细胞生物学实验技术二
细胞生物学实验细胞活体染色技术
02030401Contents实验目的Experimental purpose01.实验目的Experimental purpose1．学习细胞活体染色的方法。
2．观察动、植物活细胞内线粒体，液泡系的形态、数量与分布。
实验原理Experimental principleExperimental principle活体染色：是利用某些无毒或毒性较小的染色剂，在不影响细胞生命活动的情况下显示细胞的天然构造。
分类：体内活体染色和体外活体染色。
Experimental principle试剂原理：1.詹纳斯绿B(Janus green B)能够活染线粒体为蓝色，主要是由于线粒体内膜上的细胞色素酶系使染料始终保持在氧化状态(即有色状态)，在周围的细胞质内，这些染料被还原为无色的色基(即无色状态)。
2.中性红是液泡系的特殊活体染色剂，它可将不同发育时期的液泡染成不同深度的红色，该染料对液泡系具有一定专一性。
3.台盼蓝(trypan blue)是一种偶氮类酸性染料，它可以把死亡细胞的质膜染色，可用台盼蓝鉴别活细胞与死细胞实验用品Experimental supply03.实验用品Experimental supply(一）材料：黄豆根尖、洋葱、小鼠。
(二)器械：显微镜、镊子、刀片、剪刀、解剖针、表面皿、载玻片、盖玻片、吸管、收水纸等。
(三)试剂：L．Ringer氏液NaCl 0．90gKCl 0．42gCaCl2 0．25g2．1／3000中性红溶液先配制1％的中性红Ringer氏原液，因中性红难溶解，需稍加热，(30℃-40℃)使之溶解，过滤，将滤液装入棕色瓶中暗处保存，临用前取少许原液用Ringer氏液稀释成1／3000的中性红溶液。
3．1／5000詹纳斯绿B先配制1％詹纳斯绿B溶Ringer氏溶液，方法同上。
4．台盼蓝染色液将1克台盼蓝溶于100毫升生理盐水中5．香柏油、二甲苯、蒸馏水等。
实验方法Experimental methods04.实验方法Experimental methods(一)液泡系的中性红活体染色黄豆芽根尖1．用双面刀片将黄豆芽根尖 (约l-2cm2) 处小心纵切断面，一定要薄且均匀。
细胞生物学复习资料
第二章细胞生物学实验技术一、名词解释1．显微分辨率（microscopic resolution）---在一定条件下利用显微镜所能看到的精细程度。
2．放射自显影技术（autoradiography）---用于整个细胞时，可以确定放射性标记物在细胞内的定位。
用于凝胶或琼脂平板时，能鉴定出放射性的条带或菌落。
3．双向凝胶电泳（two-dimensional electrophoresis）---根据分子质量及等电点的不同将复杂的蛋白质混合物分开。
这种高分辨率的技术能够分离同一混合物中的上千种蛋白质。
4．倒置显微镜（inverted microscope）---一种主要用于观察培养瓶或培养皿中的活细胞生长及分裂状态的特殊显微镜。
与普通光镜相比，其光源、聚光镜和物镜的位置是倒置的，即光源在上，物镜在载物台的下方。
另外，其聚光镜和物镜有较长的工作距离，以方便放置有一定厚度的培养瓶。
二、简答题1．电子显微镜为何不能观察活标本？因为电镜样品的观察室要求高度的真空条件。
2．简述冷冻蚀刻术的原理和方法。
冷冻蚀刻（freeze－etching）技术是在冷冻断裂技术的基础上发展起来的更复杂的复型技术。
如果将冷冻断裂的样品的温度稍微升高，让样品中的冰在真空中升华，而在表面上浮雕出细胞膜的超微结构。
当大量的冰升华之后，对浮雕表面进行铂一碳复型，并在腐蚀性溶液中除去生物材料，复型经重蒸水多次清洗后，捞在载网上作电镜观察。
3．比较投射电子显微镜和扫描电子显微镜。
答：都是用于放大与分辨微小结构，都是通过标本电子束的影响来探测标本结构。
TEM：电子束穿过标本，聚焦成像于屏幕或者显像屏上。
用于研究超薄切片标本，有极高的分辨率，可给出细微的胞内结构。
SEM：电子束在标本表面进行扫描，反射的电子聚焦成像于显像屏上。
可以反映未切片标本的的表面特征。
4．扫描隧道显微镜的工作原理及其优越性是什么？扫描隧道显微镜（scanning tunneling microscope，STM）由Binnig等1981年发明，是根据量子力学原理中的隧道效应而设计制造的。
细胞生物学实验技术st
实验一第一部分、显微镜的使用一、实验目的与要求1、了解光学显微镜的结构与工作原理；2、掌握光学显微镜的使用方法；3、掌握光学显微镜的日常维护技术。
二、光学显微镜的基本构造及功能1．镜筒(tube)：为安装在光镜最上方或镜管前方的圆筒状结构(图1、2)．其上端可装载目镜，下端与物镜转换器相连。
根据镜简的数目，光镜可分为单筒式和双筒式两类。
单筒光镜又分为直立式和倾斜式两种，而双筒式光镜的镜筒均为倾斜的。
镜筒直立式光镜与物镜的中心线〔光轴〕在同一直线上，而镜筒倾斜式光镜的目镜与物镜的中心线互成45。
角，在其镜筒中装有能使光线转换45。
角的棱镜。
2．物镜转换器(revolving nose-piece)：又称旋转盘，是安装在镜简下方的一圆盘状构造，可以按顺时针或逆时针方向自由旋转，其上均匀分布有3—4个圆孔，用以装载不同放大倍数的物镜。
转动旋转盘可使不同的物镜到达工作位置(即与光路合轴)，使用时注意凭手感使所需物镜准确到位。
3．镜臂(arm)：为支持镜筒和镜台的弯曲状构造，是取用显微镜时握拿的部位。
镜筒直立式光镜在镜管与其下方的镜柱之间有一倾斜关节，可使镜简向后倾斜一定角度以方便观察，但使用时倾斜角度不应超过45。
角，否则显微镜由于重心偏移容易翻倒。
4．调焦器(focusing ajustment)：也称调焦螺旋，为调节焦距的装置，位于镜臂的上端(镜筒直立式光镜)或下端(镜筒倾斜式光镜)，分粗调螺旋(大螺旋)和细调螺旋(小螺旋)两种。
粗调螺旋可使镜筒或载物台以较快速度或较大幅度升降，能迅速调节好焦距使物像呈现在视野中，适于低倍镜观察时的调焦。
而细调螺旋只能使镜简或载物台缓慢或较小幅度地升降(升或降的距离不易被肉眼观察到)，适用于高倍镜和油镜的聚焦或焦距的精细调节，也常用于观察标本的不同层次，一般在粗调螺旋调焦的基础上使用。
有些类型的光镜，粗调螺旋和细调螺旋重合在一起安装在镜柱的两侧。
在右侧粗调螺旋的内侧有一窄环，称为粗调松紧调节轮，其功能是调节粗调螺旋的松紧度(向外转偏松．向内转偏紧)。
细胞生物学实验技术
细胞生物学实验技术细胞生物学实验技术是现代生命科学研究中的关键环节，它为研究人员提供了深入了解细胞结构、功能和相互作用的途径。
本文将重点介绍一些常见的细胞生物学实验技术，包括细胞培养、染色技术、分离技术和显微镜观察等。
一、细胞培养技术细胞培养是一项基础性技术，它可以将细胞从体内取出并在适当的培养基中进行增殖和维持。
细胞培养的首要任务是提供适当的培养基，其中含有必需的营养物质、生长因子和适当的温度、湿度和气体条件。
细胞培养技术广泛应用于细胞生物学实验、组织工程、药物研发等领域。
二、染色技术染色技术是细胞生物学实验中常用的方法之一，它使研究者能够对细胞内各种结构和分子进行可视化观察。
常用的染色方法包括荧光染色、酶标染色和核酸染色等。
荧光染色利用荧光标记的抗体或染料，可使特定的细胞结构或分子在显微镜下发出荧光信号，从而观察其位置和表达水平。
酶标染色则通过酶与底物的反应，使细胞或组织显示出颜色等信号。
核酸染色则利用特定染料与细胞核酸结合，以观察DNA或RNA的分布情况。
三、分离技术分离技术在细胞生物学实验中具有重要作用，它可以将不同类型的细胞或细胞组分进行分离和纯化。
常用的分离技术包括细胞离心、流式细胞术和免疫磁珠分离等。
细胞离心是通过离心机将混合细胞悬液分离成上清液和沉淀，从而获得纯化的特定类型细胞。
流式细胞术则通过流式细胞仪测量细胞的大小、形态和表面标记物，从而实现对细胞的高通量分离和分析。
免疫磁珠分离则利用特定抗体结合在磁珠表面，以实现对需要纯化的细胞或细胞组分的选择性捕获。
四、显微镜观察显微镜观察是细胞生物学实验的重要手段，它使研究者能够观察到细胞内不同的结构和过程。
传统光学显微镜可实现对细胞形态和部分细胞器的观察，但其分辨率有限。
近年来，随着超分辨显微镜技术的发展，研究者们能够突破传统光学显微镜的分辨率极限，实现对亚细胞结构和分子过程的观察。
总结细胞生物学实验技术在现代生命科学研究中发挥着至关重要的作用。
细胞生物学实验技术及数据分析
细胞生物学实验技术及数据分析一、细胞培养技术细胞生物学实验技术是现代分子生物学领域的重要组成部分。
这个领域通过细胞培养技术为分子生物学提供了重要的工具。
细胞培养技术是利用体外培养细胞的技术，可以提供可重复的、标准化的实验条件。
细胞培养技术一般采用细胞培养基和纳米级的培养容器，用来提供细胞生长所需的营养物质和细胞环境。
在细胞培养中，一个最基本的需要就是完美的培养基。
培养基的种类很多，质量的好坏和细胞种类及培养条件的适宜度密切相关。
培养基中的活性成分和组分种类不同，可以适应不同的细胞和生长条件。
培养基中含有的营养物质包括必需氨基酸、糖类、维生素、核苷酸和矿物质离子等。
其中，必需氨基酸和糖类是最重要的成分，用于细胞的生长和代谢。
培养基中的血清组分也可以提供生长所需的因子和细胞生长所必需的支持。
此外，多肽激素和其他生长因子也是细胞培养中的重要组分。
在细胞培养中，要注意许多细节，如细胞的操作要求无菌操作、要做好细胞与培养基接触的温度千万不要过高或太低，否则会导致死亡。
二、细胞功能实验技术细胞功能实验技术是研究细胞内生化、分子和细胞生理学机制的有效工具。
分子生物学技术的出现，为分析的细胞和分子生物学提供了许多新的实验方法。
这些方法包括酶联免疫吸附实验、西方印迹法、凝胶迁移、免疫共沉淀和染色质免疫沉淀等。
酶联免疫吸附实验（ELISA）是识别蛋白质和其他大分子的一种常用实验技术。
它是利用通过固相吸附和酶标记抗体将蛋白质分离出来并进行定量分析的技术。
酶联免疫吸附实验可以检测单个蛋白质，还可以用于了解其在生物系统中的数量和分布。
这种技术广泛用于癌症、自身免疫性疾病、感染性疾病和代谢性疾病的检测。
西方印迹法（Western blot）是一种可以用来检测蛋白质的酶联免疫吸附实验（ELISA）的高分辨率技术。
该技术可以检测单个蛋白质，并通过分子量分析确定其大小。
这种技术可以用来确定细胞内蛋白质量和分布，并用于分析蛋白质亚型。
细胞生物学的基本实验技术和方法
细胞生物学的基本实验技术和方法细胞生物学是现代生命科学的一个重要分支，研究细胞的结构、功能、遗传和分子机制，对于理解生命的本质、疾病的发生和治疗具有重大意义。
本文将介绍一些细胞生物学的基本实验技术和方法，包括细胞培养、荧光显微镜、免疫染色、蛋白质电泳和PCR等。
一、细胞培养细胞培养是细胞生物学中最基本的实验技术之一，它是将细胞放入含有营养物质、生长因子和抗生素等的培养基中，使其在适当温度、湿度和CO2浓度下生长、增殖、分化或转化的过程。
细胞培养的方法非常丰富，可以根据细胞来源、类型、培养条件等进行分类，常用的有原代培养、细胞系、肿瘤细胞和原生动物等。
细胞培养可以用于研究细胞形态、生长特性、细胞周期、信号转导和基因调控等方面，也是制备疫苗、生产蛋白质和细胞治疗等方面的基础技术。
二、荧光显微镜荧光显微镜是一种利用荧光探针和激光光源来照射样品并检测荧光信号的显微镜，在细胞生物学中起着至关重要的作用。
荧光探针可以有机会或无机盐的形式存在，它们可以与细胞的生物分子如蛋白质、核酸等结合并发生光学反应，发射出荧光信号。
荧光显微镜具有高分辨率、高灵敏度、多重标记和实时成像等优点，可以用于研究细胞形态、结构、功能、互作和代谢等方面，还可以用于细胞追踪、基因表达、蛋白质定位和药物筛选等方面。
三、免疫染色免疫染色是一种利用抗体与特定抗原相结合来检测或定位生物分子的技术，在细胞生物学和免疫学中广泛应用。
抗体是由 B 细胞产生的一类蛋白质，它可以通过特异性与异物（如细胞表面抗原、蛋白质、核酸等）结合，从而实现对它们的检测和定位。
免疫染色有直接和间接两种方法，前者是将荧光染料或酶标记直接连接在一级抗体上，后者是将荧光染料或酶标记连接到二级抗体上，再与一级抗体结合来增强信号。
免疫染色可以用于鉴定细胞类型、检测蛋白质表达、定位细胞器、分析信号通路和检测抗体反应等方面。
四、蛋白质电泳蛋白质电泳是一种利用电场和凝胶电泳技术来分离和检测蛋白质的方法，在细胞生物学和生物化学中起着重要作用。
细胞生物学的基本实验技术与方法
细胞生物学的基本实验技术与方法细胞生物学是研究细胞结构、功能和生理过程的学科，其基本实验技术和方法包括细胞培养、染色技术、细胞分离和融合等，下面就这些方面做一番讨论。
一、细胞培养技术细胞培养技术是细胞生物学中最基本的实验技术之一，它是将细胞体外培养至其生命活动与分裂能力维持在一定水平的过程。
细胞培养技术是研究细胞的基础，通过细胞培养可以制备各种细胞株用于药物筛选、基因工程和细胞学研究。
细胞培养主要分为两种类型：原代细胞培养和细胞系培养。
原代细胞培养是指从组织中分离出来的细胞培养后获得的第一代细胞，由于细胞数量有限，因此无法长期持续培养。
细胞系培养是在原代细胞培养基础上，经过多次细胞传代培养，形成细胞线的过程，可以持续生长和分裂，在细胞学研究中应用广泛。
细胞培养技术要点包括细胞分离、细胞培养基与培养条件的选择以及细胞传代。
细胞分离使用酶消化或机械分离等，分离出单个的细胞形成单个细胞的培养；培养基的选择和配方不同，应根据细胞类型进行选择；培养条件包括温度、湿度、氧气、二氧化碳、营养物质等，每种细胞对应的条件不同；细胞传代是细胞培养的常规操作，通过细胞传代可以扩增细胞数量，但也会导致细胞衰老和突变，因此传代次数要控制在合适范围内。
二、染色技术细胞染色技术是通过化学物质在细胞内染色，以便于观察细胞形态、结构和基因特征等。
细胞染色技术包括常规染色和特殊染色两种。
常见的常规染色有细胞核染色和细胞质染色。
细胞核染色通常使用吉姆萨染色（Giemsa staining），该染色剂能染色DNA和RNA，通过染色后细胞核变为紫色，胞质呈现蓝色。
细胞质染色包括常用的Wright染色、Leishman染色和Methylene Blue染色等。
特殊染色包括荧光染色和银染色等，用于研究细胞特定分子或亚细胞结构。
荧光染色是一种广泛应用于现代细胞学研究的技术，使用特殊的荧光染料或抗体，可以染色出蛋白、核酸和其他分子等。
银染色则主要应用于突触、核仁和分泌颗粒等亚细胞结构的研究。
细胞生物学的实验方法与技巧
细胞生物学的实验方法与技巧细胞生物学是研究细胞结构和功能的科学领域。
在细胞生物学中，实验方法和技巧是非常关键的。
细胞生物学的实验技术涉及到多种技术和方法，包括细胞培养、细胞分离、荧光显微镜、分子生物学等等。
在本文中，我们将会详细讨论细胞生物学中的实验方法和技巧。
一、细胞培养技术细胞培养技术是研究细胞生长、增殖、衰老等生理状态的一种重要的实验技术。
细胞培养技术通常需要使用一个适宜的培养基，该培养基还需要添加适当的营养物质和培养物质。
在培养细胞时，需要注意适宜的温度、湿度、和二氧化碳含量等因素，这些因素可以影响细胞的状态和生命活动。
另外，在细胞培养中，不可避免地会遇到一些问题，例如细胞的寿命、细胞的死亡、菌污染等问题。
为避免这些问题，需要在实验中采取一些必要的预防措施。
例如，可以使用无菌操作技术，采用CDMF等杀菌剂消毒培养器、培养器中的培养物料，这样可以有效防止细胞因菌污染而死亡。
二、细胞分离技术细胞分离技术是研究细胞的单个特性、形态和功能的一种技术。
在实验中需要利用细胞分离技术来获得一定数量的单个细胞。
细胞分离技术有多种方法，包括分离器分离、离心分离、胶体分离和酶消化等，每种方法都有其优缺点。
其中，酶消化是一种比较常见的细胞分离方法，通过加入一定量的酶，将组织内的胶原纤维、纤维素及其他基质物质消化掉，从而获得单个细胞。
在酶消化实验中，需要根据不同细胞类型、不同组织、不同生长状态等因素进行调整，以获得最佳效果。
三、荧光显微镜技术荧光显微镜技术是一种广泛用于生物学和生命科学中的高级显微镜技术。
在细胞生物学研究中，荧光显微镜技术是最常用的技术之一，因为它可以用来标记和检测细胞内的各种生物大分子，如蛋白质、核酸、酶等。
在荧光显微镜实验中，使用的荧光探针要与待检测的细胞相匹配，例如，使用荧光染料DPH来探测细胞内外膜分子的相互作用。
同时，还需注意荧光显微镜的光源选择、荧光图像的采集和分析等问题，以获得高质量的研究数据。
细胞生物学实验方法与技术
细胞生物学实验方法与技术1. 光镜观察（Light Microscopy）光镜观察是一种常用的研究细胞形态和结构的方法。
通过使用光学显微镜，可以观察到细胞的外形、细胞器的位置和结构等特征。
该技术使用涂片制备技术，将细胞固定、染色、封装在玻璃片上，然后在显微镜下进行观察。
2. 电镜（Electron Microscopy）电镜是一种高分辨率的显微镜技术，它可以观察到细胞的微观结构和细胞器。
电镜利用电子束来代替光束，通过变焦电镜透射电子显微镜和扫描电子显微镜两种类型，可以观察到更高分辨率的细胞结构。
3. 组织培养（Tissue Culture）组织培养是一种将细胞或组织从活体中分离并培养在人造环境中的方法。
这种方法常用于研究细胞生长、增殖和发育过程。
组织培养可以通过使用培养基、细胞培养皿和细胞培养箱等设备来提供细胞所需的营养和环境。
4. 免疫染色（Immunostaining）免疫染色是一种用来检测和定位蛋白质或其他分子在细胞中的位置的方法。
这种方法利用抗体的特异性结合来检测蛋白质的位置。
首先，细胞固定并渗透，然后使用特定的抗体与目标分子结合，最后通过荧光标记或酶反应等方法来观察染色的细胞。
5. 荧光显微镜（Fluorescence Microscopy）荧光显微镜是利用荧光探针来观察样品的显微镜技术。
该技术可以用来检测和可视化特定分子或结构的位置和数量。
通过对样品进行荧光染色或利用荧光蛋白表达来标记细胞的特定结构或分子，可以在荧光显微镜下直接观察到。
6. 流式细胞术（Flow Cytometry）流式细胞术是一种高通量细胞分析技术，可以快速准确地分析和计数大量的单个细胞。
该技术利用细胞标记剂和流动性流式细胞术仪器，通过激光照射细胞并检测细胞的荧光光谱，可以分析细胞表面分子的表达、细胞大小和复杂性等信息。
细胞生物学实验报告
细胞生物学实验报告实验名称：细胞培养实验实验目的：1. 了解细胞培养的基本原理和过程2. 观察细胞生长和分化的现象3. 掌握细胞培养的实验技术和方法实验原理：细胞培养是一种将生物体细胞从其原始生存环境中分离出来，在体外条件下进行培养的技术。
这种技术对于研究细胞生物学、发育生物学、药物筛选等学科具有重要意义。
本实验将通过观察细胞生长和分化的现象，加深对细胞培养技术的理解。
实验材料：1. 人体皮肤细胞2. 培养基（包含血清、抗生素、氨基酸、维生素等）3. 塑料瓶（培养皿）4. 显微镜5. 记录表实验步骤：1. 取适量人体皮肤细胞，用胰蛋白酶消化，使其从组织中分离出来。
2. 将细胞接种到塑料瓶（培养皿）中，加入适当浓度的培养基。
3. 将塑料瓶（培养皿）放入恒温培养箱中，定期观察并记录细胞生长和分化的现象。
4. 在合适的时间点，使用显微镜拍照记录细胞生长和分化的过程。
5. 实验结束后，整理数据和图片，撰写实验报告。
实验结果：经过一段时间的培养，我们观察到皮肤细胞在培养基中开始贴壁，并逐渐生长。
随着时间的推移，部分细胞开始出现分裂，形成相互连接的细胞团。
一些细胞逐渐伸展成梭形或扁平形，呈现出典型的贴壁生长形态。
在某些区域，我们观察到细胞开始分化为两种不同形态的细胞群，一种呈圆形或椭圆形，另一种呈多角形。
这些现象表明细胞已经开始分化。
实验分析：根据实验结果，我们可以得出以下结论：1. 细胞确实可以在体外条件下贴壁生长并增殖。
这证明了细胞培养技术的可行性。
2. 细胞分化是一个自然的过程，在本实验中得到了证实。
这说明细胞具有自我更新和多向分化的潜能。
3. 实验过程中需要注意无菌操作和适宜的培养条件，以确保细胞的存活和正常生长。
此外，不同种类的细胞可能需要不同的培养条件，因此在实际操作中需要针对具体细胞类型进行实验。
实验结论：通过本次实验，我们了解了细胞培养的基本原理和过程，观察了细胞生长和分化的现象，并掌握了细胞培养的实验技术和方法。
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(三)电泳法
主要用于分离蛋白质、核酸 1.琼脂糖凝胶电泳 分离对象:核酸 支持介质:琼脂糖
凝固点 40-45℃ 不同浓度凝胶具有不同孔径
电泳缓冲液:TAE\TBE 染料:溴化乙锭 EB
(三)电泳法
主要用于分离蛋白质、核酸 1.琼脂糖凝胶电泳 分离对象:核酸 支持介质:琼脂糖
凝固点 40-45℃ 不同浓度凝胶具有不同孔径
五、细胞内分子的示踪技术
用一定的方法显示细胞中的分子,并对其 在细胞内的代谢过程进行追踪. (一)同位素示踪技术
1.原理
同位素: 核外电子数相同 化学性质相同 原子核重量不同
放射性同位素:衰变
2.应用 (1)条件 可检测、可摄入 (2)方法 放射自显影（autoradiography）
蛋白质 - aa DNA - T RNA - U
（RNA induced silencing complex） （降解）
(2)速度沉降法 分离对象:不同大小、形状的组分(沉降系数S) 比差速离心方法更精细 具体方法: 在离心管中予装5%-20%蔗糖梯度的离心介质
(3)平衡沉降法 分离对象:密度不同的组分（与大小、形状无关） 具体方法：在离心管中予装一定密度梯度的离 心介质（20%-70%蔗糖、CsCl） 通常采用超速离心
四、细胞组分的分级分离
通过逐级分离对细胞内细胞器和各种成分的
化学性质和功能进行研究的方法。
匀浆
分级分离 分析
细胞
低渗 超声 破坏 去污剂 强制过滤 研磨
匀浆液膜Βιβλιοθήκη 细胞器 大分子（一）离心法
用于分离细胞器和大分子
(1)差速离心法
分离对象:不同大小和形状的组分
（细胞核、细胞器）
具体方法:由低速到高速逐级沉降 (repeat)
2.核酸分子杂交
DNA DNA RNA DNA RNA RNA
特异性探针
(1) Southern blotting – DNA
将凝胶分离的DNA转移到固相支持膜上,然后与存
在于液相中的标记探针进行杂交,以检测特定DNA序
列的技术.
(2) Northern blotting – RNA
A B C D
SDS-PAGE
3.双向电泳
根据蛋白质分子量、等电点分离 等电聚焦: 等电点 SDS: 分子量
4.Western 印迹技术
将经聚丙稀酰胺凝胶分离的蛋白带转移至硝酸
纤维素膜,然后将膜与特异性抗体作用,膜上特定 蛋白条带将与抗体结合,并进一步与酶标记二抗 或生物素标记二抗反应,最终以发色底物显色而 被检测. 基本步骤: (1)SDS-PAGE (2)转膜 (3)抗体反应 一抗孵育 标记二抗孵育 (4)显色
基因组DNA的消化 琼脂糖凝胶电泳分离 转膜
杂交 E 放射自显影
(3) 原位杂交技术（in situ hybridization）
用核酸探针与细菌、细胞或组织切片中的核酸进 行杂交，以检测特定核酸分子在细胞内原有位置 的方法。
FISH
3.基因转移技术 应用物理、化学或生物学等技术和方法将外源 基因转移到受体菌或细胞内，并使其在细胞内实 现转入基因的扩增或表达。
原代培养 传代
传代培养(保持分化特性)
3.细胞系（Cell line）
在细胞培养中，偶然情况下产生的具有无限繁 殖能力，能够无限传代的细胞群。 变异细胞
无限繁殖
细胞系
HeLa 人宫颈癌上皮细胞 3T3 小鼠成纤维细胞
4.细胞融合（Cell fusion）
（1）定义 在自然或人工条件下，使二个或二个以上 细胞合并形成一个细胞的过程。
外源基因
载体
细菌
真核细胞
转化
转染
基因扩增 蛋白质表达
(1)限制性核酸内切酶
限制性内切酶：识别DNA分子内
由4～8个碱基构成的特定序列
的酶，这些酶的识别位点大多
是“回文”序列。
粘性末端
平滑末端
(2) 质粒载体克隆
(3) 克隆基因的表达 在细菌中的表达
在动物细胞中的表达
4.抑制基因表达技术
研究基因功能及调控 疾病的防治
反义核酸技术
根据碱基互补配对原理,利用人工或生物合成特 异互补的DNA或RNA片断,抑制或封闭基因表达的 技术. 作用方式 直接导入 载体转染
RNA干扰技术
将与mRNA对应的正义RNA和反义RNA组成的双链 RNA导入细胞，使mRNA发生特异性的降解，导致其 相应的基因沉默。 起始阶段： 双链RNA导入细胞 Dicer siRNA (21-23) （short interfering RNAs） 效应阶段： ATP RNA诱导沉默复合物 RISC 解链 结合mRNA
电泳缓冲液:TAE\TBE 染料:溴化乙锭 EB
2.SDS-PAGE 分离对象:蛋白质(蛋白质分子量、亚单位组成) 样品处理: SDS 阴离子表面活性剂 β- 巯基乙醇 还原剂 大小 电荷 形状 支持介质: 丙稀酰胺 甲叉双丙稀酰胺 染色: 考马斯亮蓝 银染 特异性蛋白 (western blotting)
细胞生物学实验技术（二）
(3)无菌 无菌操作：超净工作台、火焰消毒等 培养液中加入抗菌素 器械、溶液消毒（烤箱、高压灭菌、过滤）
(4)其他
温度 37℃ 湿度 100% CO2浓度 5%
2.细胞培养的传代
原代培养:直接取材于有机体的细胞培养 取材 切割 消化 培养 传代培养:将原代培养存活的细胞从培养瓶中 取出，以1:2以上的比例扩大培养
A B C D
放射性物质脉冲掺入活细胞 不同时间取样切片 暗处曝光 显影、定影
(二) 抗体示踪技术 1.单克隆抗体（monoclonal antibody）
B淋巴细胞 肿瘤细胞
2.抗体 + 荧光染料
LM
3. 抗体 + 电子致密物
EM
六、细胞分子生物学技术
1.聚合酶链式反应
（ polymerase chain reaction，PCR）
分裂
异核体
杂交细胞
（2）促融方法 生物学方法：仙台病毒 化学方法：PEG 物理方法：电脉冲打孔仪 （3）应用 A 细胞核和细胞质 间的相互作用 B 膜蛋白的流动性
C 基因定位
Mouse cell
Human cell
division
D 单克隆抗体制备
B 淋巴细胞 肿瘤细胞
E 细胞周期相关因子的发现
（二）层析法（柱层析） 主要用于分离、纯化蛋白质
填充柱
填料（固定相）
流动相
1.离子交换层析 层析介质:阴离子或阳离子树脂 分离原理:电荷
2.凝胶过滤层析 层析介质:凝胶 分离原理:分子大小
3.亲和层析 层析介质: 基质 + 抗体 底物 分离原理: 亲和性
4.高压液相层析 HPLC 基质粒度小（3-10μ m）、分辨率高、 分离速度快
western blotting
5.质谱技术
通过测定样品（分子被电离汽化）离子的 质/荷比来进行成分和结构分析的方法 蛋白质质量 生物大分子的相互作用 2002年诺贝尔化学奖获得者
电喷雾电离 electrospray ionization 软激光解吸电离 soft laser desorption
特异性体外DNA扩增技术 利用针对目的基因所设计的一对 特异寡核苷酸引物，以目的基因 为模板，以dNTP为原料，在DNA聚 合酶作用下进行的DNA体外合成技 术。
（1）反应体系：模板链
DNA 聚合酶 dNTP 引物 （primer） （与模板相应序列互补）
（2）反应步骤：
变性 退火 延伸 94℃ 55℃ 72℃