO 4 ·7 H 2 O，0.1543g DTT（二硫苏糖醇）和34.25g 蔗糖，去离子水溶解后，用0.05 mol/L HCl 调至pH8.0，最后定容至250ml；反应混合液A（0.1mol/L Tris-HCl 缓冲，pH7.4）：内含80mmol/L Mg 2+ ，20mmol/L 谷氨酸钠盐，20mmol/L 半胱氨酸和2 mmol/L EGTA，称取3.0590g Tris，4.9795 gMgSO 4 ·7H 2 O, 0.8628g 谷氨酸钠盐，0.6057g 半胱氨酸，0.1920gEGTA，去离子水溶解后，用0. 1mol/L HCl 调至pH7.4，定容至250ml；反应混合液B（含盐酸羟胺，pH7.4）：反应混合液A 的成分再加入80mmol/L 盐酸羟胺，pH7.4；显色剂（0.2mol/L TCA, 0.37mol/L FeCl 3 和0.6mol/L HCl 混合液）：3.3176g TCA（三氯乙酸），10.1021g FeCl 3 ·6H 2 O，去离子水溶解后，加5ml 浓盐酸，定容至100ml；40mmol/L ATP 溶液：0.1210g ATP 溶于5ml 去离子水中（临用前配制）。【方法】1.粗酶液提取称取植物材料1g 于研钵中，加3ml 提取缓冲液，置冰浴上研磨匀浆，转移于离心管中，4℃下15,000g 离心20min，上清液即为粗酶液。2.反应 1.6ml 反应混合液B，加入0.7ml 粗酶液和0.7ml ATP 溶液，混匀，于37℃下保温半小时，加入显色剂1ml，摇匀并放置片刻后，于5,000g 下离心10min，取上清液测定540nm 处的吸光值，以加入1.6ml 反应混合液A 的为对照。3.粗酶液中可溶性蛋白质测定取粗酶液0.5ml，用水定容至100ml，取2ml 用考马斯亮蓝G-250 测定可溶性蛋白质（见实验28）。 4.原始数据记载 5.结果计算：GS 活力(A·mg －1 protein·h －1 )＝式中A—540nm 处的吸光值；P—粗酶液中可溶性蛋白含量（mg/ml）；V—反应体系中加入的粗酶液体积（ml）；T—反应时间（h）。
植物体内谷氨酰胺合成酶活力的测定
植物体内谷氨酰胺合成酶活力的测定 一、实验原理 谷氨酰胺合成酶（GS）是植物体内氨同化的关键酶之一，在ATP和Mg2+存在下，它催化植物体内谷氨酸形成谷氨酰胺。在反应体系中，谷氨酰胺转化为γ─谷氨酰基异羟肟酸，进而在酸性条件下与铁形成红色的络合物，该络合物在540nm处有最大吸收峰，可用分光光度计测定。谷氨酰胺合成酶活性可用产生的γ─谷氨酰基异羟肟酸与铁络合物的生成量来表示，单位μmol·mg﹣1protein·h ﹣1。也可间接用540nm处吸光值的大小来表示，单位A·mg﹣1 protein·h﹣1。 二、仪器与用具 冷冻离心机；分光光度计；天平；研钵；恒温水浴；剪刀；移液管（2ml、1ml）。 三、试剂 1、提取缓冲液：0.05mol/LTris-HCl，pH8.0，内含2mmol/LMg2+，2mmol/L DTT， 0.4mol/L蔗糖。称取Tris（三羟甲基氨基甲烷）1.5295g，0.1245g MgSO 4·7H 2 O， 0.1543g DTT（二硫苏糖醇）和34.25g蔗糖，去离子水溶解后，用0.05 mol/L HCl 调至pH8.0，最后定容至250ml； 2、反应混合液A（0.1mol/L Tris-HCl缓冲，pH7.4）：内含80mmol/L Mg2+，20mmol/L 谷氨酸钠盐，20mmol/L半胱氨酸和2mmol/L EGTA，称取3.0590g Tris，4.9795 gMgSO 4·7H 2 O, 0.8628g谷氨酸钠盐，0.6057g半胱氨酸，0.1920gEGTA，去离子 水溶解后，用0.1mol/L HCl调至pH7.4，定容至250ml； 3、反应混合液B（含盐酸羟胺，pH7.4）：反应混合液A的成分再加入80mmol/L 盐酸羟胺，pH7.4； 4、显色剂（0.2mol/L TCA, 0.37mol/L FeCl 3 和0.6mol/L HCl混合液）：3.3176g TCA（三氯乙酸），10.1021g FeCl 3·6H 2 O，去离子水溶解后，加5ml浓盐酸，定 容至100ml； 5、40mmol/L ATP溶液：0.1210g ATP溶于5ml去离子水中（临用前配制）。
实验三预习报告 硝酸还原酶和谷氨酰胺合成酶活性的测定
实验三、硝酸还原酶和谷氨酰胺合成酶活性的测定 一、硝酸还原酶的测定 [原理]： 硝酸还原酶（NR）是植物氮素同化的关键酶，它催化植物体内的硝酸盐还原为亚硝酸盐，产生的亚硝酸盐与对-氨基苯磺酸（或对-氨基苯磺酰胺）及α-萘胺（或萘基乙烯胺）在酸性条件下定量生成红色偶氮化合物。 生成的红色偶氮化合物在540nm有最大吸收峰，可用分光光度法测定。硝酸还原酶活性可由产生的亚硝态氮的量表示。一般以每克鲜重含氮量表示，即以ug.g-1.h-1为单位。NR的测定可分为活体法和离体法。活体法步骤简单，适合快速、多组测定。离体法复杂，但重复性较好。 [试剂] 1．亚硝酸钠标准溶液：准确称取分析纯NaNO20.9857g溶于去离子水后定容至1 000ml，然后再吸取5ml定容至1000ml，即为含亚硝态氮1ug.ml-1的标准液；2．0.1molpH7.5的磷酸缓冲液：Na2HPO4.12H2O30.0905g与NaH2PO4.2H2O 2.4965g加去离子水溶解后定容至1 000ml； 3．1%（W/V）溶液：1.0g 对氨基苯磺酸溶于100ml 3 mol.L-1HCL中（25ml浓盐酸加水定容至100ml 即为 3 mol.L-1HCL）； 4．0.02%（W/V）萘基乙烯胺溶液：0.020g萘基乙烯胺溶于100ml 去离子水中，贮于棕色瓶中； 5．0.1mol.L-1KNO3溶液：2.5275g KNO3溶于250Ml 0.1mol.L-1Ph7.5的磷酸缓冲液中； 6．0.025mol.L-1Ph 8.7 的磷酸缓冲液：8.864 0g Na2HPO4.12H2O，0.0570g KH2OP4.3H2O，溶于1 000ml去离子水中； 7．30%三氯乙酸溶液：30g三氯乙酸。水溶后定容至100ml。 [方法]； 摇匀后在25度下保温30min，然后在540nm下比色测定。以亚硝态氮（ug）为横坐标（X），吸光值为纵坐标（Y）建立回归方程。 2.样品中硝酸还原酶活力测定 1.在取材的前一天加50mmol/L KNO3或NaNO3到培养苗的水中就可以诱导酶的产生。 2.称取作物叶片0.5g（共3份，剪成1cm 左右的小段（均匀），放入3只三角瓶中，其中 1份作对照，另外2份作酶活性测定用。 3.反应：先向对照三角瓶中加入1ml30%三氯乙酸溶液，然后各三角瓶中都加入9ml 0.1mol/L KNO3溶液，混匀后立即放入干燥器中，抽气30分钟（期间几次通入空气，再 抽真空，使叶片完全沉入瓶底，后在25℃黑暗中反应0.5小时，分别向测定瓶（对照瓶除外）加入1ml30%三氯乙酸终止酶反应。
硝酸还原酶与谷氨酰胺合成酶的测定
硝酸还原酶与谷氨酰胺合成酶活性的测定 摘要本实验以小麦为实验材料，对小麦进行预处理，提取酶液进行硝酸还原酶与谷氨酰胺合成酶活性的测定，说明小麦对氮素的利用途径。 关键词小麦硝酸还原酶谷氨酰胺合成酶酶活性 引言 硝酸还原酶(NR)是植物代谢中十分重要的一种酶,它主要是在硝酸亚硝化过程中起催化作用。同时, 它对其他代谢如光合作用、碳代谢和能量代谢都有重要影响[1]。就植物的生长和发育而言 ,氮素的同化是个十分重要的生理过程。其中 ,无机氮必须同化为谷氨酰胺和谷氨酸等有机氮才能被植物体所吸收和利用。谷氨酰胺合成酶 (GS) 是高等植物氮代谢中十分重要的酶 ,它和谷氨酸合成酶联合作用 ,催化氨的同化 ,使其转变成 Gln 和 Glu ,在小麦植物体内含氮有机物的生物合成中作为 N 的供体[2]。 1、实验材料与方法 1.1实验材料与试剂 小麦、亚硝酸钠、磷酸氢二钠、对氨基苯磺酸、浓盐酸、萘基乙烯胺、硝酸钾、三氯乙酸、反应液、终止液、显色液、亚硝态氮标准溶液、三羟甲基氨基甲烷、硫酸镁、二硫苏糖醇、蔗糖、浓盐酸、谷氨酸钠盐、半胱氨酸、乙二醇双（氨乙基醚）四乙酸（EGTA）、盐酸羟胺、氯化铁、三氯乙酸、三磷酸腺苷（ATP）。 1.2实验原理 1.2.1硝酸还原酶活性的测定 硝酸还原酶（NR）是植物氮素同化的关键酶，它催化植物体内的硝酸盐还原为亚硝酸盐，产生的亚硝酸盐与对-氨基苯磺酸（或对-氨基苯磺酰胺）及α-
萘胺（或萘基乙烯胺）在酸性条件下定量生成红色偶氮化合物。此红色偶氮化合物在540nm下有最大吸收峰，可用分光光度计测定。故硝酸还原酶活性可由产生的亚硝态氮的量表示，而亚硝态氮的量可有标准曲线查的。 1.2.2谷氨酰胺合成酶活性的测定 谷氨酰胺合成酶（GS）是植物体内氨同化的关键酶之一，在ATP和Mg2+存在下，它能催化植物体内在硝酸还原过程中产生的氨与谷氨酸形成谷氨酰胺，实现氨的同化，在生物体内，谷氨酰胺既是氨的贮存形式（消除氨毒），又可用于谷氨酸的合成，在进一步合成其他氨基酸。但在该实验设计反应体系中，谷氨酰胺与盐酸羟胺等物质发生反应，生成γ-谷氨酰基异羟肟酸。此物质在酸性条件下可与Fe3+形成红色的络合物，该络合物在540nm处有最大吸收峰，可用分光光度计测定。因此，谷氨酰胺合成酶的活性可用产生的γ-谷氨酰基异羟肟酸与Fe3+形成的络合物的量来表示，一般间接用540nm处吸光值的大小来表示，单位为：A?mg-3(protein) ?h-1。 1.3实验步骤 1.3.1硝酸还原酶活性的测定 1.3.1.1标准曲线制作 取7支试管，按下表顺序依次添加试剂。摇匀后在30℃下水浴20min，然后在540nm下比色。以亚硝态氮含量与对应吸光值建立回归方程。 符号 1 2 3 4 5 6 7
谷氨酰胺合成酶
谷氨酰胺合成酶 大家都知道，我们人体的正常运作和很多方面的协力合作是分不开的，比如一些器官、物质之类的，缺一不可。其实除了这些宏观的方面，还有一些围观的物质，对人体的健康起着非常重要的影响，同样，人体也离不开这些微小的物质，例如矿物质，还有一些盐、钾、锌、钙、酶之类的，这些都是我们肉眼见不到的。 说到酶，大部分人应该都没什么概念，但是对于那些生物方面的学者专家而言，是再熟悉不过了，他们清楚的知道这些酶对我们身体的重要性，以及如果确实而会造成的影响。下面就来介绍一种酶：谷氨酰胺合成酶 。 谷氨酰胺合成酶是一种控制氮代谢的酶。谷氨酰胺这种氨基酸，不仅被细胞用来合成蛋白质，也是用来运输氮的。自由的铵离子对生物有毒性，在血液中不能太多，但是一些生物过程又会产生游离的铵离子;所以就让谷氨酰胺来运输这些铵离子。当细
胞需要运输多余的铵离子的时候，就用铵离子和谷氨酸来合成谷氨酰胺，同时消耗ATP。谷氨酰胺合成酶催化的就是这个反应。这个反应分成两步进行，酶先让ATP和谷氨酸反应，生成γ-谷氨酰磷酸;接着铵离子上来，替换掉磷酸。 在高等植物的研究中，GS也常被定义为植物氨同化所必需的酶。人谷氨酰胺合成酶叫做hGS。 ★谷氨酰胺合成酶可分为三大类： GSI：分布于原核生物。 GSII：主要分布于真核生物和少量细菌，如根瘤菌和放线菌。 GSIII：目前只在少量的细菌中有发现，如脆弱类杆菌和溶纤维丁酸弧菌。
通过上面对谷氨酰胺合成酶的详细介绍，相信很多人对谷氨酰胺合成酶 有了进一步的认识与了解，也知道了谷氨酰胺合成酶对我们人体的重要性。所以我们才要更好地还户自己的身体，以保证这些酶的数量保持正常，才能维持人体的基本健康和稳定。
谷氨酰胺合成酶(Glutamine synthetase,GS)试剂盒使用说明
谷氨酰胺合成酶（Glutamine synthetase，GS）试剂盒使用说明 分光光度法货号：BC0910 规格：50管/24样 产品内容： 提取液：30mL×1瓶，4℃保存。 试剂一：10mL×1瓶，-20℃保存。 试剂二：10mL×1瓶，-20℃保存。 试剂三：粉剂×2瓶，-20℃保存。用时每瓶加入5mL蒸馏水充分溶解备用，用不完的试剂仍-20℃保存。 试剂四：10mL×1瓶，4℃保存。 产品说明： GS（EC6.3.1.2）主要存在于植物中，是生物体内氨同化的关键酶之一，催化铵离子和谷氨酸合成谷氨酰胺，不仅可以防止过多的铵离子对生物有毒性，而且谷氨酰胺也是氨的主要储存和运输形式。 GS在ATP和Mg2+存在下，催化铵离子和谷氨酸合成谷氨酰胺；谷氨酰胺进一步转化为γ─谷氨酰基异羟肟酸，在酸性条件下与铁形成红色的络合物；该络合物在540nm处有最大吸收峰，可用分光光度计测定。 所需的仪器和用品： 可见分光光度计、水浴锅、台式离心机、可调式移液器、1mL玻璃比色皿、研钵、冰和蒸馏水。 操作步骤：
一、样本测定的准备 1、细菌、细胞或组织样品的制备： 细菌或培养细胞：先收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清；按照细菌或细胞数量（104个）：提取液体积（mL）为500~1000：1的比例（建议500万细菌或细胞加入1mL提取液），超声波破碎细菌或细胞（冰浴，功率20％或200W，超声3s，间隔10s，重复30次）；8000g4℃离心10min，取上清，置冰上待测。 组织：按照组织质量（g）：提取液体积(mL)为1：5~10的比例（建议称取约0.1g组织，加入1mL提取液），进行冰浴匀浆。8000g4℃离心10min，取上清，置冰上待测。 2、血清（浆）样品：直接检测。 二、测定步骤 1、分光光度计预热30min以上，调节波长至540nm，蒸馏水调零。 2、在EP管中加入下列试剂： 试剂名称（μL）测定管对照管 试剂一320 试剂二320 试剂三140140 样本140140 混匀，37℃（哺乳动物）或25℃（其他物种）准确水浴30min 试剂四200200 混匀，静置10min后，5000g，常温离心10min，取上清液测定540nm处的吸光值A。△A=A
谷氨酰胺合成酶测定
谷氨酰胺合成酶（GS）活性测定 一、实验原理 谷氨酰胺合成酶（GS）是植物体内氨同化的关键酶之一，在ATP 和Mg2+存在下，它催化植物体内谷氨酸形成谷氨酰胺。在反应体系中，谷氨酰胺转化为γ─谷氨酰基异羟肟酸，进而在酸性条件下与铁形成红色的络合物，该络合物在540nm处有最大吸收峰，可用分光光度计测定。谷氨酰胺合成酶活性可用产生的γ─谷氨酰基异羟肟酸与铁络合物的生成量来表示，单位μmol·mg﹣1protein·h﹣1。也可间接用540nm处吸光值的大小来表示，单位A·mg﹣1protein·h﹣1。二、实验仪器与用具 冷冻离心机；分光光度计；天平；研钵；恒温水浴；剪刀；移液管（2ml、1ml） 三、实验试剂 （1）提取缓冲液（0.05mol/L Tris-HCl，pH8.0）。内含2mmol/L Mg2+，2mmol/L DTT，0.4mol/L蔗糖。称取Tris（三羟甲基氨基甲烷）1.5295g，0.1245g MgSO4·7H2O，0.1543g DTT（二硫苏糖醇）和34.25g 蔗糖，去离子水溶解后，用0.05 mol/L HCl（0.1mol/L = 1ml的36%~38%浓盐酸加入到100ml去离子水里）调至pH8.0，最后定容至250ml； （2）反应混合液A（0.1mol/L Tris-HCl缓冲，pH7.4）。内含80mmol/L Mg2+，20mmol/L谷氨酸钠盐，20mmol/L半胱氨酸和2mmol/L EGTA。称取3.0590g Tris，4.9795 gMgSO4·7H2O, 0.8628g谷氨酸钠
盐，0.6057g半胱氨酸，0.1920gEGTA，去离子水溶解后，用0.1mol/L HCl调至pH7.4，定容至250ml； （3）反应混合液B（含盐酸羟胺，pH7.4）。反应混合液A的成分再加入80mmol/L盐酸羟胺，pH7.4； （4）显色剂（0.2mol/L TCA, 0.37mol/L FeCl3和0.6mol/L HCl混合液）。 3.3176g TCA（三氯乙酸），10.1021g FeCl3·6H2O，去离子水溶解后，加5ml浓盐酸，定容至100ml； （5）40mmol/L ATP溶液。称取0.1210g ATP溶于5ml去离子水中（临用前配制） 四、方法步骤 1.粗酶液提取 称取植物材料0.5-1g与于研钵中，加3ml（实际情况作调整）提取缓冲液，置冰浴上研磨匀浆，转移于离心管中，4℃下12,000r.min-1离心20min，上清液即为粗酶液。 2.反应 1.6ml反应混合液B，加入0.7ml粗酶液和0.7ml ATP溶液，混匀，于37℃下保温半小时，加入显色剂1ml，摇匀并放置片刻后，于5,000 r.min-1下离心10min，取上清液测定540nm处的吸光值，以加入1.6ml反应混合液A的为对照。 3.粗酶液中可溶性蛋白质测定 取粗酶液0.5ml，用水定容至100ml，取1ml用考马斯亮蓝G-250测
植物体内谷氨酰胺合成酶活力的测定
植物体内谷氨酰胺合成酶活力的测定 实验原理 谷氨酰胺合成酶（GS）是植物体内氨同化的关键酶之一，在ATP和Mg2+存在下，它催化植物体内谷氨酸形成谷氨酰胺。在反应体系中，谷氨酰胺转化为γ─谷氨酰基异羟肟酸，进而在酸性条件下与铁形成红色的络合物，该络合物在540nm处有最大吸收峰，可用分光光度计测定。谷氨酰胺合成酶活性可用产生的γ─谷氨酰基异羟肟酸与铁络合物的生成量来表示，单位μmol·mg﹣1protein·h ﹣1。也可间接用540nm处吸光值的大小来表示，单位A·mg﹣1 protein·h﹣1。 仪器与用具 冷冻离心机；分光光度计；天平；研钵；恒温水浴；剪刀；移液管（2ml、1ml）。 试剂 提取缓冲液：0.05mol/L Tris-HCl，pH8.0，内含2mmol/L Mg2+，2mmol/L DTT， 0.4mol/L蔗糖。称取Tris（三羟甲基氨基甲烷）1.5295g，0.1245g MgSO 4·7H 2 O， 0.1543g DTT（二硫苏糖醇）和34.25g蔗糖，去离子水溶解后，用0.05 mol/L HCl 调至pH8.0，最后定容至250ml； 反应混合液A（0.1mol/L Tris-HCl缓冲，pH7.4）：内含80mmol/L Mg2+，20mmol/L谷氨酸钠盐，20mmol/L半胱氨酸和2mmol/L EGTA，称取3.0590g Tris， 4.9795 gMgSO 4·7H 2 O, 0.8628g谷氨酸钠盐，0.6057g半胱氨酸，0.1920gEGTA， 去离子水溶解后，用0.1mol/L HCl调至pH7.4，定容至250ml； 反应混合液B（含盐酸羟胺，pH7.4）：反应混合液A的成分再加入80mmol/L 盐酸羟胺，pH7.4； 显色剂（0.2mol/L TCA, 0.37mol/L FeCl 3 和0.6mol/L HCl混合液）：3.3176g TCA（三氯乙酸），10.1021g FeCl 3·6H 2 O，去离子水溶解后，加5ml浓盐酸，定 容至100ml； 40mmol/L ATP溶液：0.1210g ATP溶于5ml去离子水中（临用前配制）。 方法
谷氨酰胺合成酶
谷氨酰胺合成酶（GS） 1、培养条件：将菌株转接到斜面培养基上，在30℃下培养3 d，再从种子培养基接种到产酶培养基上，摇床培养条件为28℃下培养36 h，液体培养摇床的转速为160 r/min。 2、无细胞抽提液的制备 （1）菌体收集。菌株在摇床培养36 h，在转速8 000 r/min 下离心20 min，以质量分数为1%的KCl溶液洗涤2次，得到湿菌体，放入-20℃冰箱中保存，备用。 （2）超声波破碎。融化冻存的菌体，加入3倍体积的浓度为0.05 mol/L 咪唑-HC1缓冲液(pH 值7.0，含浓度2 mmol/L的DTT，用于保护酶蛋白的二硫键，免受超声波的破坏；含浓度2 mmol/L 的Mg 2+，用于稳定酶活力），制成菌悬液，用超声波破碎器于冰浴中在功率400 W，工作1 s，间歇3 s 条件下处理20 min。然后在温度4℃，转速8 000 r/min 下离心30 min，上清部分即为无细胞抽提液。 3、酶活测定[1]：反应总体积为 3 mL，1.6 mL的反应混合液（pH 值7.0） 0.1 mol/L的Tris- HCl 80mmol/L的Mg 2+ 20 mmol/L的谷氨酸钠盐20 mmol/L的半胱氨酸 2 mmol/L的EDTA 80 mmol/L的盐酸羟胺 再加入0.7 mL的浓度40 mmol/L的A TP溶液，最后加入0.7 mL的粗酶液，混匀。于37℃下保温0.5 h。 加入显色液（含浓度0.2 mol/L的TCA，0.37 mol/L 的FeCl 3和0.6
mol/L的HCl混合液）1 mL，终止反应并显色。空白对照采用上述反应液体系，不加酶液蒸馏水补足反应体积。 在波长540 nm 处比色测定形成的γ-谷氨酰羟肟酸。在上述条件下，1 min催化形成1μmolγ-谷氨酰羟肟酸所需要的酶量定义为1个酶活力单位，比活力为U/mg 蛋白。 A 计算公式为：GS 酶活力= P t ?V ? 式中：A———540 nm 处的吸光度； P———粗酶液中可溶性蛋白含量，mg/mL； V———反应体系中加入的粗酶液体积，mL； t ———反应时间，h。 4、粗酶液中蛋白含量测定： 采用考马斯亮蓝法，以牛血清蛋白为标准蛋白。 试剂： 100mg考马斯亮蓝G-250溶于50mL 95% 乙醇中，然后加入100mL 85%（w/v）磷酸，最后定容到1升。 测定： 将10μL待测样品用90μL蒸馏水稀释到0.1mL，加到试管中，然后加入5mL 测定试剂，摇匀2min后在595nm下测光吸收值。 参照蛋白标准曲线，计算蛋白浓度，即0.050 A 595相当于1mg/mL 的蛋白浓度。 参考文献： 1.刘川顺，李平等.谷氨酰胺合成酶产酶菌株的筛选及酶学性质[J].农
谷氨酰胺合成酶(GS)检测试剂盒(氯化铁比色法)
谷氨酰胺合成酶(GS)检测试剂盒(氯化铁比色法) 简介： 谷氨酰胺合成酶(GS)是植物体内氨同化的关键酶之一，可以防止过多的铵离子对生物有毒性，在ATP 和Mg 2+存在下，谷氨酰胺合成酶催化铵离子和谷氨酸合成谷氨酰胺，能催化铵离子和谷氨酸合成谷氨酰胺，谷氨酰胺是氨的主要储存和运输形式。 Leagene 谷氨酰胺合成酶(GS)检测试剂盒(氯化铁比色法)检测原理是GS 催化铵离子和谷氨酸合成谷氨酰胺，后者转化为γ-谷氨酰基异羟肟酸，在酸性条件下与铁形成红色的络合物，单位为μmol/(mg protein ·h)；也可间接用540nm 处吸光度的大小来表示，单位为OD/(mg protein ·h)。该试剂盒主要用于检测植物样本、血清等中谷氨酰胺合成酶活性，尤其适用于植物体内谷氨酰胺合成酶的活，100T 检测试剂盒可以测定50次左右样本。该试剂盒仅用于科研领域，不宜用于临床诊断或其他用途。 组成： 自备材料： 1、 蒸馏水 2、 离心管或试管 3、 匀浆器或研钵 4、 低温离心机 5、 恒温箱或水浴锅 操作步骤(仅供参考)： 1、 准备样品： ①植物样品：取植物组织清洗干净，切碎，按植物组织：GS Lysis Buffer=比例，加入预冷的GS Lysis Buffer ，冰浴情况下充分匀浆或研磨，离心20min ，留取上清，即为谷氨酰胺 编号 名称 TE1103 100T Storage 试剂(A): GS Lysis Buffer 250ml 4℃ 试剂(B): GS Assay Buffer 250ml 4℃ 试剂(C): GS 启动剂 10ml RT 试剂(D): ATP 2支 4℃ 试剂(F): 蛋白标准(BSA) 20mg RT 试剂(G): G250染色液 100ml RT 使用说明书 1份