福林酚测定法
蛋白质的定量测定—福林-酚试剂法
蛋白质的定量测定—福林-酚试剂法一、实验目的：1、学习Folin-酚法测定蛋白质含量的原理和方法。
2、掌握分光光度法制作标准曲线，准确测定未知样品的蛋白质含量。
3、掌握分光光度计的使用方法。
二、实验原理：Folin-酚试剂由甲试剂和乙试剂组成。
甲试剂由碳酸钠，氢氧化钠，硫酸铜及酒石酸钾钠组成。
蛋白质中的肽键在碱性条件下，与酒石酸钾钠铜盐溶液起作用,生成蛋白-Cu2+紫红色络合物。
乙试剂是由磷钼酸和磷钨酸,硫酸,溴等组成。
此试剂在碱性条件下，易被蛋白质中酪氨酸的酚基还原呈深蓝色反应，在一定条件下，深蓝色强度与蛋白质浓度成正比。
三、实验步骤：取洁净干试管7支，按下表操作：30分钟后，以空白管对照，于660nm处比色，读取吸光度值。
四、结果与分析：1.吸光度A660值表2.绘制标准曲线以纵座标为吸光度，横座标为蛋白质浓度，绘制标准曲线，如下图：由图可知直线方程为y=5.6741x，待测管吸光度值为0.105，即y=0.105时，x=0.105/5.6741=0.0185g/L样品蛋白浓度（g/L）=0.0185×6.5×500=60.13g/L3.标准管法求浓度2号标准管与待测管吸光度相近，代入公式计算：样品蛋白浓度（g/L）=(0.105/0.087)×0.25×(0.4/1.0)×500=60.34g/L五、讨论1.如果只用乙试剂而不用甲试剂，也可以发生颜色反应，只是所要耗费时间较长。
2.甲试剂在本实验中起提供碱性环境的作用，其中的Cu2+还起到类似于催化剂作用，使反应更快显色。
3.福林-酚试剂法的主要缺点在于此法对蛋白质中酪氨酸和色氨酸的含量有要求，如果没有酪氨酸和色氨酸的话就无法显色。
4.所用试管一定要干净、干燥，否则即便是微量也会对反应体系造成影响，影响颜色变化，最终影响吸光度的测定。
5.加入试剂乙混匀后静置30min，使氧化还原反应充分反应。
福林酚法测定多酚含量原理
福林酚法测定多酚含量原理
福林酚法是一种测定多酚含量的方法。
福林是一种具有还原性的酚类
物质，可以与多酚反应生成具有蓝色，紫色，红色等吸光度较高的络合物。
该方法的原理基于福林与多酚之间的氧化还原反应。
福林酚法的测定步骤如下：
1.加样：取适量待测样品，放入试管中。
2.福林试剂的配制：将适量的福林溶于适量的乙醇中，制成福林试剂。
3.加入福林试剂：将制备好的福林试剂加入试管中，与待测样品充分
混合。
4.氢氧化钠溶液的配制：将适量的氢氧化钠溶解于适量的蒸馏水中，
制成氢氧化钠溶液。
5.加入氢氧化钠溶液：将制备好的氢氧化钠溶液滴加到试管中，与混
合液充分混合。
6.开始反应：将试管加热，使福林与多酚之间的反应加速进行。
7.定时停止反应：经过一段时间后，停止加热反应。
8.冷却：待试管冷却后，测定反应液的吸光度。
9.测定吸光度：使用分光光度计等设备，测定反应液的吸光度。
10.计算：根据反应液的吸光度值，参照标准曲线，计算出待测样品
中多酚的含量。
福林酚法的原理是基于福林与多酚之间的氧化还原反应。
福林具有还原性，在碱性条件下，可以与多酚发生氧化还原反应。
福林通过氧化还原反应，可以将多酚从原来的无色状态转变为有色络合物。
反应过程中福林的还原能力会逐渐消耗，导致吸光度降低。
因此，反应液的吸光度与多酚的含量之间有一定的正比关系。
福林酚法的优点是操作简单，灵敏度高，对于多酚含量的测定具有一定的准确度和可靠性。
因此，福林酚法广泛应用于食品、医药、化妆品等领域中对多酚含量的测定。
Folin-酚法
ＹＹＳＷＤＢ００９０ 蛋白质含量测定福林酚法
YY-SW-DB-0090 蛋白质福林－酚法
１． 范围 本方法采用蛋白质与福林 本方法适用于各类蛋白质２．０毫克的氮酚试剂ｐｈｅｎｏｌ ｒｅａｇｅｎｔ铜复合物磷钨酸还原成蓝色复合物蓝色强度与蛋白质量成正比２５０ｍＬ－１但其缺点也很明显
干扰物质多蔗糖巯基化物柠檬酸等标准曲线的直线关系不特别严格
３．试剂 碳酸钠，氢氧化钠，酒石酸钾钠，硫酸铜５Ｈ２ＯＮａ２Ｗ０４，钼酸钠（Ｎａ２Ｍｏ０４
４．仪器 ７２型分光光度计
１ＯｇＮａ
２ＣＯ３或钠盐或钾盐
０．５ｇＣｕＳＯ４每次使用前将两溶液以Ａ：Ｂ此为试剂甲
在１．５升的磨口回流瓶中加入１０Ｏｇ钨酸钠２Ｈ２Ｏ２５ｇ钼酸钠（Ｎａ２Ｍｏ０４
再加５ＯｍＬ ８５ｌ００ｍＬ浓盐酸接上回流冷凝管以小火回流
１０小时５０ｍＬ蒸馏水及数滴液体溴
冷却后溶液呈黄色须再重复滴加液体溴的步骤将溶液稀
稀至１升滤液置棕色瓶中保存以酚酞为指示剂
约加１倍水使最终的酸浓度为１ｍｏｌ ５．３ 标准蛋白质溶液浓度为２５０ｍＬ－１取动物血清
６．操作步骤 ６．１ 按下表顺序加入各试剂 试管编号 １ ２ ３ ４ ５ ６ ７ ８ ９ 蛋白质含量ｇｍＬｍＬｍＬ室温下放置１０分钟
试剂乙Ｌ－１
立即混匀
然后利用未知样品的光密度值
８．说明
８．１ 比色测定时的波长可选６５Ｏｎｍ或６６０ｎｍ１００可选用７５Ｏｎｍ
若在１２５
９．参考文献
１ 李如亮 主编． 生物化学实验． 武汉１９９８． ３７－５８
２ 张龙翔等 主编． 生化实验方法和技术． 北京１９９７． １３６－１４４
３ 李建武等 合编． 生物化学实验原理和方法． 北京１９９４． １５０－１７４ 。
福林酚测多酚原理
福林酚测多酚原理
福林酚是一种常用的多酚测定试剂，其原理基于多酚物质与福林酚在酸性条件下发生显色反应。
该反应是一种氧化还原反应，其中福林酚被还原为其自由酸态，而多酚物质被氧化。
在多酚测定中，首先将待测样品中的多酚物质提取出来。
常用的提取溶剂包括乙酸乙酯、甲醇、乙醇等。
提取后的溶液与福林酚试剂混合，在酸性条件下加热反应，通常使用硫酸作为酸性媒介剂。
在这个过程中，多酚物质被氧化，同时福林酚被还原。
福林酚在氧化还原反应中由有色福林阳离子被还原为无色福林酚酸。
显色的特点是福林酚酸与多酚物质在酸性条件下形成一种深红色的络合物。
该特殊的显色反应可以通过光度计或比色计进行测量，从而确定多酚物质的含量。
多酚测定中，福林酚是一种常用的试剂，因其与多酚物质之间的特异性反应而被广泛应用。
福林酚测定法是一种简便、准确、快速的多酚测定方法，在生物学、药物学、化学等领域中得到了广泛的应用。
蛋白质的定量测定――福林酚法(Folin―酚试剂法)
蛋白质的定量测定――福林酚法(Folin―酚试剂法)实验原理Folin—酚试剂法最早是由Lowry确定的测定蛋白质浓度的基本方法。
以后在生物化学领域得到广泛的应用。
此法的显色原理与双缩脲方法是相同的，只是加入了第二种试剂，即Folin—酚试剂，以增加显色量，从而提高了检测蛋白质的灵敏度。
这个方法的优点是灵敏度高，比双缩脲法灵敏得多，缺点是费时较长，要严格控制操作时间，标准曲线也不是严格的直线形式，且专一性较差，干扰物质较多。
凡干扰双缩脲反应的基团，如 -CO-NH2, -CH2-NH2, CS-NH2以及Tris缓冲液、蔗糖、硫酸铵、巯基化合物均可干扰Folin—酚反应，而且对后者的影响还要大得多。
此外，酚类、柠檬酸对此反应也有干扰作用。
Folin—酚试剂由甲试剂和乙试剂组成。
甲试剂由碳酸钠，氢氧化钠，硫酸铜及酒石酸钾钠组成。
蛋白质中的肽键在碱性条件下，与酒石酸钾钠铜盐溶液起作用，生成紫红色络合物。
乙试剂是由磷钼酸和磷钨酸、硫酸、溴等组成。
此试剂在碱性条件下，易被蛋白质中酪氨酸的酚基还原呈蓝色反应，其色泽深浅与蛋白质含量成正比。
此法也适用于测定酪氨酸和色氨酸的含量。
本法可测定范围是25—250μg蛋白质。
试剂和器材一、试剂Folin—酚试剂:试剂甲：1) 4%碳酸钠溶液2) 0.2mol/L氢氧化钠溶液3) 1%硫酸铜溶液4) 2%酒石酸钾钠溶液。
临用前将（1）与（2）等体积配制碳酸钠—氢氧化钠溶液。
（3）与（4）等体积配制成硫酸铜—酒石酸钾钠溶液。
然后这两种试剂按50:1的比例配合，即成Folin—酚试剂甲。
此试剂临用前配制，一天内有效。
试剂乙：称钨酸钠（Na2WO2?2H2O）100g，钼酸钠（Na2MoO4?2H2O）25g置2000mL磨口回流装置内，加蒸馏水700mL，85%磷酸50mL和浓硫酸100mL。
充分混匀，使其溶解。
小火加热，回流10h（烧瓶内加小玻璃珠数颗，以防溶液溢出），再加入硫酸锂（LiSO4）150g，蒸馏水50mL及液溴数滴。
福林酚测定法
福林酚测定法试剂碱性铜试液取氢氧化钠10g，碳酸钠50g,加水400ml使溶解，作为甲液；取酒石酸钾0.5g加水50ml使溶解，另取硫酸铜0.25g，加水30ml使溶解，将两液混合，作为乙液。
临用前，合并两液，并加水至500ml。
操作法⑴对照品溶液的制备取牛血清白蛋白对照品，加水制成每1ml中含0.3ml的溶液。
⑵供试品溶液的制备照各药品项下的方法制备。
⑶标准曲线的制备精密量取对照品溶液0.0ml、0.1ml、0.3ml、0.5ml、0.7ml、0.9ml，分别置具试管中，各加水至1.0ml，再分别加入碱性铜试液1.0ml，摇匀，各加入福林酚试液（取福林试液中的贮备液1→16）4.0ml，立即混匀，置55℃水浴中准确反应5分钟，置冷水浴中10分钟，在650nm的波长处测定吸收度；同时以0号管作为空白。
以吸收度作为纵坐标，对照品溶液浓度为横坐标绘制标准曲线。
⑷测定法精密量取供试品溶液1.0ml，照标准曲线的制备项下的方法，自“加入碱性铜试液起，依法测定，自标准曲线上查得供试品溶液的浓度，并乘以稀释倍数。
二）试剂与器材1.试剂（1）试剂甲：（A）10克 Na2CO3，2克 NaOH和0.25克酒石酸钾钠（KNaC4H4O6·4H2O）。
溶解于500毫升蒸馏水中。
（B）0.5克硫酸铜（CuSO4·5H2O）溶解于100毫升蒸馏水中，每次使用前，将50份（A）与1份（B）混合，即为试剂甲。
（2）试剂乙：在2升磨口回流瓶中，加入100克钨酸钠（Na2WO4·2H2O）,25克钼酸钠（Na2 MoO4·2H2O）及700毫升蒸馏水，再加50毫升85%磷酸，100毫升浓盐酸，充分混合，接上回流管，以小火回流10小时，回流结束时，加入150克硫酸锂（Li2SO4），50毫升蒸馏水及数滴液体溴，开口继续沸腾15分钟，以便驱除过量的溴。
冷却后溶液呈黄色（如仍呈绿色，须再重复滴加液体溴的步骤）。
福林酚实验
福林(Folin)-酚试剂法测定蛋白质的浓度一、目的熟悉并掌握福林（Folin）—酚法测定蛋白质浓度的原理和方法。
二、原理蛋白质或多肽分子中有带酚基酪氨酸或色氨酸，在碱性条件下，可使酚试剂中的磷钼酸化合物还原成蓝色（生成钼蓝和钨蓝化合物）。
蓝色的深浅与蛋白质的含量成正比，可用比色法测定。
三、实验仪器1.卵清蛋白片2.7220分光光度计3.试管4.移液管四、实验试剂1. Folin-酚试剂A：碱性铜溶液甲液：取Na2CO32g溶于100ml0.1mol/l氢氧化钠溶液中乙液：取CuSO4.5H2O晶体0.5g，溶于1%酒石酸钾100ml中。
临用时按甲：乙=50：1混合使用。
2. Folin-酚试剂B：将100g钨酸钠、25g钼酸钠、700ml蒸馏水、50ml85%磷酸继100ml浓盐酸置于1500ml的磨口圆底烧瓶中，充分混匀后，接上磨口冷凝管，回馏10小时，再加入硫酸锂150g，蒸馏水50ml及液溴数滴，开口煮沸15分钟，在通风橱内驱除过量的溴。
冷却，稀释至1000ml，过滤，滤液成微绿色，贮于棕色瓶中。
临用时，用1mol/l 的氢氧化钠溶液滴定，用酚酞作指示剂，根据滴定结果，将试剂稀释至相当于1mol/L的酸。
3. 1mg/mL牛血清蛋白液：称取1g牛血清蛋白片溶于0.9%氯化钠溶液中，并稀释至1000ml四、实验步骤1.标准曲线的绘制取7支干燥的试管，编号，按下表加入试剂，比色后，以光密度为纵坐标，蛋白质浓度为横坐标作图。
0.10.20.30.40.450.5牛血清蛋白液OD500摇匀，在室温下放置30分钟后在500nm下比色0.50.50.50.50.50.50.50.5Folin-酚试剂B摇匀，在室温下放置10分钟0.5（样液）4.00.54.00.44.00.34.00.24.00.14.00.054.04.0(1mg/ml)ml蒸馏水ml Folin-酚试剂A样品7654321管号2.样品测定准确吸取样液0.5ml于干燥的试管中，同样按下表加入试剂，测出光密度值后，对照标准曲线求出样液的蛋白质浓度。
福林(Folin)-酚试剂法测定
将参比样品溶液和被测样 品溶液分别倒入比色皿中， 打开样品室盖，将盛有溶 液的比色皿分别插入比色 皿槽中，盖上样品室盖。 一般情况下，参比样品放 在第二个槽位中。 将0％T校具（黑体）置入 光路中，在T方式下按“0 ％T”键，此时显示器显示 “000.0”
四、实验步骤
1.标准曲线的绘制 取7支干燥的试管，编号，按下表加入试剂，比 色后，以光密度为纵坐标，蛋白质浓度为横坐标 作图。 2.样品测定 准确吸取样液0.5ml于干燥的试管中，同样按下 表加入试剂，测出光密度值后，对照标准曲线求 出样液的蛋白质浓度。
管号 牛血清蛋白液 (1mg/ml)ml 蒸馏水ml 蒸馏水 Folin-酚试剂 酚试剂A 酚试剂
摇匀，在室温下放置 分钟后在 分钟后在500nm下比色 摇匀，在室温下放置30分钟后在 下比色 OD500
蛋白质含量测定的方法有哪些，各有什么优 缺点？
下次试验：氨基酸纸层析和维生素C 下次试验：氨基酸纸层析和维生素 定量测定-2， ，二氯酚靛酚法。 定量测定 ，6，二氯酚靛酚法。
附：7200型分光光度计的操作程序
比色皿的清洁程度，直接影响实验结果。因此， 比色皿的清洁程度 ， 直接影响实验结果 。 因此 ， 特 别要将比色皿清洗干净。装样前处理： 别要将比色皿清洗干净 。 装样前处理 ： 自来水反复 冲洗→蒸馏水漂洗2次 → 待装溶液漂洗 2次 。用完后 待装溶液漂洗2 冲洗 → 蒸馏水漂洗2 用自来水和蒸馏水洗净并用檫镜纸檫干放回比色皿 盒中。 盒中。
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福林酚测定法
试剂碱性铜试液取氢氧化钠10g，碳酸钠50g,加水400ml使溶解，作为甲液；取酒石酸钾0.5g加水50ml使溶解，另取硫酸铜0.25g，加水30ml使溶解，将两液混合，作为乙液。
临用前，合并两液，并加水至500ml。
操作法⑴对照品溶液的制备取牛血清白蛋白对照品，加水制成每1ml中含0.3ml的溶液。
⑵供试品溶液的制备照各药品项下的方法制备。
⑶标准曲线的制备精密量取对照品溶液0.0ml、0.1ml、0.3ml、0.5ml、0.7ml、0.9ml，分别置具试管中，各加水至1.0ml，再分别加入碱性铜试液1.0ml，摇匀，各加入福林酚试液（取福林试液中的贮备液1→16）4.0ml，立即混匀，置55℃水浴中准确反应5分钟，置冷水浴中10分钟，在650nm的波长处测定吸收度；同时以0号管作为空白。
以吸收度作为纵坐标，对照品溶液浓度为横坐标绘制标准曲线。
⑷测定法精密量取供试品溶液1.0ml，照标准曲线的制备项下的方法，自“加入碱性铜试液起，依法测定，自标准曲线上查得供试品溶液的浓度，并乘以稀释倍数。
二）试剂与器材
1.试剂
（1）试剂甲：
（A）10克 Na2CO3，2克 NaOH和0.25克酒石酸钾钠（KNaC4H4O6·4H2O）。
溶解于500毫升蒸馏水中。
（B）0.5克硫酸铜（CuSO4·5H2O）溶解于100毫升蒸馏水中，每次使用前，将50份（A）与1份（B）混合，即为试剂甲。
（2）试剂乙：在2升磨口回流瓶中，加入100克钨酸钠（Na2WO4·2H2O）,25克钼酸钠（Na2 MoO4·2H2O）及700毫升蒸馏水，再加50毫升85%磷酸，100毫升浓盐酸，充分混合，接上回流管，以小火回流10小时，回流结束时，加入150克硫酸锂（Li2SO4），50毫升蒸馏水及数滴液体溴，开口继续沸腾15分钟，以便驱除过量的溴。
冷却后溶液呈黄色（如仍呈绿色，须再重复滴加液体溴的步骤）。
稀释至1升，过滤，滤液置于棕色试剂瓶中保存。
使用时用标准NaOH 滴定，酚酞作指示剂，然后适当稀释，约加水1倍，使最终的酸浓度为1N左右。
（3）标准蛋白质溶液: 精确称取结晶牛血清清蛋白或γ—球蛋白，溶于蒸馏水，浓度为250μg/ml左右。
牛血清清蛋白溶于水若混浊，可改用0.9%NaCl溶液。
2. 器材
（1）可见光分光光度计
（2）旋涡混合器
（3）秒表
（4）试管16支
（三）操作方法
1. 标准曲线的测定：取16支大试管，1支作空白，3支留作未知样品，其余试管分成两组，分别加入0，0.1，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0毫升标准蛋白质溶液（浓度为250μg/ml）。
用水补足到1.0毫升，然后每支试管加入5毫升试剂甲，在旋涡混合器上迅速混合，于室温（20～2 5℃）放置10分钟。
再逐管加入0.5毫升试剂乙（Folin—酚试剂），同样立即混匀。
这一步混合速度要快，否则会使显色程度减弱。
然后在室温下放置30分钟，以未加蛋白质溶液的第一支试管作为空白对照，于700nm处测定各管中溶液的吸光度值。
以蛋白质的量为横座标，吸光度值为纵座标，绘制出标准曲线。
注意：因Lowry反应的显色随时间不断加深，因此各项操作必须精确控制时间，即第1支试管加入5毫升试剂甲后，开始计时，1分钟后，第2支试管加入5毫升试剂甲，2分钟后加第3支试管，余此类推。
全部试管加完试剂甲后若已超过10分钟，则第1支试管可立即加入0.5毫升试剂乙，1分钟后第2支试管加入0.5毫升试剂乙，2分钟后加第3支试管，余此类推。
待最后一支试管加完试剂后，再放置30分钟，然后开始测定光吸收。
每分钟测一个样品。
进行多试管操作时，为了防止出错，每位学生都必须在实验记录本上预先画好下面的表格。
表中是每个试管要加入的量（毫升），并按由左至右，由上至下的顺序，逐管加入。
最下面两排是计算出的每管中蛋白质的量（微克）和测得的吸光度值。
Folin—酚试剂法实验表
2. 样品的测定：取1毫升样品溶液（其中约含蛋白质20~250微克），按上述方法进行操作，取1毫升蒸馏水代替样品作为空白对照。
通常样品的测定也可与标准曲线的测定放在一起，同时进行。
即在标准曲线测定的各试管后面，再增加3个试管。
如上表中的8、9、10试管。
根据所测样品的吸光度值，在标准曲线上查出相应的蛋白质量，从而计算出样品溶液的蛋白质浓度。
注意:由于各种蛋白质含有不同量的酪氨酸和苯丙氨酸，显色的深浅往往随不同的蛋白质而变化。
因而本测定法通常只适用于测定蛋白质的相对浓度（相对于标准蛋白质）。
四、改良的简易Folin—酚试剂法
（一）试剂
1. 试剂甲：碱性铜试剂溶液中，含0.5N NaOH、10%Na2CO3、0.1%酒石酸钾和0.05%硫酸铜，配制时注意硫酸铜用少量蒸馏水溶解后，最后加入。
2. 试剂乙：与前面的基本法相同。
临用时加蒸馏水稀释8倍。
3. 标准蛋白质溶液：同基本法。
（二）操作步骤
测定标准曲线与样品溶液的操作方法与基本法相同。
只是试剂甲改为1毫升，室温放置10分钟后，试剂乙改为4毫升。
在55℃恒温水浴中保温5分钟。
用流动水冷却后，在660nm下测定其吸光度值。
改良的快速简易法，可获得与 Folin—酚试剂法（即Lowry基本法）相接近的结果。