测序引物的要求
DNA测序样品的要求
DNA测序样品的要求未纯化PCR产物的要求1. 片段大于200bp；2.请提供50ml PCR扩增产物(总量1ug-2ug)；3.取3ml样品，应该能够清晰的分辨出目的条带；自带引物，引物浓度为5-10uM,并请注明。
备注纯化后PCR产物的要求1.PCR产物溶于蒸馏水中(请勿溶解在TE溶液中)；2.浓度大于20ng/ml，体积大于10ml，长片段需适当增加量；3.电泳检测条带专一；自带引物。
所有模板均应提供相应的引物信息自带质粒的要求1.质粒溶于30~50ml ddH2O中(请勿溶解在TE溶液中)，电泳检测浓度大50~100ng/ml；2. 建议用相关试剂盒提取质粒；3. 如有可能，同时提供1ml含有相应质粒的菌液备用；4. 需注明载体和插入目的片段长度、以及测序要求。
菌液模板的要求1.说明载体抗性类型，我们提供A mp, Kan, Tet及Chl四种抗生素；2. 其余类型抗生素需自备；应为高拷贝质粒，对于低拷贝质粒，请直接提供约1mg纯化质粒；3. 提供1ml左右过夜培养（12h）的菌液，加15%灭菌甘油，于E ppendorf 管中封口保存，防止交叉污染或渗漏；4. 大量样品测序，建议在一次性塑料培养皿固体培养基上穿刺培养；5. 建议尽量提供穿刺培养或斜面培养的菌种（装在EP管中）。
自带引物的要求1.浓度不低于5pmol/ml(或5umol/L)，溶液体积15-50ml；2. 随机引物（RA PD引物）和简并引物以及引物长度不足15bp不能用于本公司提供如下通用测序引物：M13+，M13-，T7, SP6, T7 ter，BGH rev, pGL3+, pGL3-，pGEX5’，pGEX3’，5’AOX1，3’A OX1 ，a-factor。
其他引物请自带或提供序列由我们合成。
常用载体特征PCR类型测序模板注意事项∙总反应体积建议为50uL或100uL，扩增结束后取3ul用1%左右的琼脂糖电泳检测，应为单一的条带。
生工菌液测序要求
生工菌液测序通常是指对微生物菌液样本进行DNA测序，以确定微生物的种类、功能和遗传特性。
进行生工菌液测序时，需要满足以下要求：
1.样本准备：
-收集足够量的菌液样本，通常需要一定量的菌落或液体。
-样本应保持新鲜，避免长时间存放导致的DNA降解。
2.DNA提取：
-使用适当的方法提取菌液中的微生物DNA，常用的方法包括CTAB法、酚-氯仿提取法等。
-提取的DNA应尽量纯净，避免蛋白质、多糖和其他杂质的污染。
3.DNA质量控制：
-检测DNA的纯度和浓度，通常使用紫外分光光度计或荧光计进行定量。
-通过凝胶电泳检查DNA的完整性，确保没有明显的降解。
4.测序引物设计：
-根据目标微生物的基因组信息，设计合适的PCR引物，用于扩增目标DNA 片段。
5.PCR扩增：
-使用设计的引物对目标DNA片段进行PCR扩增。
-确保PCR反应条件优化，以获得足够的扩增产物。
6.测序反应：
-将PCR产物进行纯化，去除未扩增的引物和DNA片段。
-将纯化后的DNA进行测序反应，通常使用Sanger测序或高通量测序技术。
7.数据分析：
-收集测序数据，进行序列比对和注释，以确定微生物的种类和功能。
-分析微生物的遗传变异和进化关系。
8.结果验证：
-如果可能，通过其他分子生物学方法验证测序结果。
进行生工菌液测序时，需要根据具体的研究目的和微生物种类选择合适的方法和技术。
测序试剂质量标准
测序试剂质量标准一、目的本标准旨在规定测序反应所需的各种酶的活性、纯度和浓度，引物、模板、dNTPs等的质量要求，测序反应的体系组成，温度和时间设置，产物质量，重复性和准确性等方面的要求。
以确保测序实验的准确性和可靠性。
二、测序反应所需的各种酶的活性1.逆转录酶（Reverse Transcriptase）：活性应不低于2000 units/μl。
2.DNA聚合酶（DNA Polymerase）：活性应不低于5000 units/μl。
3.Taq酶（Taq DNA Polymerase）：活性应不低于100 units/μl。
三、测序反应所需的各种酶的纯度和浓度1.逆转录酶和DNA聚合酶的纯度应不低于95%，浓度应为1 unit/μl。
2.Taq酶的纯度应不低于98%，浓度应为10 units/μl。
四、测序反应所需的引物、模板、dNTPs等1.引物：应采用HPLC纯化，浓度应为100 pmol/μl。
2.模板：应具有高纯度，浓度应在100 ng/μl以上。
3.dNTPs：应具有高纯度，浓度应为10 mM。
五、测序反应的体系组成测序反应的体系组成应根据具体测序方法和试剂品牌进行调整，但一般应包括以下成分：1.酶混合液：包含逆转录酶、DNA聚合酶或Taq酶等。
2.dNTPs混合液：包含dATP、dTTP、dCTP和dGTP等。
3.引物：应根据具体测序实验需求添加。
4.模板：应根据具体实验需求添加。
5.Buffer：测序反应所需缓冲液。
6.去离子水：用于调整反应体系体积。
六、测序反应的温度和时间设置测序反应的温度和时间设置应根据具体测序方法和试剂品牌进行调整，但一般应遵循以下要求：1.预变性：95℃ x 5分钟。
2.退火：根据引物和模板的特性和浓度设置退火温度和时间。
3.延伸：72℃ x 30秒 - 1分钟。
4.变性：95℃ x 15秒。
5.循环次数：根据实验需求设置循环次数，一般应在30-40次之间。
引物设计的要求
引物设计的要求
首先，引物设计的要求包括引物长度和序列的选择。
引物长度一般在18-25碱基对之间，太短的引物可能导致特异性不高，而太长的引物可能
导致扩增效率低下。
同时，引物的序列应该是与目标DNA片段互补的，以
确保引物能够在目标DNA上进行合成。
其次，引物设计的要求还包括引物的GC含量。
GC含量过高或过低都
可能导致PCR扩增效率下降，因此通常希望引物的GC含量在40-60%之间。
此外，引物的GC含量也会影响PCR产物的熔解温度，更高的GC含量会使
得熔解温度升高。
因此，在引物设计中，需要根据需要来调整引物的GC
含量，以适应实验条件和目标DNA的特性。
此外，引物设计的要求中还包括引物的特异性。
引物应该能够特异性
地与目标DNA片段结合，而不与其他DNA序列结合。
为了提高引物的特异性，可以使用基因组数据库进行引物序列的BLAST比对，以确保引物序列
只与目标DNA片段匹配。
最后，引物设计的要求还包括引物的纯度和浓度。
引物的纯度应该高，以避免引物之间的杂交和非特异性扩增。
引物的浓度要适当，通常在10-100 pmol/μl之间，以确保引物能够充分参与PCR反应。
总之，引物设计的要求包括引物长度和序列的选择、引物的GC含量、引物之间的配对性、引物的特异性以及引物的纯度和浓度。
满足这些要求
可以提高PCR反应的效率和特异性，从而得到准确可靠的实验结果。
一、测序样品要求
一、测序样品要求：质粒：1. 已纯化质粒大于20ul，溶于超纯水浓度大于100ng/ul；2．大质粒必须注明载体长度;3．质粒拷贝数低的样品，请提供质粒。
菌液：1. 请提供１ml以上过夜培养新鲜无污染菌液，用Ependorf管装，并注意封口，以免污染．保存时间较长的甘油菌，请重新摇菌后送样． 2．培养基和抗生素：本公司提供LB培养基和胺卞青霉素、卡那青霉素、氯霉素三种抗生素。
若您的菌株培养时有其他要求，请你提供4～5ml培养好的新鲜菌液或沉淀下来的菌体。
3．请提供质粒的名称、抗性、插入片段的长度，指定确切的通用引物。
PCR产物：1. 样品检测标准：上样3～5ul，琼脂糖电泳鉴定，为清晰可见的单一亮带。
2．不接受样品小于150bp、电泳检测有弥散的，多带的样品，非单一条带样品，建议克隆后测序。
3．未纯化的PCR产物样品，体积大于50ul，浓度大于50ng/ul；已纯化PCR产物体积为20ul，浓度大于50ng/ul，可取2ul样品电泳检测条带清晰PCR产物明亮，长片段需加浓度。
不管测序是否成功，本公司都将收取纯化费用。
4．若您自己纯化，请一定要进行Agarose凝胶电泳方式纯化回收，溶解在超纯水中（勿用TE溶解），浓度＞30 ng/ul ，同时提供PCR引物。
5．长度超过1kb，需要2个以上的测序反应才能测通的PCR样品，建议克隆后测序，否则单覆盖难以得到包括PCR引物序列在内的完整序列号。
6．引物请提供20ul，浓度大于3μM。
二、免费提供通用引物列表：T7；SP6；M13F；M13R；M13F（-47）；M13R（-48）；M13（-96）；T7TER；T3；S.TAG；A-FACTOR；PBV220F；PBV220FR；5’AOX；3’AOX；PGEX-5’；PGEX-3；PEGFP-C-5’；PEGFP-C-3’；PEGFP-N-5’；PEGFP-N-3’；PCDNA3.1F；PCDNA3.1R三、注意事项:1．客户样品编号请用数字、英文字母（大写）或下划线，不超过5个字符；E-Mail要用大写字母填写，并要求字迹规范、工整、清楚。
质粒测序引物设计
质粒测序引物设计随着基因研究的不断深入，质粒测序成为了分析基因信息的重要工具之一，同时，为了获得更真实、更准确的序列，准确设计序列特异性强的引物是非常重要的。
本文将重点讲述质粒测序所需的引物设计流程及其注意事项，以期为大家提供参考。
1. 引物设计的基本原则引物是一种在PCR反应体系中使DNA聚合酶特异性扩增所需的寡核苷酸。
正确认识引物的作用和特点，对于准确设计合适的引物具有很重要的意义。
引物的主要特点有以下几个方面：（1）序列特异性：引物应特异性地与目标序列结合，确保扩增出的片段为所需的序列，而非与其它非靶DNA结合。
（2）稳定性：使其与模板DNA的双链DNA进行稳定的配对。
（3）温度特异性：引物与模板结合的温度应该略低于生产它们的反应体系的温度。
基于以上特点，我们需要基于引物设计的原则进行质粒测序引物的设计。
具体来说，主要考虑以下几个方面：（1）序列特异性：引物应设计成特异性的，避免产生与目标序列无关的PCR产物。
其特异性应通过序列比对和BLAST进行验证，以确保最终设计出的引物能够对所需的目标序列特异性扩增。
在引物设计时，还应注意要在引物中避开GC/AT区域和重复序列的部位。
（2）长度优化：引物的长度应该合适，过短容易导致扩增不全，过长则容易出现引物间的竞争关系，同时也容易产生温度特异性方面的问题。
一般来说，引物长度应该控制在20个核苷酸左右，但是对于某些特殊的情况，比如复杂基因组、高度变异基因等，可能需要设计更长的引物。
（3）序列特征：引物中不应含有重复结构、长程序列、寡聚物或者常见的RNA序列，这些都可能导致不特异扩增、引物二聚或聚合酶滞留等问题。
2. 引物设计流程在对质粒进行测序之前，需要先设计合适的引物，紧密契合上述引物设计原则，具体流程如下：（1）数据获取：首先需要获取目标DNA序列，并确定所需要进行的PCR扩增区域。
（2）引物设计：根据目标区域，按照上述设计原则进行引物的设计。
一般来说，可以利用一些公共的软件或者在线工具进行引物设计，比如Primer 3、OligoCalc、Primer Premier等。
测序引物设计原则 知乎
测序引物设计原则知乎
1.引物长度：引物长度通常在18-24个碱基对之间，不过具体长度要根据所需扩增的DNA片段长度来确定。
2. 引物序列：引物序列应该与目标DNA片段的序列互补，尽量避免引物内部的配对以及引物之间的二聚体或多聚体形成，以确保PCR反应的特异性和效率。
3. 引物的GC含量：引物的GC含量应该在40-60%之间，过低或过高的GC含量都会影响PCR反应的特异性和效率。
4. 引物的熔点：引物的熔点应该相似，以保证引物在PCR反应中同时结合到目标DNA的两端。
5. 引物的特异性：引物设计时应该避免引物与非目标DNA片段的互补，以确保PCR反应的特异性。
6. 引物的位置：引物应该选择在目标DNA序列的两端，以确保PCR反应只扩增出目标DNA片段。
7. 引物的杂交效率：引物设计时应该尽量避免引物与非目标DNA 的互补，以确保PCR反应的效率。
- 1 -。
PCR引物设计的基本原则
PCR引物设计的基本原则1. 引物的长度一般取15-30bp，常用18-27bp，但不能大于38bp，因为引物过长会导致其延伸温度大于74℃。
2. 引物3’端的序列要比5’端重要。
引物3’端的碱基一般不用A（3’端碱基序列最好是G、C、CG、GC），因为A在错误引发位点的引发效率相对比较高。
另引物间3’端的互补、二聚体或发夹结构也很可能导致PCR反应失败。
5’端序列对PCR 影响不太大，因此常用来引进修饰位点或标记物。
3. 引物的GC含量一般为40-60%，以45-55%为宜，过高或过低都不利于引发反应。
有一些模板本身的GC 含量偏低或偏高，导致引物的GC含量不能在上述范围内，这时应尽量使上下游引物的GC 含量以及Tm 值保持接近（上下游引物的GC含量不能相差太大），以有利于退火温度的选择。
如果G-C比例超出，则在引物的5’端增加As或Ts；而如果A-T比例过高，则同样在5’端增加Gs或Cs。
4. 引物所对应模板序列的Tm 值最好处于72℃左右。
（Tm 值曲线以选取72 度附近为佳，5’到3’的下降形状也有利于引物引发聚合反应），至少要在55-80℃之间5. ΔG值（自由能）反映了引物与模板结合的强弱程度。
一般情况下，引物的ΔG值最好呈正弦曲线，即5’端和中间ΔG值较高，而3’端ΔG值相对较低，且不要超过9（ΔG值为负值，这里取绝对值），如此可防止错误引发。
3′末端双链的ΔG是0~-2 kcal/mol时，PCR产量几乎到百分之百，随着其绝对值的增加产量逐渐下降，在-6时只有40%、到-8时少于20%、而-10时接近于0。
6.错配率一般不要超过100，否则会出现非目的条带。
但是对于某些特定的模板序列，还应结合比较其在正确位点引发效率。
如果两者相差很大，比如在正确位点的引发效率为340以上，而在错误位点的引发效率为110，并且不好找到其他更合适的引物，那么这对引物是可以接受的；7. Frq 曲线为Oligo6新引进的一个指标，揭示了序列片断存在的重复机率大小。
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• 测序模板的要求
• PCR产物直接测序 • PCR已纯化产物：
提供切胶回收纯化后的PCR产物20ul (浓度大于50 ng/μl), 并请提供浓度 (浓度须正确) 大于3.2 pmol/μl的测序引物10～20 μl（具体体积视客户反应数相应增加）。 • 未纯化PCR产物： • 提供至少40ulPCR扩增原液，送样前取2ul经琼脂糖胶鉴定目的片断为明亮的一条带, 同时请提供浓度 (浓度须正确) 大于3.2 pmol/μl的测序引物10～20 μl （具体体积视 客户反应数相应增加）。
6 Invitrogen Proprietary & Confidential
普通测序及测序相关基础知识——基本概念
• DNA结构示意图——DNA的四级结构： DNA与蛋白质形成的复合物。如 染色体（质）。
7 Invitrogen Proprietary & Conf本概念
普通测序及测序相关基础知识——基本概念
• DNA结构示意图——单核苷酸及DNA的二级结构——4种脱氧核苷酸分子 通过3’，5’—磷酸二酯键连接形成的直线型或环型多聚体。
5 Invitrogen Proprietary & Confidential
。
普通测序及测序相关基础知识——基本概念
• DNA结构示意图——DNA的三级结构：双螺旋DNA进一步扭曲盘绕则形 成其三级结构，超螺旋是DNA三级结构的主要形式。
除了RNA(核糖核酸)和噬菌体外，DNA是所有生物的遗传物质基础。生 物体亲子之间的相似性和继承性即所谓遗传信息，都贮存在DNA分子中。
3 Invitrogen Proprietary & Confidential
普通测序及测序相关基础知识——基本概念
• DNA的结构 • DNA共有四级结构 • 一级结构：由多个4种脱氧核苷酸分子通过3’，5’—磷酸二酯键连接形成
的直线型或环型多聚体。 二级结构：在碱基互补配对的基础上形成的DNA双螺旋结构。 三级结构：在二级结构上，DNA双螺旋结构通过折叠和扭曲所形成的特 定构象。如超螺旋等。 四级结构：指DNA与蛋白质形成的复合物。如染色体（质）。
——DNA测序就是测定DNA的一级结构
4 Invitrogen Proprietary & Confidential
• 动画演示：/video/2005/43.htm
• 目前测序需要使用的仪器 • A.PCR扩增仪 • B.3730XL全自动荧光测序仪
8 Invitrogen Proprietary & Confidential
普通测序及测序相关基础知识——测序模板的要求
10 Invitrogen Proprietary & Confidential
普通测序及测序相关基础知识——测序模板的要求
• 质粒DNA的测序 • 质粒样品：
请注明载体名称及是否含有特殊结构、插入片段的长度及插入片段的酶切位 点情况、请提供至少15ul以上的提纯的质粒DNA ，浓度大于200 ng/μl（体积视 客户反应个数适当增加）。 • 含有质粒的菌液/沉淀菌体/平板菌/穿刺菌样品： 请注明菌体的种类及抗生素抗性的情况、所含载体的名称及结构情况、插入 片段的长度及插入片段的酶切位点情况、如果有特殊抗生素添加比例或培养 条件特殊须注明。
9 Invitrogen Proprietary & Confidential
普通测序及测序相关基础知识——测序模板的要求
• 注意事项: • PCR产物直接测序成功的关键是PCR产物的纯度，所以我们提倡用胶回收
PCR产物。如果有几条PCR产物长度相近，用电泳胶也无法分开时，此时 的PCR产物直接测序会出现双峰，这种情况建议把PCR产物克隆后测序。 PCR已纯化产物请用水稀释不要用elution buffer。 • PCR产物直接测序成功的另一要因是引物。不是能做PCR反应的引物便一 定能测序。测序用引物要求较高,引物的3‘端必须与模板完全配对，含有 Mix碱基的引物一般不能测序 (特别是3’端)。此外，测序引物长度一般为 20个碱基左右，GC含量必须在50～60%左右，TM值在55-65度之间。尽量 保证测序引物的纯度。并且引物需要用水而非TE溶解。 • PCR未纯化产物最好不要添加染料。
测序知识概述
Content
• 普通测序及测序相关基础知识 • 普通测序生产流程介绍 • 困难模板测序相关知识 • 困难模板测序生产流程介绍 • 测序简单问题解答
2 Invitrogen Proprietary & Confidential
普通测序及测序相关基础知识——基本概念
• 什么是DNA以及DNA测序 • 又称脱氧核糖核酸，是染色体的主要化学成分，同时也是组成基因的材
• 含有噬菌体DNA的样品
• 公司均不提供此类抽提服务，请客户提供质粒形态的样品20ul ，浓度大于50 ng/μl。务必需要客户注明是含有噬菌体DNA的质粒。
料。
DNA分子极为庞大(分子量一般至少在百万以上)，主要组成成分是腺嘌 呤脱氧核苷酸、鸟嘌呤脱氧核苷酸、胞嘧啶脱氧核苷酸和胸腺嘧啶脱氧 核苷酸（简称A、T、C、G）。DNA存在于细胞核、线粒体、叶绿体中， 也可以以游离状态存在于某些细胞的细胞质中。大多数已知噬菌体、部 分动物病毒和少数植物病毒中也含有DNA。
• DNA测序原理 • 目前DNA测序的原理是Sanger双脱氧链末端终止法，简单来说，就是单引
物扩增的PCR反应，但是将PCR反应体系中的dNTP换成了带有荧光标记的 ddNTP和dNTP的混合物。 • 目前最普遍的DNA测序技术是采用四色荧光分别标记四种ddNTP. • 一个样品的测序反应只需在同一反应体系中同时加入四种ddNTP. 产物无 须分离即可在一个泳道中电泳. • 序列的读取依靠检测器对不同荧光的区分.并需要通过软件系统的分析.