基因工程第四章工具酶ppt课件

It removes nucleotide from both strands of DNAleotide only
from the 3’ terminus
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一、限制性内切酶的发现与种类：
1、限制性内切酶的发现： ❖ 20世纪60年代在研究细菌的限制和修饰现象时
❖ 特点：
➢ 识别特定的核苷酸序列，其长度为4--6个碱基，甚至8个， 少数酶识别更长的序列。特定的序列：又叫识别序列或 识别位点。这些序列的一个共同特点是具有双重螺旋对 称的结构形式，可以进行180度的旋转，呈回文结构。
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➢ 限制性内切酶在识别序列后，对双链DNA进行切割，双 链锻裂后，形成特定的酶切末端，叫“粘性末端”。粘 性末端有三种形式： 5”突出粘端：EcoRI切点
❖ 限制与修饰是由两种酶引起的，一种是甲基转移酶，一 种是核酸内切酶。
❖ 核酸有四个碱基，碱基排列有44个排列顺序，内切酶具 有识别位点，他的限制性体现在可以识别这些位点，并 进行切割，这样外源的DNA即使进入生物细胞，也可以 被降解，这就是限制;修饰是由甲基化酶来完成的。在生 物内部有甲基化酶，他们可以催化甲基从给体分子S－酰 苷甲硫氨酸转移给可识别的序列（内切酶），使之甲基 化，这样内切酶无法识别甲基化的序列，就不能进行切 割，从而保全了自身的DNA。
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❖ 消除办法：
尽量保证DNA纯度达到最大。酚抽提去蛋白；醇抽提 （氯仿、异戊醇的抽提）去酚，去多糖；乙醇抽提去多 元醇；沉淀（蛋白也沉，但DNA和蛋白能看的出来）； 干燥去乙醇。
增加酶的用量，平均每ug底物DNA的用量可达10个单 位或更多。但有一个问题：商品化的酶均加入50％的甘 油作为保护剂，在－20度保藏不会结冻。如果加入酶量 过大，甘油浓度过高，会抑制酶活性。
互相排斥
Ⅰ型、Ⅲ型在同一蛋白分子中兼有内切和甲基化活性并且其依赖ATP， 作用时吸收能量。
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❖ Ⅱ型：其内切酶活性和甲基化活性是分开的， 只负责限制，因此叫限制性内切酶。修饰由独 立的甲基酶完成。 而且核酸内切作用具有序 列的特异性，可识别回文序列，－AGCT-，便 于操作，广泛应用。
5---G AATTC---3
3---CTTAA G---5 3”突出粘端：PstI切割位点
5---CTGCA G ---3
3---G ACGTC ---5
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平端： SmaI 切割位点 5---CCC GGG ---3 3---GGG CCC---5
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三、限制性内切酶的命名:
❖1973年，Smith和 Nathans提出了一个较系 统的命名原则：
Hin d III 第三个酶
Haemphilus
influenzae 嗜血流杆菌
D菌株
Escherichi
a coli 大肠杆菌
Eco R I 第一个酶
R菌株
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四、影响酶活性的因素：
1、靶DNA的纯度：内切酶的消化底物的速率很大 程度上取决于使用的DNA样品本身的纯度。通 常我们从生物样品中提取出的DNA容液中，含 有许多物质，如蛋白质，多糖，酚、氯仿，酒精、 乙二胺四乙酸（EDTA）,SDS（十二烷基磺酸 纳），高浓度的盐离子。这些都是酶活性的钝化 剂。酚的影响最大，他可以使蛋白质变性，使酶 失活。
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❖ 限制与修饰存在两方 面的作用：一是保护 自身的DNA不受限制， 即不被切割；二是破 坏外源DNA使之迅速 降解。
❖ 如果没有限制修饰， DNA、基因到处都是， 顺利进入任何生物,改 变遗传物质，发生变 异。
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2. 限制性内切酶的种类：
❖ 有三种不同类型：Ⅰ型、Ⅱ型、Ⅲ型
❖ 核酸外切酶：从核酸分子的末 端开始，一个核苷酸，一个核 苷酸地消化降解多核苷酸的酶。
❖ 核酸内切酶：从核酸分子的内 部，切割磷酸二酯键使之断裂 并形成小分子片断的酶。
❖ 限制性内切酶是核酸内切酶的 一种。
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The two different types of exonuclease
生物工程
Chapter Four
Manipulative Enzymes
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Section one
Restriction Endonuclease
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❖ 核酸酶：指通过切割相邻的两 个核苷酸之间的3－5磷酸二酯 键，而引发核酸分子发生水解 断裂的酶。按水解断裂核酸分 子的方式不同，分为核酸内切 酶和外切酶。
被Linn和Arber发现，他们研究的是大肠杆菌。 大肠杆菌细胞可以降解噬菌体的DNA入侵，也 就是在生物体可识别外源DNA，并将其降解， 而保护自身的DNA不被感染。
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W. Arber
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❖ 这就是在生物体内普遍存在的限制修饰现象。限制是 restriction,修饰modification,所以书上把这一系统 叫做：R/M体系。
❖ 如果对连接或环化的分子用连接酶处理，形成的 DNA分子就是永久性的。
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❖ 限制性内切酶识别的靶序列同DNA的来源无关， 也就是说不带有种的特异性，对各种DNA都普 遍适用。无论那种生物的DNA经同一种酶作用 切割后，形成的片断都能连接再一起，来实现 DNA重组。
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二、限制性片断末端的连接作用:
❖ DNA片断经限制性内切酶切割后，可自然的重 新连接起来，或环化起来；
不同DNA片断通过互不的粘性末端之间的碱基配对 而彼此相连接，称之为分子间连接。
同一DNA片断通过互不的粘性末端的碱基配对连接 成环状形分子， 称为分子内连接。
❖ 对重新连接的DNA片断经加热处理后，会重新 线性化；
蛋白结构 识别位点
剪切位点
限制与甲 基化
限制性酶的类别与活性
Ⅱ型酶
Ⅲ型酶
Ⅰ型酶
内切酶亚基和甲基 2 亚基的双功 3 亚基的双功能酶
化酶亚基分开
能酶
4～6bp 序列
5～7bp
两侧对称或不对称
常为回文
不对称序列
在限制位点
限制位点上游 离限制位点 >1000
24～26bp 处 bp 的非特异位点
活性分开
同时存在