福林酚法测蛋白浓度
folin酚法测定蛋白质含量

folin酚法测定蛋白质含量Folin-酚法是一种测定蛋白质含量的经典方法,其历史可以追溯到1948年。
此方法的基本原理是酚类物质在碱性条件下与蛋白质反应,生成一种深蓝色的复合物,该复合物在760nm处的吸光度与蛋白质浓度成正比,因此可以通过测定吸光度来计算蛋白质浓度。
以下是Folin-酚法测定蛋白质含量的详细步骤:一、实验准备1.实验材料:o待测样品(蛋白质溶液)o Na2CO3o NaHCO3o硫酸铜o酒石酸钾钠o氯仿o无水乙醇o磷酸二氢钾o氢氧化钠2.实验设备:o分光光度计o研钵或电动搅拌器o漏斗和滤纸o玻璃试管和试管架o移液管o搅拌棒二、实验步骤3.准备Folin-酚试剂:将10g的酒石酸钾钠与50g的Na2CO3、NaHCO3混合在研钵中,充分研磨后转移至烧杯中,加入80ml的蒸馏水,搅拌至溶解。
将溶液煮沸并保持1分钟,然后冷却至室温。
将混合物转移至1L容量瓶中,用蒸馏水定容至1L。
4.取1ml待测蛋白质溶液(约0.01-1mg蛋白质)加入到试管中。
5.向试管中加入5ml Folin-酚试剂,混匀。
6.将混合物在室温下保持30分钟,期间不时搅拌。
7.在760nm波长下,用分光光度计测定混合物的吸光度。
为了获得更准确的结果,可以以蒸馏水为空白对照调零。
8.根据标准曲线计算蛋白质浓度。
可以通过绘制已知蛋白质浓度与其对应的吸光度的曲线图来制作标准曲线。
根据待测样品的吸光度,可以在曲线上找到对应的蛋白质浓度。
9.根据需要,可以进一步计算蛋白质的含量(mg/mL或mg/g)。
三、注意事项和局限性1.Folin-酚法对碱性环境非常敏感,如果在试剂准备和混合过程中出现不慎或操作不当,可能会影响到最终的测定结果。
因此,操作者需要熟练和准确的掌握该方法的操作步骤。
2.本方法不适用于测定含有大量酚类物质或还原性物质的样品,这些物质可能会干扰蛋白质与Folin-酚试剂的反应,导致结果偏差。
3.一些蛋白质的氨基酸序列中含有酪氨酸或色氨酸残基,这些残基可以与Folin-酚试剂反应生成蓝色化合物,导致吸光度偏高,最终结果可能偏高也可能偏低。
蛋白质含量测定方法folin—酚试剂法

蛋白质含量测定方法——Folin—酚试剂法Folin—酚试剂法是一种常用的蛋白质定量方法,其原理是蛋白质分子中酪氨酸和半胱氨酸残基在Folin试剂存在下氧化成碘,与酚试剂结合形成一种蓝色复合物。
由于蛋白质的量与Folin 试剂呈正比,因此可以通过比色法测定蛋白质含量。
步骤:1. 准备一系列浓度的标准蛋白质溶液(从低到高),并设置空白对照。
2. 取一定量的Folin试剂和样品混合,充分摇匀后静置2-3分钟。
3. 用酚试剂对样品进行稀释,制备出一系列浓度的标准样品。
4. 对比观察各标准样品的颜色变化,找到蛋白质浓度和颜色的对应关系。
5. 绘制标准曲线,再用于样品蛋白质的测定。
6. 根据样品中剩余的Folin试剂颜色,求出样品中的蛋白质含量。
注意事项:1. 必须严格控制反应温度和时间,以免影响测定的准确度。
2. 在加入Folin试剂后,需要摇动几次以确保充分反应。
3. 如果要测定的样品含有维生素C或其他具有抗氧化性质的物质,需要事先进行去除或中和。
4. 对于浓度过高的样品,建议先进行稀释再进行测定。
在实践中,除了遵循以上步骤,还可以参考以下技巧和经验:* 使用干净的玻璃器具来操作,避免使用塑料器具导致的颜色干扰。
* 在加入Folin试剂后,可以加入少量无水乙醇来稳定颜色反应。
* 在绘制标准曲线时,可以使用不同浓度的标准蛋白质溶液制备一系列梯度样品,这样可以更准确地找到蛋白质浓度和颜色的对应关系。
* 对于未知样品,可以先进行预实验,大致确定蛋白质浓度范围,以便更好地控制实验进程。
总之,Folin—酚试剂法是一种简便、灵敏的蛋白质定量方法,通过遵循正确的步骤和注意事项,可以获得较为准确的测定结果。
蛋白质浓度测定(folin酚法)

实验目的:
熟悉并掌握福林-酚法测定蛋白质浓度的原理和方法。
实验原理:
蛋白质(或多肽)分子中含有酪氨酸或色氨酸,能与Folin-酚试剂起氧 化还原反应,生成蓝色化合物,蓝色的深浅与蛋白质浓度成正比,可 用比色法测定蛋白质浓度。
实验器材:
样品血清(稀释200倍) 标准酪蛋白溶液(200ug/ml) Folin-酚甲液:
白 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 —— —— —— 血清 —— —— —— —— —— —— 0.2 0.2 0.2
水 1.0 0.8 0.6 0.4 0.2 0 0.8 0.8 0.8
Folin 酚甲
5ml,30摄氏度水浴10min
Folin 酚乙
0.5ml,30摄氏度水浴30min
2、 用可见处的吸光度。
3、 以蛋白浓度为横坐标,吸光度为纵坐标绘制标准曲线。 4、 由样品吸光度在标准曲线中找出样品浓度。
实验结果:
试剂 1 2 3 4 5 6 7 8 9
酪蛋 白 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 —— —— ——
血清 —— —— —— —— —— —— 0.2 0.2 0.2
水 1.0 0.8 0.6 0.4 0.2 0 0.8 0.8 0.8
Folin 酚甲
5ml,30摄氏度水浴10min
Folin 酚乙
0.5ml,30摄氏度水浴30min
A640 0 0.131 0.234 0.325 0.407 0.515 0.289 0.296 0.272
A 4%Na2CO3:0.2mol/lNaOH=1:1 B 1%CuSO4:2%酒石酸钾钠=1:1 A:B=50:1 混匀 Folin-酚乙液 可见分光光度计、试管(9支)、移液枪、移液管、烧杯、希尔球。
实验四福林—酚试剂法测定血清总蛋白

思考题
什么叫标准曲线?
绘制标准曲线有何实用意义?
➢ 实验项目 ➢ 实验原理 ➢ 试剂和器材 ➢ 操作方法(主要步骤) ➢ 结果分析 ➢ 思考题
预习
实验五 酶法测血清葡萄糖
标准管对照法
选一管与待测管吸光度相近的作为标准
管,根据公式计算:
待测血清蛋白含 量=
(g/L)
A待测 ×C标准 × V标准 ×500
A标准
V待测
注: V标准为标准管加入标准蛋白质的体积 V待测为待测管加入的待测血清的体积
实验结果标准管来自待测管管号 OD660nm
1
2
3
4
5
6
7
0 0.121 0.250 0.335 0.440 0.525 0.320
ε:摩尔吸光系数 A:物质的吸光度 l:液层的厚度 c:溶液的浓度
标准曲线法
在分光光度计测定范围内,配制一系列已知不 同浓度的标准溶液,在特定波长条件下分别测出 其吸光度值。以吸光度值为纵坐标,相应的溶液 浓度为横坐标在坐标纸上作出一条吸光度与浓度 成正比,并且通过原点的直线,即标准曲线,也 称C-A曲线
空白 (1)
(2) (3)
(4)
(5)
(6)
待测管 (7)
标准蛋白溶液(250µg/ml) -- 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 —
待测血清 蒸馏水 试剂甲
— — — — — — 1.0
1.0 0.8 0.6 0.4 0.2 0
--
3.0 3.0 3.0 3.0 3.0 3.0 3.0
混匀后室温放置20分钟
人血清中蛋白质的正常范围为60-80g/L
标准曲线法比标准管法精确,可消除 各种原因引起的偏离吸收定律而造成的 误差,但是制作比较费时。
Folin-酚试剂法(Lowry法)测定蛋白质浓度

I0
入射光
透光度(T):I/I0
I
出射光 3
分光光度法(specrophotometry)
1. Lambert定律 lg I0/I=K1L
K1是常数,L为溶液的厚度(光径)。
2. Beer定律 lg I0/I=K2C
K2是常数,C为溶液的浓度。
3. Lambert-Beer定律
A=KCL
A为吸光度(光密度、消光度),K为常数(消光系数) 。
• Folin-酚试剂法:不常用 显色反应 25 ~ 250 ug/ml
二、实验原理
蛋白质 碱性铜试剂
试剂甲 -CO-NH-
铜-蛋白质络合物(双缩脲反应)
紫红色(mg级)
铜-蛋白质络合物 磷钼酸-磷钨酸
试剂乙 (Folin试剂)
磷钼蓝 + 磷钨蓝
深蓝色 (ug级)
• 络合物中的酪氨酸和色氨酸残基上的酚基 使磷钼酸–磷钨酸还原,生成蓝色物质。
2/3体积,不宜过多或过少;若不慎使溶液流至比色杯外, 须用棉花或擦镜纸吸干,才能放入比色架。比色杯用后应 立即用自来水冲洗干净。 3. 测定溶液浓度的吸光度值在0.1~0.8之间最符合光吸收定律, 线性好、读数误差较小。
18
➢实验名称 ➢ 摘要(目的、方法、结果、结论) ➢ 实验目的 ➢ 实验原理 ➢ 操作要点(主要步骤) ➢ 实验结果 ➢ 结论和讨论 (结果分析、思考题等)
4
分光光度法(specrophotometry)的应用 A标=KC标L, A测=KC测L
C测
A测 A标
C标
5
一、实验目的
1. 掌握Folin-酚法测定蛋白质含量的原理及操作步 骤。
2. 掌握分光光度计的操作。
生化实验报告 福林-酚试剂法测定蛋白质的浓度

生化实验报告福林-酚试剂法测定蛋白质的浓度实验目的:利用福林-酚试剂法测定蛋白质的浓度。
实验原理:福林-酚试剂法是一种常用的蛋白质定量方法。
该方法利用在碱性条件下,蛋白质和福林-酚试剂在高温下反应生成可溶性淡红色复合物,其最大吸收峰位于560 nm。
该复合物的吸光度与蛋白质的浓度呈线性关系,可以通过比较不同浓度蛋白质标准溶液的吸光度来测定待测蛋白质的浓度。
实验步骤:1. 准备蛋白质标准溶液:称取不同浓度的蛋白质标准溶液(如1 mg/mL、2 mg/mL、4 mg/mL等)分别加入福林-酚试剂,使得最终浓度为0.2 mg/mL,并用称重瓶搅拌均匀。
2. 制备待测蛋白质样品:将待测蛋白质样品溶解在适量的缓冲液中,使其浓度在标准曲线的线性范围内。
3. 加入福林-酚试剂:取相同体积的蛋白质标准溶液和待测蛋白质样品分别加入福林-酚试剂,并用试管架将其放入预热至60°C的水浴中反应15分钟。
4. 冷却:将试管从水浴中取出,放置到冰水中冷却至室温。
5. 测定吸光度:使用分光光度计将各个标准溶液和待测样品的吸光度分别置于560 nm处测量。
6. 建立标准曲线:依次将标准溶液的吸光度值绘制于纵轴,浓度值绘制于横轴,得到标准曲线。
7. 测定样品浓度:根据待测样品的吸光度值和标准曲线,确定其蛋白质浓度。
实验注意事项:1. 确保福林-酚试剂无色,否则应更换新的试剂。
2. 需要在60°C的水浴或恒温器中对试剂进行反应,确保反应温度稳定。
3. 温度过高或过低都会影响测定的准确性,应控制好试管在水浴中的时间。
4. 标准曲线的制备需要使用不同浓度的标准溶液,并且至少应包含一组空白对照组。
5. 测定待测样品时,应确保其在线性范围内,并尽量重复测定。
实验结果:根据实验步骤中的吸光度测定值和标准曲线的关系,可以得到样品中蛋白质的浓度。
实验结论:利用福林-酚试剂法可以测定蛋白质的浓度。
该方法简单、快速、灵敏度高,适用于常规蛋白质浓度的测定。
蛋白质浓度测定Folin-酚法

蛋白质浓度测定——Folin-酚测定一)实验目的:熟悉并掌握福林-酚法测定蛋白质浓度的原理和方法。
二)实验原理:蛋白质(或多肽)分子中含有酪氨酸或色氨酸,能与Folin-酚试剂起氧化还原反应,生成蓝色化合物,蓝色的深浅与蛋白质浓度成正比,可用比色法测定蛋白质浓度。
三)实验器材试剂:1、标准酪蛋白:200ug/ml2、Folin-酚乙试剂:乙液:原液:水=1:1:13、Folin-酚甲液:4%Na2CO3:0.2mol/lNaOH=1:1 A1%CuSO4:2%酒石酸钾钠=1:1 BA:B=50:1 混匀4、血清:稀释200倍5、分光光度计试管(9支)吸管0.5ml(1支)、1ml(3支)四)实验操作:1、标准曲线的绘制将9支干净的试管编号,按下表所示顺序加入试剂并操作。
表1 Folin-酚法测定酪氨酸浓度试剂管号 1 2 3 4 5 6 A B C酪氨酸0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 0 0 0 血清0 0 0 0 0 0 0.2 0.2 0.2 蒸馏水 1.0 0.8 0.6 0.4 0.2 0 0.8 0.8 0.8 分别加入5ml,混匀后放入30℃水中水浴10minFolin-甲Folin-分别加入0.5ml,混匀后放入30℃水中水浴30min乙640nm 0 0.085 0.163 0.223 0.287 0.349 0.216 0.224 0.2122、样液测定将9支试管分别放于分光光度计中测定其吸光度,对照标准曲线求出样液蛋白质浓度。
五)实验结果:1、不同浓度酪氨酸与样液的吸光度表2 不同浓度酪氨酸与样液的吸光度管号 1 2 3 4 5 6 A B C0 0.085 0.163 0.223 0.287 0.349 0.216 0.224 0.212吸光度2、标准蛋白分度曲线:六)结果分析:1、数据分析:最终所得数据与酪氨酸浓度大致呈一正比的关系,血清的吸光度有着一定的波动,但波动不大,些许误差可能是因系统存在误差。
高中生物 Folin-酚试剂法(Lowry法)测定蛋白质浓度

(1)4%碳酸钠(Na2CO3)溶液
(2)0.2N氢氧化钠溶液
(3)1%硫酸铜溶液(CuSO4·5H2O)
(4)2%酒石酸钾钠溶液(或酒石酸钾或钠)
在使用前(1)与(2)、(3)与(4)等体积混合,再将两混合液按50:1比例混合,即为试剂甲。该试剂只能用一天,过期失效。
(一)试剂乙:
(1)市售酚试剂在使用前用NaOH滴定,以酚肽为指标剂,根据试剂酸度将其稀释,使最后酸度为1N。
取试管7支、编号、按下表操作:
立即混匀,在20℃~25℃水浴保温30分钟。用660nm比色,测定光密度值。
操作注意事项:
1.按顺序添加试剂
2.试剂乙在酸性条件下稳定,碱性条件下(试剂甲)易被破坏,因此加试剂乙后要立即混匀,加一管混匀一管,使试剂乙(磷目酸)在破坏前即被还原。
[计算]
(一)绘制标准曲线。以浓度为横坐标,光密度值为纵坐标绘制标准曲线。
(二)以测定管光密度值,查找标准曲线,求出待测血清中蛋白质浓度(g/L)。
(三)再从标准管中选择—管与测定管光密度相接近者,求出待测血清中蛋白质浓度(g/L)。
[器材]
(一)721型分光光度计
(--)恒温水浴箱
(三)中试管7支
(四)刻度吸管:1. 0ml二支;0.5Байду номын сангаасl一支;5.0ml一支。
[试剂]
Folin-酚试剂法(Lowry法)测定蛋白质浓度
[目的]
掌握Lowry法测定蛋白质浓度的原理。
[原理]
蛋白质在碱性溶液中其肽键与Cu2+螯合,形成蛋白质一铜复合物,此复合物使酚试剂的磷钼酸还原,产生蓝色化合物,在一定条件下,利用蓝色深浅与蛋白质浓度的线性关系作标准曲线并测定样品中蛋白质的浓度。
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87...“It is flattering to be ‘most cited author,’but I am afraid it does not signify great scientific accomplishment. The truth is that I have written a fair number of methods papers, or at least papers with new methods included. Although method development is usually a pretty pedestrian affair, others doing more creative work have to use methods and feel constrained to give credit for same 1.... Nevertheless, although I really know it is not a great paper (I am much better pleased with a lot of others from our lab), I secretly get a kick out of the response....“Perhaps you would be interested in a little about the history of the method. Back in 1922, Wu, who worked with Folin,applied the reagent to proteins, without CU 2+, so it was based on the tyrosine and tryptophane contents of the protein. This procedure was used sporadically for some time and had a reputation for erratic results,probably because traces of contaminating CU 2+ would increase the readings. Herriot, in a 1935 footnote to another paper,mentioned that CU 2+ enhanced readings with protein, and in 1941 published a short communication describing the CU 2+enhancing effect for 7 proteins, and giving convincing evidence that the enhancement was attributable to reaction with peptide bonds.“Before I came to St. Louis we had need of a micro method for protein, studied thereaction some more, and came up with a revised procedure which we felt was an improvement, particularly in regard toapplication to a variety of situations.Actually, however, we had made few fundamental changes from the method of Herriot, and had never really intended to publish it.“When I came to St. Louis in 1947 EarlSutherland, who was here then, adopted our procedure, but for several years complained that he had to cite it as ‘personal communication,’ and, he inquired, why didn’t we write it up? So we finally went to work and did the necessary things: studied the reaction more thoroughly, tested it a lot of ways,described its virtues and disadvantages,compared the results with a Kjeldahl procedure, investigated what interfered, etc.“This was a lot of work and the three co-authors helped in various ways. The greatest help was from Miss Nira Rosebrough (now Mrs. Nira R. Roberts) who became one of the best technicians I have ever had. She left us in 1957, worked for awhile with Dr. Rosen in Buffalo, and then quit science to raise a family. Dr. A. Lewis Farr (M.D.) was a post-doctoral student who had an outstanding record in medical school but decided after a year or so to go into private practice in his hometown in Greenville, Mississippi. Mrs.Randall was a technician who stayed at most a year, then left with her husband, and I don’t believe has been in science since, but I have lost track of her.“I...am puzzled why the paper is so often cited, and cited as such. I would like to think it is partly because we studied it pretty thoroughly and it is still applicable in most cases without modification, whereas the original Kjeldahl method, for example, has had innumerable major modifications and microfications, and people cite the particular modification they use. Another reason why our method isn’t simply referred to by name is that it’s quite a mouthful to say ‘Lowry,Rosebrough, Farr, and Randall.’ The method apparently filled a need in the beginning—and a lot of people measure proteins in their work.Once it became established by people like Sutherland and Kornberg, other people may have thought it was the method to use, or at least checked the procedure they were using against it.”21.Lowry O H. Personal communication to D.J.D. Price, November 11, 1969.2.Lowry O H. Personal communication to E. Garfield, August 5, 1976....The authors assert that the use of the Folin phenol reagent for the measurement of proteins “has not found great favor for general biochemical purposes.” This study is concerned with modifying the Folin phenol reagent procedure by treating protein solutions “with copper in alkali.” By recording the color change after the copper treatment, and measuring the quantity of protein present with a Beckman spectrophotometer, the authors determined that “measurement of protein with copper and the Folin reagent” is more sensitive and simpler than other procedures.Professor Oliver H. Lowry:Number 1January 3, 1977Citation ClassicsLowry O H, Rosebrough N J, Farr A L & Randall R J. Protein measurement with the Folin phenol reagent. J. Biol. Chem. 193:265, 1951.。