质粒测序引物
一、测序样品要求
一、测序样品要求：质粒：1. 已纯化质粒大于20ul，溶于超纯水浓度大于100ng/ul；2．大质粒必须注明载体长度;3．质粒拷贝数低的样品，请提供质粒。
菌液：1. 请提供１ml以上过夜培养新鲜无污染菌液，用Ependorf管装，并注意封口，以免污染．保存时间较长的甘油菌，请重新摇菌后送样． 2．培养基和抗生素：本公司提供LB培养基和胺卞青霉素、卡那青霉素、氯霉素三种抗生素。
若您的菌株培养时有其他要求，请你提供4～5ml培养好的新鲜菌液或沉淀下来的菌体。
3．请提供质粒的名称、抗性、插入片段的长度，指定确切的通用引物。
PCR产物：1. 样品检测标准：上样3～5ul，琼脂糖电泳鉴定，为清晰可见的单一亮带。
2．不接受样品小于150bp、电泳检测有弥散的，多带的样品，非单一条带样品，建议克隆后测序。
3．未纯化的PCR产物样品，体积大于50ul，浓度大于50ng/ul；已纯化PCR产物体积为20ul，浓度大于50ng/ul，可取2ul样品电泳检测条带清晰PCR产物明亮，长片段需加浓度。
不管测序是否成功，本公司都将收取纯化费用。
4．若您自己纯化，请一定要进行Agarose凝胶电泳方式纯化回收，溶解在超纯水中（勿用TE溶解），浓度＞30 ng/ul ，同时提供PCR引物。
5．长度超过1kb，需要2个以上的测序反应才能测通的PCR样品，建议克隆后测序，否则单覆盖难以得到包括PCR引物序列在内的完整序列号。
6．引物请提供20ul，浓度大于3μM。
二、免费提供通用引物列表：T7；SP6；M13F；M13R；M13F（-47）；M13R（-48）；M13（-96）；T7TER；T3；S.TAG；A-FACTOR；PBV220F；PBV220FR；5’AOX；3’AOX；PGEX-5’；PGEX-3；PEGFP-C-5’；PEGFP-C-3’；PEGFP-N-5’；PEGFP-N-3’；PCDNA3.1F；PCDNA3.1R三、注意事项:1．客户样品编号请用数字、英文字母（大写）或下划线，不超过5个字符；E-Mail要用大写字母填写，并要求字迹规范、工整、清楚。
addgene质粒鉴定方法
addgene质粒鉴定方法引言：质粒是一种环状的双链DNA分子，通常存在于细菌和酵母等微生物中。
它们被广泛用于基因工程和分子生物学研究，可用于构建重组DNA、表达外源蛋白和分析基因功能等。
然而，由于质粒本身存在多种变异和不同构象，在使用之前需要进行鉴定和验证，以确保所得数据的准确性和可靠性。
本文将介绍常用的addgene质粒鉴定方法。
一、限制性内切酶鉴定法限制性内切酶是一类能够识别并切割双链DNA特定序列的酶。
通过将质粒DNA与特定的限制性内切酶一起反应，可以得到特定长度的DNA片段。
根据这些DNA片段的大小及其模式，可以判断质粒的完整性和纯度。
1.扩增PCR方法该方法通过特定引物在质粒DNA上扩增目标序列，然后将PCR扩增产物与适当的限制性内切酶一起切割。
所得的DNA片段可以通过琼脂糖凝胶电泳分析，根据DNA片段的大小来鉴定质粒的完整性。
2.酶切方法该方法直接将质粒DNA与限制性内切酶反应，将产生的DNA片段通过琼脂糖凝胶电泳分析，根据DNA片段的大小来鉴定质粒的完整性。
二、Sequencing鉴定法该方法通过对质粒DNA进行测序，确定其序列，并与已知的质粒序列进行比较，以鉴定质粒的准确性和纯度。
在测序过程中，还可以检测质粒序列上可能存在的突变或插入。
1. Sanger测序法Sanger测序法是一种常用的DNA测序技术，通过使用特定引物和荧光染料标记的特殊链终止核苷酸，可以得到质粒DNA的准确序列。
将得到的测序结果与已知的质粒序列进行比对分析，可以鉴定质粒的准确性和纯度。
2.高通量测序法高通量测序技术（Next Generation Sequencing，NGS）是一种高效、高通量的测序技术。
通过对质粒DNA进行高通量测序，可以得到大量的测序数据，并通过对这些数据的比对和分析，来鉴定质粒的准确性和纯度。
三、温度敏感性鉴定法温度敏感质粒是一类能够在特定温度下被复制和维持，而在非特定温度下失去复制和维持能力的质粒。
质粒测序引物设计
质粒测序引物设计随着基因研究的不断深入，质粒测序成为了分析基因信息的重要工具之一，同时，为了获得更真实、更准确的序列，准确设计序列特异性强的引物是非常重要的。
本文将重点讲述质粒测序所需的引物设计流程及其注意事项，以期为大家提供参考。
1. 引物设计的基本原则引物是一种在PCR反应体系中使DNA聚合酶特异性扩增所需的寡核苷酸。
正确认识引物的作用和特点，对于准确设计合适的引物具有很重要的意义。
引物的主要特点有以下几个方面：（1）序列特异性：引物应特异性地与目标序列结合，确保扩增出的片段为所需的序列，而非与其它非靶DNA结合。
（2）稳定性：使其与模板DNA的双链DNA进行稳定的配对。
（3）温度特异性：引物与模板结合的温度应该略低于生产它们的反应体系的温度。
基于以上特点，我们需要基于引物设计的原则进行质粒测序引物的设计。
具体来说，主要考虑以下几个方面：（1）序列特异性：引物应设计成特异性的，避免产生与目标序列无关的PCR产物。
其特异性应通过序列比对和BLAST进行验证，以确保最终设计出的引物能够对所需的目标序列特异性扩增。
在引物设计时，还应注意要在引物中避开GC/AT区域和重复序列的部位。
（2）长度优化：引物的长度应该合适，过短容易导致扩增不全，过长则容易出现引物间的竞争关系，同时也容易产生温度特异性方面的问题。
一般来说，引物长度应该控制在20个核苷酸左右，但是对于某些特殊的情况，比如复杂基因组、高度变异基因等，可能需要设计更长的引物。
（3）序列特征：引物中不应含有重复结构、长程序列、寡聚物或者常见的RNA序列，这些都可能导致不特异扩增、引物二聚或聚合酶滞留等问题。
2. 引物设计流程在对质粒进行测序之前，需要先设计合适的引物，紧密契合上述引物设计原则，具体流程如下：（1）数据获取：首先需要获取目标DNA序列，并确定所需要进行的PCR扩增区域。
（2）引物设计：根据目标区域，按照上述设计原则进行引物的设计。
一般来说，可以利用一些公共的软件或者在线工具进行引物设计，比如Primer 3、OligoCalc、Primer Premier等。
DNA测序样品要求
附：测序样品的要求
一、PCR原液
∙片断通常大于200bp；
∙提供浓度大于50ng/ul，体积大于50ul；
∙2ul电泳检测条带清晰无杂带。
二、PCR已纯化
∙PCR产物溶于超纯水中；
∙浓度大于50ng/ul，体积大于20ul；
∙电泳检测条带单一。
三、质粒要求
∙质粒浓度大于100ng/ul，体积大于20ul；
∙建议使用相关试剂盒提取；
∙建议同时提供1ml菌液；
∙大质粒需要注明载体长度。
四、菌液模板要求
∙说明载体的抗性，我们提供Amp 、kan、chl、tet四种抗生素；
∙对于低拷贝质粒请直接提供1ug纯化质粒；
∙提供1ml左右的过夜培养菌液，加15%灭菌甘油，于离心管中封口保存，防止交叉污染或泄漏；∙建议尽量提供穿刺培养的菌种。
五、引物要求
∙浓度5umol/l，体积大于20ul；
∙随机引物和兼并引物不适合测序；
∙尽可能提供引物全序列，PCR退火温度；
∙T7、SP6、M13(+)、M13(-)、T3等通用引物我们免费提供。
样品类型及注意事项。
质粒载体测序报告
质粒载体测序报告1. 引言质粒载体是一类广泛应用于分子生物学和基因工程研究的工具。
通过质粒载体，研究人员能够将外源基因导入到目标细胞中，实现基因的表达和功能分析。
质粒载体测序报告旨在对质粒载体进行全面的测序分析，以确定其序列信息，并评估其质量和适用性。
2. 实验流程质粒载体测序通常包括以下步骤：1.质粒提取：将质粒提取出来，通常采用离心、酚-氯仿提取或商用提取试剂盒等方法。
2.质粒纯化：通过离心、凝胶电泳等方法，将质粒与其他细胞成分分离。
3.质粒测序文库制备：将质粒线性化并连接适当的测序引物，反应后通过PCR扩增文库。
4.高通量测序：将质粒文库装入Illumina或其他测序平台中进行高通量测序。
5.数据分析：对测序数据进行质量控制、序列拼接和序列注释等分析。
3. 数据质量控制在质粒载体测序过程中，数据质量控制是必不可少的一步。
常见的数据质量控制指标包括测序错误率、Q值分布和序列长度分布等。
通过对质量较低的序列进行滤除或修剪，可以提高后续数据分析的精确性和准确性。
4. 序列拼接与注释在质粒测序后，通常需要对产生的序列进行拼接和注释以获取准确的质粒序列信息。
序列拼接主要通过比对软件如Bowtie、BLAST等将测序reads 结合在一起。
而序列注释则是通过比对测序 reads 到已知的数据库，如GenBank、NCBI等，以获得质粒中的潜在功能元件。
5. 结果和讨论通过对质粒载体测序的实验和数据分析，我们得到了以下结果：1.质粒载体序列：经过拼接和注释，我们获得了质粒载体的完整序列，长度为XXX bp。
2.质量评估：通过数据质量控制，我们对测序数据进行了过滤和修剪，确保了序列的准确性和可靠性。
3.序列注释：通过将测序 reads 比对到已知基因库，我们对质粒中的潜在功能元件进行了注释，包括启动子、终止子、转录因子结合位点等。
4.比对结果：我们将质粒序列与已知质粒库进行了比对，发现该质粒与已知质粒高度相似，符合预期。
质粒和PCR产物测序
DNA（质粒和PCR产物）测序操作程序一、P CR反应体系标准反应体系（20 μL）试剂用量DNA X μL（根据模板确定）BigDye 8 μL引物 (3.2 pmol / μL) 1 μL灭菌去离子水补充到20 μL总体积20 μL优化反应体系（10 μL）试剂用量DNA X μL （根据模板确定）BigDye 2 μL引物 (3.2 pmol / μL) 1 μL灭菌去离子水补充到20 μL总体积10 μL测序PCR热循环条件：96 ︒C 1 min96 ︒C 10 se50 ︒C 5 sec x 25个循环60 ︒C 4 min4 ︒C保温二、测序产物纯化：10 μL反应体系，384孔板，酒精/EDTA/NaAc法1.每管加入1 μL 125 mM EDTA到管底，每管加入1 μL 3M NaAc到管底。
2.每管加入25 μL 100%酒精，铝箔封严密，震荡混匀4次，室温放置15 min。
3.1400-2000 x g离心45 min 或者2000-3000 x g离心30 min，马上倒置384孔板，离心至185 x g 停止离心（从离心机启动到达到185 x g停止离心总共1 min时间）。
4.每管加入35 μL 70% 酒精，1650 x g 4 ︒C离心15 min；马上倒置384孔板，离心至185 xg 停止离心（从离心机启动到达到185 x g停止离心总共1 min时间）。
5.重复第4步1次。
6.室温挥发净酒精，加入10 μL Hi-Di Formamide溶解DNA；或者铝箔密封后于4 ︒C保存。
7.溶解后的样品需要在 95 ︒C变性4 min，迅速置冰中冷却4 min后，上样电泳。
三、测序产物纯化：单离心管法请参照20 μL反应体系，96孔板，酒精/EDTA/NaAc法操作，只需要将“倒置96孔板，离心至185 x g 停止离心”这一操作改为用枪吸尽上清液。
1.每管加入2 μL 125 mM EDTA到管底，每管加入2 μL 3M NaAc到管底。
质粒测序引物
GAL4 ADfor
pGAL4-ADrv
pACT2
p17110
p12584
pACYC184(BamHI-site)
PBRforBam
PBRrevBam
pACYCDuet-1(MCSI)
ACYCDuetUP1 Primer
DuetDOWN1
pACYCDuet-1(MCSII)
DuetUp2
T7-Terminator
M13R
pEASY-T3
M13F/T7
M13R/SP6
pECFP-N(C)
PECFP-N-5.
PECFP-N-3,
pEF/myc/cyto/ER/mito/nuc
pEF-5
Pcdna3.1R/BGH rev
pEF1(4,6/myc-His)
T7/pEF-5
Pcdna3.1R/BGH rev
pEF1(4,6/V5-His)
pDSRED-N1(KAN+)
pEGFP-N-5’
pDSRED-N-R
pEASY-Blunt
M13F
T7/ M13R
pEASY-BluntSimple
M13F
T7/ M13R（距离插入位点合适，优先安排）
pEASY-T1 Simple
M13F
M13R（距离插入位点合适，优先安排）
pEASY-T1
M13F/T7
pBridge(MCSI)
GAL4-Bdfor
3'BD
pBridge(MCSII)
not available
not available
pBS-T II
T3/M13rev
T7/M13for
质粒测序引物设计
质粒测序引物设计
质粒测序是一种常用的分子生物学技术，用于分析质粒的基因组成和结构。
在质粒测序过程中，引物是至关重要的组成部分，其质量和设计直接影响到测序数据的准确性和可靠性。
因此，正确设计合适的引物至关重要。
设计引物的首要步骤是选择目标序列。
质粒测序通常需要分析全长或部分序列，因此需要确定目标序列的起止位置。
在选择目标序列时，还需要考虑序列的特点，如长度、GC含量和反向互补性等。
这些因素将影响引物的长度和特异性。
设计引物时，需要遵循一些基本原则。
首先，引物的长度应该在18-25个碱基对之间，以保证特异性和特异性。
其次，引物的GC含量应该在40-60%之间，以确保引物与目标序列的结合。
此外，还需要确保引物的特异性，以避免与其他序列的杂交信号。
引物设计时还需要考虑引物间的距离和方向。
引物之间的距离应该足够远，以避免重叠或杂交。
另外，正向和反向引物之间的距离应该相等，以确保扩增产物的长度均匀。
总之，正确设计引物对质粒测序的结果至关重要。
根据目标序列的特点，采用合适的引物设计策略和软件，可以设计出高质量的引物，从而获得更加准确和可靠的测序数据。
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TREfor/CMV-Profor
T7/M13for
pDisplay
T7/CMV-Profor
c-mycrev
pDNR-LIB(MCS_A)
M13for,T7
pSG5-3,M13R
pDonar
M13F
M13R
pDONR201
PDONR-F
PDONR-R
pDONR207
PDONR-F
PDONR-R
T7,CMV-Profor
BGH rev,c-mycrev
pcDNA4/TO
TREfor/CMV-Profor
BGH rev
pcDNA4/V5-His(_A,_B,_C)
CMV-Profor,T7
BGH rev,V5rev
pcDNA4-TET/ON/AMP+
CMV-Profor
pcDNA5/FRT
T7/CMV-Profor
T7-Terminator
pET-20b(+)
T7
T7-Terminator
pET-21(-a,-b,-c,-d)(+)
T7
T7-Terminator
pET-22b(+)
T7
T7-Terminator
pET-23(-a,-b,-c,-d)(+)
T7
T7-Terminator
pET-24(-a,-b,-c,-d)(+)
pBR322(BamHI-site)
PBRforBam
PBRrevBam
pBR322(EcoRI/HindIII-sites)
pBRforEco
pBRrevHind
pBR325(BamHI-site)
PBRforBam
PBRrevBam
pBR329(BamHI-site)
PBRforBam
PBRrevBam
EBVrev
pCI-neo
T7（17BASE）
EBVrev,T3
pCMS-EGFP
T7
T3
pCMS-EGFP
T7
EBVrev,T3
pCMV-3Tag-4A
T3 /PFLAG-CMV-F
T7
pCMV5
pCMV5F
PCMV5R
pCMV6
CMV-Profor
pCMV6-3、HGHrev
pCMV6-XL4
CMV-Profor/T7
M13rev/Tac-Profor
pcDNA3
T7/CMV-Profor
BGH rev/SP6
pcDNA3.1(+/-)
pcDNA3.1F/T7/CMV-Profor
BGH rev
pcDNA3.1/His(_A,_B,_C)
T7/CMV-Profor
BGH rev
pcDNA3.1/myc-His(_A,_B,_C)
pBridge(MCSI)
GAL4-Bdfor
3'BD
pBridge(MCSII)
not available
not available
pBS-T II
T3/M13rev
T7/M13for
pBS（AMP）
T7
T3
pBSR
T3
T7ter
pBudCE4.1(MCSI)
CMV-Profor,T7
c-mycrev,EBVrev
T7
pCMV-Sport6
T7/M13for
SP6/M13rev
pCOLADuet-1(MCSI)
ACYCDuetUP1 Primer
DuetDOWN1
pCOLADuet-1(MCSII)
DuetUP2
T7TER
pCR2.1
T7,M13for
M13rev
pCR2.1-TOPO
M13for,T7
M13rev
pACT2
GAL4 ADfor
pGAL4-ADrv
pACT2
p17110
p12584
pACYC184(BamHI-site)
PBRforBam
PBRrevBam
pACYCDuet-1(MCSI)
ACYCDuetUP1 Primer
DuetDOWN1
pACYCDuet-1(MCSII)
DuetUp2
T7-Terminator
BGH rev
pcDNA6/myc-His(_A,_B,_C)
CMV-Profor,T7
BGH rev,c-mycrev
pcDNA6/V5-His(_A,_B,_C)
CMV-Profor,T7
BGH rev,V5rev
pCEP4
pCEP-F/CMV-Profor
EBVrev
pCI
T7（17BASE）
pBluescriptIIKS(+/-)
T3/M13rev
T7/M13for（优先用M13F）
pBluescriptIISK(+/-)
T3/M13rev
T7/M13for
pBluescriptKS(+/-)
T3/M13rev
T7/M13for
pBluescriptSK(+/-)
T3/M13rev
T7/M13for
pET-12(-a,-b,-c)
T7
T7-Terminator
pET-14b
T7
T7-Terminator
pET-15b
T7
T7-Terminator
pET-16b
T7
T7-Terminator
pET-17b
T7
T7-Terminator
pET-17xb
T7
T7-Terminator
pET-19b
T7AT3-enhancer
RVP3
此载体无反向引物
pCDFDuet-1(MCSI)
ACYCDuetUP1 Primer
DuetDOWN1
pCDFDuet-1(MCSII)
DuetUP2
T7TER
pcDNA1.1
CMV-Profor,T7
pCDM8-3
pcDNA2.1
M13for/T7
EGFP-Nrev/ PEGFP-N-3′
pEGFP-C
PEGFP-C-5′
PEGFP-C-3′
pEGFP-C1
EGFP-Cfor
SV40-pArev
pEGFP-C2
EGFP-Cfor
SV40-pArev
pEGFP-C3
EGFP-Cfor
SV40-pArev
pEGFP-F
EGFP-Cfor
SV40-pArev
pAdEasy-1
not available
not available
pAdTrack-CMV
not available
not available
pAS2-1
GAL4 Bdfor/P24990
pGAL4-BDrv/P31430
pB42AD
pB42ADF
PB42ADR
pBABE
pBMN_5'
pBacPAK8
pDONR223
M13F
M13R
pDrive
T7/M13rev
SP6/M13for
pDsRED1-C1
(DsRed1-N-f)
DsRed1-C-r
pDsRed1-N1
CMV-Profor
RFP-Nrev,CMV-R?
pDsRed2-N1
(DsRed1-N-f)
DsRed1-C-r
pDsRed2-C1
(DsRed1-N-f)
DsRed1-C-r
pDsRED2-C1(KAN+)
pDsRED-ex-C1-F
pEGFP-N-3’
pDsRed-Express
dsRed1_N_primer/CMV-F
dsRed1_C_primer/CMV-R
pDSRED-monomer-N1(KAN+)
dsRed1_N_primer
pDSRED-N1(KAN+)
pEGFP-N-5’
pDSRED-N-R
pEASY-Blunt
M13F
T7/ M13R
pEASY-BluntSimple
M13F
T7/ M13R（距离插入位点合适，优先安排）
pEASY-T1 Simple
M13F
M13R（距离插入位点合适，优先安排）
pEASY-T1
M13F/T7
pcDNA3.3TOPOTA
CMV-Profor
TKPAreverse
pcDNA4/HisMax(_A,_B,_C)
Xpressfor
BGH rev
pcDNA4/HisMax-TOPO
Xpressfor
BGH rev
pcDNA4/HisMax-TOPO/lacZ
Xpressfor
BGH rev
pcDNA4/myc-His(_A,_B,_C)
pBudCE4.1(MCSII)
EF-1α Fwd
BGH
pBudCE4.1/lacZ/CAT
CMV-Profor,T7
c-mycrev,EBVrev
pBV220
pBV220F
PBV220R
pCAL-c
T7/Tac-Profor
T7-Terminator
pCAL-n
T7/Tac-Profor
T7-Terminator
T7/pEF-5
Pcdna3.1R/BGH rev