【CN109938870A】一种大鼠重症脑出血合并脓毒症复合模型的建立方法及其应用【专利】
线栓法制备大鼠局灶性脑缺血再灌注模型的手术操作
线栓法制备大鼠局灶性脑缺血再灌注模型的手术操作线栓法制备大鼠局灶性脑缺血再灌注模型的手术操作1 切口位置的选择恰当切口位置的选择,可以使血管暴露充分,有利操作,节约手术时间,减少对动物的刺激,提高术后生存率。
目前国内外学者[ 1 ,2 ]多采用颈部正中切口,国内一些学者[ 3 ,4 ] 经改良后采用颈部旁侧手术入路。
我们在操作中发现,采用颈部旁侧切口不用切开颈阔肌,出血少,便于肌肉分离,手术视野暴露较好,颈内外动脉及其分支的分离易于进行,尤其是分离深在鼓泡处的颈内动脉( ICA) 分支翼腭动脉( PPA) ,如果采用颈部正中切口由于距切口处远而难以分离另外颈部旁侧入口对气管刺激性小,呼吸道分泌物少, 不易出现呼吸道分泌物过多和气管痉挛,手术大鼠病死率低。
我们体会采用颈部旁侧手术入路应注意几点,一是中间稍偏015 cm 即可,切口线正好在颈阔肌和胸锁乳突肌夹隙上方,如果太靠外侧会给分离肌肉带来难度;二是用手术刀切开皮肤时不宜用力太猛,颈侧部静脉血管丰富,切入太深容易引起出血,给手术操作带来一定难度,以刚刚切开皮肤为度,并且切口从上到下稍微斜向内侧,并且切口尽量靠上一些,有利于分离颈外动脉。
2 寻找血管的方法大鼠颈总动脉(CCA) 位于颈阔肌和胸锁乳突肌之间,上升至甲状腺水平高度分出颈内动脉ICA 和颈外动脉( ECA) 。
ECA 在下颌角平面以下分出枕动脉、甲状腺上动脉、咽升动脉、腭升动脉和上颌外侧动脉,在耳下方分出终末支即耳后动脉、颞浅动脉和舌动脉。
ICA 在鼓泡和枕骨之间入颅,在鼓泡内侧发出颅外分支PPA(相当于人类上颌动脉) ,主干继续沿鼓室内侧延伸,进入鼓室与枕骨基板之间的后破裂孔进入颅腔。
选择旁侧手术入路,切开皮肤暴露组织后,用止血钳钝性分离表层软组织和脂肪组织,然后用止血钳插入颈阔肌和胸锁乳突肌之间,并分离之,用镊子翻开颈阔肌即可看到CCA ,仔细向远心端分离出颈内外动脉的分叉处, 朝上走行的是ECA ,朝下内方走行的是ICA ,继续沿ICA 分离,位于鼓泡的后缘可分离出PPA。
脓毒症相关性脑病大鼠动物模型的建立
脓毒症相关性脑病大鼠动物模型的建立脓毒症相关性脑病在脓毒症患者是一种常见并发症，合并脓毒症相关性脑病者病死率明显增加。
目前临床对于脓毒症相关性脑病仍是排除性诊断，缺乏客观的诊断指标，如生化指标、影像学指标、电生理学指标等，导致流行病学及发生机制均不明确，因此确立相对客观统一的诊断标准势在必行。
动物模型的选择建立对其机制及治疗方法研究具有重要意义。
研究人员应用脑电图和诱发电位监测早期诊断脓毒症相关性脑病，取得一定效果，但尚未形成统一结论。
本研究根据已有脓毒症相关性脑病模型研究的进展，选用盲肠结扎法（CLP）建立脓毒症模型，通过监测大鼠神经行为学改变、脑电图信号及体感诱发电位改变来早期诊断脓毒症相关性脑病，并对所建立的大鼠脓毒症脑病模型进行分析，为以后的研究提供参考。
1 材料与方法1.1 实验动物清洁级成年雄性SD大鼠30只，体质量200～250 g，由中南大学动物学部提供。
1.2 主要药品、试剂、仪器PBS购自鼎国生物工程公司，水合氯醛为中南大学湘雅医院药剂科化学分析室配制；多聚甲醛购置岳麓区鼎盛实验器材公司；戊二醛、无水乙醇、二甲苯、苏木素、伊红、锇酸等由中南大学病理教研室提供。
套管针购置BD公司。
脑立体定位仪，RM6240生物信号记录器，Olympus BX41型光学显微镜（日本），LKB-Ⅲ型超薄切片机（瑞典），H-7500型透射电镜（日本），石腊切片机（美国），生化培养箱（广东），格兰士微波炉WP700，隔水式电热恒温培养箱（上海跃进医疗器械厂），荣事达家用冷藏冰箱BCD-202，MIAS医用图像分析管理系统电子摄像。
1.3 实验方法1.3.1 大鼠脑电及诱发电位监测电极放置30只大鼠称质量、编号分别在造模前10 d放置脑电监测电极。
水合氯醛腹腔注射麻醉后，大鼠头部用立体定位仪固定，常规外科消毒，在头颅中间矢状位作3 cm的皮肤切口，将前囟点和其他颅骨缝暴露。
在颅骨面行局麻（10%利多卡因喷雾），移去骨膜。
一种大鼠蛛网膜下腔出血动物模型的建立
一种大鼠蛛网膜下腔出血动物模型的建立【摘要】目的：建立一种成年大鼠蛛网膜下腔出血（SAH）模型。
方法：使用立体定位仪在显微操作下行枕大池两次注射静脉血建立大鼠SAH模型。
术后第一天，4%多聚甲醛灌注后取脑。
脑组织用异戊烷－液氮快速冰冻并－80℃低温保存，行冰冻切片。
MASSON染色观察蛛网膜下腔。
结果：（1）动物模型实验成功率为83.33%；（2）MASSON染色显示脑膜的结构保存良好，蛛网膜下腔有大量的血细胞。
结论：此实验为研究SAH提供了较好的动物模型。
【关键词】蛛网膜下腔出血；蛛网膜下腔纤维化；柔脑膜；MASSON染色蛛网膜下腔出血（subarachnoid hemorrhage SAH）是一种常见综合征，不仅可引起血管痉挛[1]，而且还可以引起蛛网膜下腔纤维化，甚至导致慢性脑积水的发生[2]，但机制尚不十分清楚，目前相关研究较少。
柔脑膜是蛛网膜和软脑膜的合称，两者之间隔以蛛网膜下腔并以小梁相联系[3]。
本研究成功地建立了一种成年大鼠SAH模型，为进一步研究SAH提供了较好的动物模型，现报道如下。
1 材料与方法1.1 实验动物：18只SD雄性成年大鼠，体重（200±10）g（由中南大学湘雅医学院动物部提供）。
1.2 主要试剂与仪器：Masson三色盒（珠海贝索生物技术有限公司），异戊烷（国药集团化学试剂有限公司提供），液氮、甲基纤维素（中南大学湘雅三医院病理科提供），手术显微镜及显微手术器械（上海医用光学仪器厂），脑立体定位仪（Narishge，Japan）1.3 方法1.3.1 动物模型的制作：术前禁食24 h，自来水饲养。
用10%水合氯醛300mg/kg经右侧腹腔注射麻醉后，头颈部备皮及左侧腹股沟区备皮。
仰卧位常规消毒铺巾，切开左侧腹股沟区皮肤，找到左侧股静脉并置管备用；取俯卧位使用立体定位仪固定大鼠，颈部稍屈。
常规消毒铺巾，参照Konczalla方法[4]，在显微镜下沿头颈部交界处作一长约3~4 mm的纵切口，暴露环枕筋膜，先用0.45号注射针头（针尖需较钝）固定在立体定位仪纵臂上，垂直穿刺枕大池，抽出清亮脑脊液0.1 ml后，从原股静脉置管处抽0.2 ml新鲜血缓慢注入枕大池，注射完后留针5 min，拔针后用医用耳脑胶封闭针眼，缝合切口。
内毒素诱导大鼠建立脓毒症脑损伤模型
剂量 ， 进一 步建立 脓毒 症脑 损伤 模 型 ， 从 而为 Ｓ Ａ Ｅ的 防治提供新 的方法和思路 。
死亡率高达 ４ ０ ％ 。脓毒症脑病 （ ｓ ｅ ｐ ｓ ｉ ｓ ａ ｓ ｓ ｏ ｃ ｉ ａ ｔ ｅ ｄ ｅ ｎ — ｃ ｅ ｐ ｈ ａ ｌ ｏ ｐ— ａ ｔ ｈ ｙ ， Ｓ Ａ Ｅ ） 是脓毒症 常见 的并 发症 ， 是指 缺 乏 中枢神 经系统感 染 的临床 或实验 室证 据 ， 由全 身炎 性反应 引起 的弥散性脑功能障碍 。脓毒症并发脑 病 者病死率显著高于无脑病者 。其发病机制 目前 尚未
组 大 鼠死 亡 率 为 ６ ０ ％， ４ ０ ｍ ｇ ／ ｋ ｇ 组 大鼠 ２ ４ ｈ全 部 死 亡 。各 组 大 鼠造 模 ２ ４ ｈ后 白细 胞 均 减 少 ５ ０ ％ 以上 ， 与 对 照 组 比较 ， 造模 ２ ４ ｈ后 各 模 型 组 大 鼠体 内 Ｔ Ｎ Ｆ一仪和 Ｉ Ｌ一 ６显 著 上升 ， 脑 组 织 出现 一 定 程 度 损 伤 。 结 论 以 腹 腔 注射
率， 另ｌ ０只观 察造模 前及 造模 后 ２ ４ ｈ精 神状 态 的变 化， 以及 造模 ２ ４ ｈ后取血 和脑组织 进行检 测 。实验前 禁食不禁水 １ ２ ｈ ， 取Ｌ Ｐ Ｓ适 量加 生理盐水 溶解 至所需
浓度 ， 大 鼠按 ５ ｍ Ｌ ／ ｋ ｇ 体重腹腔注射 Ｌ Ｐ Ｓ造模 ， 空 白对
明确 ， 亦无特效治疗 。脓毒症动物模 型是研究脓 毒症 、
照组腹 腔注射 等剂量 的生理盐水 。
脓毒血症大鼠模型建立
CLP致脓毒血症大鼠模型建立一、实验目的利用CLP技术建立脓毒血症大鼠模型二、实验原理脓毒血症患者最常见的感染源来自腹腔且易造成腹腔感染，所以腹腔感染模型是目前最常见的动物模型。
鼠类盲肠结扎穿刺（CLP）是临床研究脓毒血症常见模型，是模仿腹腔脓毒血症感染的临床过程，引起多菌群感染，最终导致脓毒血症。
三、实验材料和设备成熟期雄性Sprague-Dawley大鼠，体重400-500g。
外科手术器械：手术台，手术刀，刀片，剪刀，刮毛器，镊子，止血钳，持针器，缝皮针，1号线，4号肠线，18g针头，血管夹，医用胶布，PE50导管（厂家），探针，硬膜外穿刺针，肝素帽，留置针，注射器（规格）。
实验药品：1.5%戊巴比妥钠，2%利多卡因，丁苯诺啡，75%酒精，碘伏，肝素钠（10000U），蒸馏水，生理盐水。
四、实验方法和步骤1.购买SD大鼠，适应性饲养1周，自由饮水，饮食；2.术前禁食12小时；3.称重以1.5%戊巴比妥钠40mg/kg（4%水合氯醛 0.1ml/10g抽取麻药，一般3-5分钟起效，可以维持1小时左右。
），腹腔注射（先将动物固定,腹部用酒精棉球擦试消毒，然后在左或右侧腹部将针头刺入皮下，沿皮下向前推进约0.5厘米，再使针头与皮肤呈45 度角方向穿过腹肌刺入腹腔，此时有落空感，回抽无肠液、尿液后，缓缓推入药液。
），麻醉大鼠，止血钳夹小鼠脚趾确定麻醉深度；4.将大鼠背位固定于手术台上，剪去颈部和腹部被毛；5.取血导管的制备：取PE50导管约15cm，一侧剪契口，另一端平口，对楔面要进行简单打磨处理,以防表面粗糙划破血管外壁。
抗凝处理是将导管用装满肝素钠的注射器灌流、冲洗,保证导管每个部位都充分接触肝素钠。
6.颈静脉置管术：a.用碘伏常规消毒颈部，铺无菌手术单。
b.于胸锁乳突肌连线中点起向颈部垂直延伸15mm,做皮肤切口约1.5cm，暴露皮下结缔组织，用血管钳逐层钝性分离至显露颈静脉(特征是在胸廓入口处，有轻微搏动，直径2～4 mm)，2%利多卡因3-5滴局部浸润1min，完全游离一段长1-1.5cm血管，血管夹分别夹闭远心端和近心端，血管下穿过两根1号线。
线栓法大鼠脑缺血再灌注模型(MCAO)制备方法
线栓法大鼠脑缺血再灌注模型制备前言相信不少神经内科的研究生都作过或将要作大鼠线栓模型，都有一个从查文献了解方法到跟师兄、师姐学习再到自己体会摸索直至熟练的过程，在模型制作的过程中可能的经历了从模型不成功的郁闷到熟练后成功的喜悦（我们是有这样的感觉）。
为了缩短各位将要作或刚开始作MCAO模型的战友的摸索过程，提高模型制作的成功率，我们愿意将自己的经验与大家分享，相信各位战友看过后将对制作大鼠线栓模型有更深的认识，并以其为乐趣，同时欢迎各位熟练的战友与我们交流经验。
第一部分线栓模型制备理论及经验⒈ 插线法局灶性脑缺血模型简介八十年代 Koizumi 和 Longa 创用了不开颅的大鼠 MCA 可逆性脑梗塞模型，此后，应用插线法制备大鼠局灶性脑缺血再灌注模型的方法不断改进和完善，已渐趋成熟，目前该法已逐渐取代开颅法而成为最流行的方法。
该模型先阻断颈外动脉（ECA）及其分支，且阻断翼腭动脉（PPA），以切断颅外来源的侧副循环血流。
从 ECA 插入尼龙线，经颈内动脉（ICA）到大脑前动脉（ACA），机械性阻断大脑中动脉（MCA）发出处的血供来建立大脑中动脉缺血模型。
此模型可在无麻醉状态下拔出尼龙线，恢复血流，实现再灌注。
1994 年 Huang 等[55]首次将线栓技术应用于小鼠局部永久性脑缺血模型。
1997 年 Hara等[56]将线栓技术改进后应用于小鼠局部暂时性脑缺血模型。
此后不断有学者借助于显微技术和多功能生理监测手段建立小鼠局部线栓脑缺血模型[57,58]。
国内蒋晓帆等[59]，王芙蓉等[60]也对该方法进行了研究。
线栓法具有不开颅、效果肯定、可准确控制缺血及再灌注时间的优点，用于研究神经元对缺血的敏感性、耐受性，药物疗效观察以及再灌注损害和治疗时间窗较为理想，同时也具有对全身影响小、动物存活时间长的特点，适于慢性脑损伤的研究。
控制好易变因素，可避免实验结果的不稳定性。
但线栓造模也并非完美无缺，存在着下列不足：①线栓造模过程是非直视下的手术，血流是否完全阻断不能即刻得知。
一种脓毒血症伴多器官功能障碍综合征大鼠模型构建方法[发明专利]
![一种脓毒血症伴多器官功能障碍综合征大鼠模型构建方法[发明专利]](https://img.taocdn.com/s3/m/49be42c5e2bd960591c6773f.png)
专利名称：一种脓毒血症伴多器官功能障碍综合征大鼠模型构建方法
专利类型：发明专利
发明人：修光辉,李秀玲,凌斌,孙洁,刘萍,陈献忠,邓琼芳
申请号：CN202011357940.8
申请日：20201127
公开号：CN112402442A
公开日：
20210226
专利内容由知识产权出版社提供
摘要：本发明公开一种脓毒血症伴多器官功能障碍综合征大鼠模型构建方法，本发明所述方法为：将脂多糖配制成相应浓度，对大鼠进行脂多糖静脉注射，按住大鼠，保持仰卧位，后肢内侧暴露向上，轻轻拔掉左后肢毛发，酒精棉球擦拭，按压腹股沟，使股静脉充盈；酒精棉球消毒后，1ml注射器平行缓慢进针，确定针尖在血管内后可推药，推药结束后，用干棉球按压注射点止血；止血完毕后常规饲养，定时观察并记录大鼠状态。
本发明所述方法构建的动物模型脂多糖剂量低，死亡率仅为50％‑70％，是研究脓毒症伴MODS模型的理想方法。
申请人：云南省第二人民医院
地址：650000 云南省昆明市青年路176号
国籍：CN
代理机构：昆明合盛知识产权代理事务所(普通合伙)
代理人：牛林涛
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脓毒血症大鼠模型建立及对P38MAPK和GLUT4转位通路的影响
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ｃａｌ ｏｕｔｃｏｍｅｓ ａ ｆｔｅｒ ｓｏｆｔ－ｔｉｓｓｕｅ ｒｅｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｃｏｍｐｌｅｘ ｏｎｃｏｌｏｇｉｃ ｄｅｆｅｃｔｓ
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１１ Ｓａｎｅｉ－Ｍｏｓｈａｄｄａｍ Ａ，Ｓａ ｎ ｅｉ－ｉｏｓｈａｄｄａｍ Ａ，Ｋａｂ ｒｏｂａｅｉ Ｓ．Ｌａｔｅｒａｌ ｓｏｆｔ ｔｉｓ— ｓｕｅ Ｘ —ｒａｙ ｆｏｒ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ ｓｕｓｐｅｃｔｅｄ ｆ ｔｓｈｂｏｎｅ ｉｎ ｏｒｏｐｈａｒｙｎｘ，ａ ｔｈｉｎｇ ｉｎ
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(19)中华人民共和国国家知识产权局
(12)发明专利申请
(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201910214737.6
(22)申请日 2019.03.20
(71)申请人 复旦大学附属华山医院
地址 200040 上海市静安区乌鲁木齐中路
12号
(72)发明人 宫晔 邓水香 朱宏达 冯圣捷
田觅 金朋
(74)专利代理机构 上海申新律师事务所 31272
代理人 俞涤炯
(51)Int.Cl.
A61D 1/00(2006.01)
A61D 7/00(2006.01)
(54)发明名称
一种大鼠重症脑出血合并脓毒症复合模型
的建立方法及其应用
(57)摘要
本发明涉及一种大鼠重症脑出血合并脓毒
症复合模型的建立方法，其包括：大鼠注射麻醉
后，断尾取血匀速注入右侧尾状核，获得脑出血
大鼠模型；脑出血大鼠模型制备成功后，采用盲
肠结扎穿孔法获得重症脑出血合并脓毒症复合
模型。
本发明还涉及上述复合模型在制备预防/
治疗重症脑出血合并脓毒症的药物中的应用。
本
发明成功构建了重症脑出血合并脓毒症复合模
型，更好的模拟临床重症脑出血并发感染以及脓
毒症的临床表现，为进一步探索重症脑出血合并
感染和脓毒症的发病机制和干预措施提供理论
基础；并将其具体应用于治疗重症脑出血+脓毒
症的药物的筛选，对防治重症脑出血合并感染和
脓毒症的发生及后期的康复治疗及预后具有重
要的意义。
权利要求书1页 说明书5页 附图2页CN 109938870 A 2019.06.28
C N 109938870
A
权 利 要 求 书1/1页CN 109938870 A
1.一种大鼠重症脑出血合并脓毒症复合模型的建立方法，其特征在于，包括如下步骤：
步骤一、脑出血大鼠模型的制备；
大鼠注射麻醉后，断尾取血匀速注入右侧尾状核，留置预定时间，缓慢拔针，防止反流，获得脑出血大鼠模型；
步骤二、重症脑出血合并脓毒症模型的制备；
步骤一的脑出血大鼠模型制备成功后，大鼠注射麻醉后仰卧固定，腹部手术区域皮肤杀菌后铺无菌孔巾，沿正中线剪开皮肤、肌肉、腹膜后牵出盲肠，以无菌丝线测量盲肠全长后取该段丝线对折处所对应的盲肠部位以无菌丝线结扎，扎紧前将盲肠内容物向降部挤压，扎紧后用无菌不锈钢针沿结扎远端肠管外侧缘穿刺两孔并将穿刺针来回抽动后退出穿刺针；轻轻挤压结扎盲肠降部，挤出少量粪质后将肠管还纳腹腔，确认腹腔内无活动性出血后以无菌丝线逐层缝合腹壁，获得重症脑出血合并脓毒症复合模型。
2.根据权利要求1所述的建立方法，其特征在于，所述步骤一中，大鼠采用10％水合氯醛320～380mg/kg腹腔注射麻醉，其断尾取血量为50～180ul，其血液注入方法为：2次注入法，先注入一半，留置8～12min后，再注射另一半血量；注入完成后，留置12～18min后拔针。
3.根据权利要求1所述的建立方法，其特征在于，所述步骤一中，所述右侧尾状核的注入位置为：前囟中线旁开2.8～3.2mm，冠状缝前0.8～1.2mm，深度5～7mm。
4.根据权利要求1所述的建立方法，其特征在于，所述步骤一中，在拔针后，采用骨蜡封闭颅骨创口，缝合头皮，局部皮肤用复合碘消毒液消毒，防止局部感染。
5.根据权利要求1所述的建立方法，其特征在于，在脑出血模型制备成功20～28h后制备重症脑出血合并脓毒症复合模型。
6.根据权利要求1所述的建立方法，其特征在于，所述步骤二中，大鼠采用10％水合氯醛腹腔注射麻醉；皮肤杀菌采用安尔碘涂搽；无菌不锈钢针的尺寸为外径2～4mm，其来回抽动的次数为2～5次。
7.根据权利要求1所述的建立方法，其特征在于，所述步骤二中，腹壁缝合完毕后，即刻注射生理盐水15～25毫升/千克体重于大鼠后腿根部皮下。
8.根据权利要求1～7中任一项制备的大鼠重症脑出血合并脓毒症复合模型在制备预防和治疗重症脑出血合并脓毒症的药物中的应用。
2。