第十二章 微生物工程生产举例

二、抗生素生产工艺
1、生物合成法： ③细胞融合技术法 对抗生素产生菌采用细胞融合技术的成果更 为突出。橄榄色无孢小单孢菌细胞融合株抗生素 产率比原菌株提高100倍。 目前DNA重组技术已广泛用于红霉素、链霉 素等20多种抗生素的育种工作，可以预见不久将 来会有更多的由“工程菌”生产的新型抗生素问 世。
二、氨基酸（赖氨酸）生产工艺
重点： 赖氨酸生物合成途径及代谢调节机制； 酵母和霉菌的赖氨酸生物合成途径和调 节机制； 赖氨酸生产菌的育种途径。 难点：天冬氨酸族氨基酸生物合成的代谢调 节机制。
二、氨基酸生产工艺
氨基酸本身的合成在不同生物体中，有较大的差异， 然而许多氨基酸的合成途径在不同生物体中也有共同之处。 按照起始物可将氨基酸的合成分成几个家族： ㈠谷氨酸族（α -酮戊二酸族） 包括：谷氨酸、谷氨酰胺、精氨酸、赖氨酸和脯氨酸； ㈡丙酮酸族 包括：丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸； ㈢天冬氨酸族（早酰乙酸族） 包括：天冬氨酸、天冬酰胺、苏氨酸和异亮氨酸； ㈣磷酸甘油酸族 包括：甘氨酸、丝氨酸和半胱氨酸； ㈤芳香族 包括：苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸； 另外，组氨酸的合成为单独的一条途径。
三、青霉素生产工艺
3、发酵条件控制 补糖：残糖降至0.6％（PH上升）； 补氮：氨氮0.05％，补硫铵、氨水或尿素； PH：6.4—6.6，加糖、加酸、加碱调节； 温度：前期，25-26℃；后期， 23℃； 通气比：1：0.8； 溶氧：﹥氧饱和溶解度的30％； 消沫剂：玉米油、豆油或化学合成消沫剂。
苏氨酸脱水酶受异亮氨酸的反馈抑制； 添加前体物质D-苏氨酸、α-酮基异戊酸； 绕过异亮氨酸对苏氨酸脱水酶的反馈抑制。
直接发酵法：
抗反馈调节突变株，解除对苏氨酸脱水酶的 反馈抑制。
3、亮氨酸发酵
亮氨酸高产菌株的选育：
1）选育α-酮基异丁酸抗性突变株，解除对异亮氨 酸、亮氨酸和缬氨酸生物合成酶系的阻遏作用； 2）选育异亮氨酸缺陷型回复突变株， 其α-异丙基 苹果酸合成酶不再受亮氨酸的反馈抑制； 3）α-噻唑抗性兼蛋氨酸、异亮氨酸双重缺陷型突 变株，用于亮氨酸的发酵生产。
3、酵母和霉菌的赖氨酸生物合成途径
就赖氨酸合成途径来讲，不同种类的 微生物途径不同，可以归纳为两条途径： 1）为经过二氨基庚二酸的生物合成途 径，如细菌、DPA； 2）是AAA，酵母菌、霉菌经过α -氨基己 二酸AAA途径合成赖氨酸。
4、氨基酸生物合成的调节机制
反馈抑制与优先合成
氨基酸生物合成的基本调节机制有反馈抑制与 在合成途径分支点处的优先合成。 反馈抑制：A→B→C→D
5）增加前体物的生物合成和阻塞产物的生成：
方法：
①选育丙氨酸缺陷型； ②选育抗天冬氨酸结构类似物突变株； ③选育适宜的活性比突变株；
6）改变细胞膜的透过性 7）选育温度敏感突变株 8）应用细胞工程和遗传工程育种 9）防止高产菌株回复突变
7、赖氨酸生物合成途径
大肠杆菌的赖氨酸生物合成途径：图23-2
8、赖氨酸发酵条件控制
溶氧：特别重要，不足，会使赖氨酸 生产受到不可逆抑制； PH：通过补加氨水来控制； 温度：32℃； 前体：甘氨酸或丝氨酸。（短小假单胞菌）
三、异亮氨酸、亮氨酸生产工艺
1、异亮氨酸、亮氨酸和缬氨酸的生物合成途径：
图23-4
2、异亮氨酸发酵
两种方法：添加前体发酵法和直接发酵法 添加前体发酵法：

工业上重要氨基酸简介
一、氨基酸生产工艺控制
1、菌种：细菌，野生型或营养缺陷型、结 构类似物突变菌种； 2、培养基： 碳源：淀粉水解糖、糖蜜等； 氮源：铵盐、氨水或尿素，豆饼、麸皮粉； 无机盐：S、P、Ga、Mg、K等； 生物素：影响细胞膜透性，对氨基酸分泌影 响很大，来源：玉米浆、麸皮、糖蜜。
一、氨基酸生产工艺控制
二、抗生素生产工艺
1、生物合成法： ② “工程菌”制造法
第一次由“工程菌”制造的全新抗生素—麦迪紫红 素 A，是美国报道的。他们将产放线紫红素的部分基因插入 产麦迪霉素的放线菌中，构建的“工程菌”产生了全新 的抗生素。 我国新构建的生产丁胺卡那霉素的“工程菌”，就 是把 酰化酶基因克隆到卡那霉素产生菌中获得的。采用新的 “工程菌”生产，避免了现国外通用的使用有毒光气生 产的 办法，新抗生素毒副作用小，对耐卡那霉素、庆大霉素
在细菌中，虽然天冬氨酸族氨基酸生物合成途 径是相同的，但是其代谢调节机制是多种多样的。 1）大肠杆菌K12 ①天冬氨酸激酶 ②天冬氨酸-β -半醛脱氢酶 ③DDP合成酶（赖氨酸分支的第一个酶） ④高丝氨酸合成酶（HD）（通向苏氨酸、蛋氨酸分 支的第一个酶）
2、天冬氨酸族生物合成的代谢调节机制
2）黄色短杆菌 其赖氨酸生物合成调节机制比大肠 杆菌简单，其天冬氨酸激酶只有一种， 该酶具有两个变构部位，可以与终产物 结合，当两种终产物同时过量时，该酶 活性受到抑制。 3）乳糖发酵短杆菌赖氨酸合成调节
第三节 柠檬酸生产工艺
重点：柠檬酸生物合成途径；柠檬酸生物 合成的代谢调节；三羧酸循环的调节。 难点：柠檬酸生物合成的代谢调节；糖酵 解及丙酮酸代谢的调节。
一、柠檬酸发酵生产工艺
（一）柠檬酸合成途径 柠檬酸又名枸橼酸，学名α -羟基丙烷三羧 酸，是生物体主要代谢产物之一。 柠檬酸合成途径： 丙 EMP 葡萄糖 酮 酸
三、青霉素生产工艺
三、青霉素生产工艺
三、青霉素生产工艺
1、菌种：产黄青霉 生长发育分六个阶段： Ⅰ—Ⅳ期：菌丝生长期，适宜做种子； Ⅳ—Ⅴ期：青霉素分泌期； Ⅵ期：菌丝体自溶期。
三、青霉素生产工艺
2、培养基： 碳源：乳糖、蔗糖、葡萄糖等； 氮源：玉米浆、麸皮粉、无机氮源； 前体：苯乙酸或苯乙酰胺；（一次﹤0.1％） 无机盐：S、P、Ga、Mg、K等。 铁离子有害， 控制在﹤30µg/ml。
二、抗生素生产工艺
2、化学合成法 根据某种抗生素的化学组成和结构， 通过化学合成的方法，可生产部分抗生素。 如：氯霉素、磷霉素等。 经过化学合成方法和控制条件的不断 深入研究，越来越多的抗生素可用化学合 成法生产。
二、抗生素生产工艺
3、生物合成加化学合成法
许多细菌逐渐出现了抗药性，已经证实某些抗药性 因子位于细菌内的质粒上，质粒可以在细菌之间转移， 结果抗性菌日益增多，抗生素疗效就越来越低。 为了对付细菌的抗药性，科学家对原有的抗生素进 行了“整容手术”，细菌因再无法识别改头换面的抗生 素而 被抑制或杀死。 现在已能使用克隆了酰化酶基因的“工程菌”（大肠 杆 菌）高效率的生产半合成抗生素。临床现在使用的贵重 特效药物先锋霉素（头孢菌素类）、氨苄青霉素，就是 这类半合成抗生素类药物。国外已有几十种这类药物在 实验室研制成功。
解除代谢互锁的方法：
①选育亮氨酸缺陷型菌株，或者以抗AEC的赖氨酸的生产菌 为出发菌株，经诱变得到抗AEC兼抗亮氨酸缺陷型菌株。 ②选育抗亮氨酸结构类似物的突变株，从遗传上解除亮氨酸 对DDP合成酶的阻遏。 ③选育对苯醌或喹啉衍生物敏感菌株，这是一种寻找亮氨酸 渗漏缺陷型菌株的有效方法。
6、赖氨酸生产菌的育种途径
氨基酸的生物合成
1、天冬氨酸族生物合成途径
天冬氨酸族氨基酸合成可以以草酰乙酸或天冬氨 酸为原料，合成苏氨酸、蛋氨酸和异亮氨酸。
天冬酰氨 甲硫氨酸 琥珀酰高丝氨酸 →异亮氨酸 DDP合成酶 二氨基庚二酸→赖氨酸 合成酶
草酰乙酸→天冬氨酸→天冬氨酸磷酸→天冬氨酸-β -半醛→高丝氨酸→苏氨酸
2、天冬氨酸族生物合成的代谢调节机制
E
D
优先合成：A→B→C F G
5、其他特殊的控制机制
1）终产物控制
催化分支合成途径共同部分的初始酶， 在仅一种氨基酸终产物过剩时，完全不受或微 弱或部分地反馈抑制（或阻遏），只是在多数 终产物共存下才强烈地控制。有以下几种情况： ①协同（或多价）反馈抑制 ②合作（或增效）反馈抑制 ③同功酶控制 ④积累反馈抑制
氧化脱羧
乙酰COA
→柠檬酸 草酰乙酸
羧化
（二 ）柠檬酸生物合成的代谢调节
1、糖酵解及丙酮酸代谢的调节
1）在正常情况下，柠檬酸、ATP对磷酸果糖激酶 有抑制作用，而ATP、无机磷、铵离子对该酶 则有激活作用，特别是还能解除柠檬酸、ATP 对磷酸果糖激酶的抑制作用。 2）比较底物锰充足、锰缺乏时分批培养物的最 大活力时发现，锰缺乏时黑曲霉的组成（合成） 代谢受损伤，这与柠檬酸的积累有关。 3）丙酮酸激酶是EMP途径的第2个调节点，在某 些真菌得到证实，但黑曲霉未被证实。
三、青霉素生产工艺
4、青霉素的分离纯化 过滤：板框、真空转鼓； 萃取：醋酸丁脂，2-3次； 脱色：活性碳，150-200g/10亿单位； 结晶：浓缩结晶或直接结晶； 洗涤 干燥
第二节 氨基酸生产工艺
一、氨基酸生产工艺控制 二、氨基酸生产工艺 三、异亮氨酸、亮氨酸生产工艺
概 述
氨基酸可用作食品、饲料添加剂和药物。过去都采用 动植物蛋白提取和化学合成法生产，现18种氨基酸均可 采用发酵法和酶法生产，不仅成本下降、污染减少，还 可组织大量生产，世界产量每年递增5％～10％。 在氨基酸产生菌选育中，过去多采用诱变育种方法， 诱变结果不易控制，现采用基因工程和细胞融合技术， 产量可成倍、甚至几十倍增加，生产成本大大下降。 如用基因重组构建的苏氨酸、色氨酸“工程菌”，比 原 始菌株提高产量几十倍（产酸达50～60克/升），色氨酸 成本从每公斤50美元降到23美元。用细胞融合构建的精 氨酸融合株，精氨酸产量达108克/升，比其他生产菌株 高2倍多。
一、抗生素的分类
按生物来源、作用、化学结构、作用机制、合 成途径可分为：表22-1
二、抗生素生产工艺
生产方法：
1、生物合成法： ①传统方法 ② “工程菌”制造法 ③细胞融合技术法 2、化学合成法； 3、生物合成加化学合成法。
二、抗生素生产工艺
1、生物合成法： ①传统方法 大多数抗生素是由放线菌和霉菌产生的。菌 种是通过从土壤中分离、筛选获得，一般采用深 层通风搅拌发酵罐生产。 传统方法目前存在很多不足，因此，人们采 用基因工程和细胞融合技术，对抗生素产生菌进 行了改造和重新设计，不仅可以制造出许多高效 低毒的新型抗生素，还可改革工艺，使抗生素产 量成倍地增长。