质粒测序引物设计
引物设计原则及酶切位点选择和设计
引物设计原则及酶切位点选择和设计：最初的时候，由于害怕设计酶切位点最后且不开，所以经常采用最通用的方法，用[整理]载体克隆解决问题，但后来发现她也有问题，就是浓度提不上去，你需要体大量的载体来T连入质粒中的重要目的酶切，所以感到还是直接扩增好一点。
但这就需要你仔细设计引物。
扩增出靶基因的时候在核就是进行酶切和连接，当然首先就是在想要合成或者是进行PCR可以在质粒的图谱说明书上酸的两端接入酶切位点，酶切位点是与你的质粒的特点相关的，找取相应的位点，进行设计。
（一）设计引物前应做的准备工作：准备载体图谱，大致准备把片断插在那个部分对片断进行酶切分析，确定一下那些酶切位点不能用准备一本所买公司的酶的商品目录，便于查酶的各种数据及两种酶是否可以配用（二）设计引物所要考虑的问题往往导致两个，所连接片断上没有这两个位点，且距离不能太近，两个位点应是载体上的，除非恰好是与上面两个酶在一起的酶切位点。
只能切一个，酶都切不好。
因此，紧挨在一起，还有一种情况是：不能有碱基的交叉，比如promega的说明书上说，最好隔四个。
我看AGATCTTAAG，这样的位点比较难切。
两个酶切点最好不要是同尾酶（切下来的残基不要互补），否则效果相当于单酶切。
最好使用酶切效率高的。
的酶。
最好使用双酶切有共同buffer最好使用自己实验室有的酶，这样可，ecor1等），最好使用较常用的酶（如hind3，bamh1以省钱。
的问题，很多的战友都有疑惑。
其实园子里有很多的解释了。
的计算，关于TmTm大家可以理解，双链溶解所需的温度。
即是DNA叫溶解温度（melting temperature, Tm），Tm因此，的溶解是没有作用的。
而不互补的区域对DNA 这个温度是由互补的DNA区域决定的，（除时，只计算互补的区域Tm才有贡献。
计算Tm只有和模板互补的区域对对于引物的Tm，过低，是因为他们误把保护碱。
不少战友设计的引物都Tm 非你的酶切位点也与模板互补）反应的诸多困难。
引物设计原则及酶切位点选择和设计
引物设计原则及酶切位点选择和设计[整理]：最初的时候，由于害怕设计酶切位点最后且不开，所以经常采用最通用的方法，用T载体克隆解决问题，但后来发现她也有问题，就是浓度提不上去，你需要体大量的载体来酶切，所以感到还是直接扩增好一点。
但这就需要你仔细设计引物。
连入质粒中的重要目的就是进行酶切和连接，当然首先就是在想要合成或者是进行PCR扩增出靶基因的时候在核酸的两端接入酶切位点，酶切位点是与你的质粒的特点相关的，可以在质粒的图谱说明书上找取相应的位点，进行设计。
（一）设计引物前应做的准备工作：准备载体图谱，大致准备把片断插在那个部分对片断进行酶切分析，确定一下那些酶切位点不能用准备一本所买公司的酶的商品目录，便于查酶的各种数据及两种酶是否可以配用（二）设计引物所要考虑的问题两个位点应是载体上的，，所连接片断上没有这两个位点，且距离不能太近，往往导致两个酶都切不好。
因此，紧挨在一起，只能切一个，除非恰好是与上面两个酶在一起的酶切位点。
我看promega的说明书上说，最好隔四个。
还有一种情况是：不能有碱基的交叉，比如AGATCTTAAG，这样的位点比较难切。
两个酶切点最好不要是同尾酶（切下来的残基不要互补），否则效果相当于单酶切。
最好使用酶切效率高的。
最好使用双酶切有共同buffer的酶。
最好使用较常用的酶（如hind3，bamh1，ecor1等），最好使用自己实验室有的酶，这样可以省钱。
Tm的计算，关于Tm的问题，很多的战友都有疑惑。
其实园子里有很多的解释了。
Tm叫溶解温度（melting temperature, Tm），即是DNA双链溶解所需的温度。
大家可以理解，这个温度是由互补的DNA区域决定的，而不互补的区域对DNA的溶解是没有作用的。
因此，对于引物的Tm，只有和模板互补的区域对Tm才有贡献。
计算Tm时，只计算互补的区域（除非你的酶切位点也与模板互补）。
不少战友设计的引物都Tm过低，是因为他们误把保护碱基和酶切位点都计算到Tm里了，最后的结果是导致了PCR反应的诸多困难。
质粒目的基因插入及引物设计流程
二. 登录/order/catalog/product/V652020?ICID=search-product 找到质粒的全序列
同样将该质粒序列粘贴至软件中，比较目的基因和质粒的多克隆位点（即酶切位点）
1.质粒选择酶切位点的原则：目的基因上不能存在将要使用的酶的酶切位点， 否则目的基因会被切掉；
https:///mol-bio-reference/genetic-code/
三.克隆引物设计 1. 电脑设计：回到NCBI的primer blast，拷贝目的基因CDS序列(共1602个碱基)， 在框中输入>|a|和CDS序列，并在Min 和Max分别输入1602（表示blast CDS全部基因）；
2. 质粒上选择酶切位点应该尽可能短，为将来其他可能的克隆预留位置，如本实验质粒 选择Aflll和BamH1，目的基因上均不存在酶切位点，实验室也买了，可用：
选中目的基因列插入目的基因序列，并选择features给插入的目的基因命名UGT1A1
在目的基因的终止密码子TGA前还需再加上HA tag标签（阳性对照蛋白，即质粒转染并成 功表达的话，该段蛋白必定存在，可用WB测出），标签序列登录addgene官网查询：
一.寻找目的基因mRNA序列及CDS阅读框（蛋白质对应的基因序列）
1.选中CDS开发阅读框（表达蛋白的序列）基因序列，共162个碱基； 2. 注意CDS特征，前段非编码区如果太长，需要增加保护序列；后端非编码区如果长， 则说明CDS序列稳定可用；
将查到的CDS序列粘贴至new DNA file框中，选择linear类型DNA，软件即可自动分析该 段序列中的可能酶切位点
构建表达载体的一般流程：
设计primer(如上所述，综合考虑HA，CDS序列)→合 成引物→选择合适的样本细胞 （本实验的UGT1A1为肝脏中存在的一种药物代谢酶， 因此最好选择肝脏细胞系），提取
质粒测序引物（DOC）
p B42ADF p BMN_5' BAC1 p BAD-F p BAD-5' T3/M 13rev p BD-GAL4-F 35S GAL4-Bdfor M 13F/T7 T3/M 13rev T3/M 13rev T3/M 13rev T3/M 13rev PBRforBam p BRforEco PBRforBam PBRforBam GAL4-Bdfor not available T3/M 13rev T7 T3 CM V-Profor,T7 EF-1α Fwd CM V-Profor,T7 p BV220F T7/Tac-Profor
p DSRED-N-R T7/ M 13R T7/ M 13R（距离插入位点合适， 优先安排） M 13R（距离插入位点合适，优 先安排）
p EASY-T 1 p EASY-T 3 p ECFP-N(C) p EF/my c/cyt o/ER/mit o/nuc p EF1(4,6/my c-His) p EF1(4,6/V5-His) p EF1(4;6/His_A;_B;_C) p EF5/FRT /V5-D(-T OPO) p EGFP p EGFP-1 p EGFP-C p EGFP-C1 p EGFP-C2 p EGFP-C3 p EGFP-F p EGFP-N p EGFP-N1 p EGFP-N2 p EGFP-N3 p ENT R p ET -11(-a,-b,-c,-d) p ET -12(-a,-b,-c) p ET -14b p ET -15b p ET -16b p ET -17b p ET -17xb p ET -19b p ET -20b(+) p ET -21(-a,-b,-c,-d)(+) p ET -22b(+) p ET -23(-a,-b,-c,-d)(+) p ET -24(-a,-b,-c,-d)(+) p ET -25b(+) p ET -26b(+) p ET -27b(+) p ET -28a(-b,-c)(+) p ET -29a(-b,-c)(+) p ET -3(-a,-b,-c,-d) p ET -30_Ek/LIC p ET -30_Xa/LIC p ET -30a(-b,-c)(+) p ET -31b(+)
引物设计原则及酶切位点选择和设计
引物设计原则及酶切位点选择和设计［整理］:最初的时候，由于害怕设计酶切位点最后且不开，所以经常采用最通用的方法，用T载体克隆解决问题，但后来发现她也有问题，就是浓度提不上去，你需要体大量的载体来酶切，所以感到还是直接扩增好一点。
但这就需要你仔细设计引物。
连入质粒中的重要目的就是进行酶切和连接，当然首先就是在想要合成或者是进行PCR扩增出靶基因的时候在核酸的两端接入酶切位点，酶切位点是与你的质粒的特点相关的，可以在质粒的图谱说明书上找取相应的位点，进行设计。
（一）设计引物前应做的准备工作：准备载体图谱，大致准备把片断插在那个部分准备一本所买公司的酶的商品目录，便于查酶的各种数据及两种酶是否可以配用（二）设计引物所要考虑的问题两个位点应是载体上的，，所连接片断上没有这两个位点，且距离不能太近，往往导致两个酶都切不好。
因此，紧挨在一起，只能切一个，除非恰好是与上面两个酶在一起的酶切位点。
我看promega的说明书上说，最好隔四个。
还有一种情况是：不能有碱基的交叉，比如AGATCTTAAG,这样的位点比较难切。
两个酶切点最好不要是同尾酶（切下来的残基不要互补），否则效果相当于单酶切。
最好使用酶切效率高的。
最好使用双酶切有共同buffer的酶。
最好使用较常用的酶（如hind3, bamhl, ecorl等），最好使用自己实验室有的酶，这样可以省钱。
Tm的计算，关于Tm的问题，很多的战友都有疑惑。
其实园子里有很多的解释了。
Tm叫溶解温度（melting temperature, Tm），即是DNA双链溶解所需的温度。
大家可以理解，这个温度是由互补的DNA区域决定的，而不互补的区域对DNA的溶解是没有作用的。
因此，对于引物的Tm，只有和模板互补的区域对Tm才有贡献。
计算Tm时，只计算互补的区域（除非你的酶切位点也与模板互补）。
不少战友设计的引物都Tm过低，是因为他们误把保护碱基和酶切位点都计算到Tm里了，最后的结果是导致了PCR反应的诸多困难。
构建重组质粒基本方法
构建重组质粒基本方法重组质粒是一种重要的遗传工程工具，用于将外源基因导入到宿主细胞中，从而实现特定基因的表达与功能研究。
构建重组质粒的基本方法可以概括为：选择质粒骨架、引物设计与合成、PCR扩增外源基因片段、DNA连接与重组、质粒扩增与提取、质粒鉴定与筛选，以下分别进行详细介绍。
一、选择质粒骨架在构建重组质粒时，首先需要选择一个合适的质粒骨架。
质粒骨架是指一个可复制的质粒DNA分子，常见的质粒骨架有pUC、pBR322、pET等。
质粒骨架上通常包含有宿主细胞可以识别的起始子和起始子附近的终止子，用于启动和终止转录过程，同时还包含选择标记基因，如抗生素抗性基因，以及其他在分子克隆中常用的诸如多克隆位点、限制酶切位点等。
二、引物设计与合成在构建重组质粒时，需要利用引物来扩增并克隆外源基因片段。
引物一般是两条DNA可控引物，其中一条是正向引物，另一条是反向引物。
引物的设计需要注意以下几点：引物的长度通常为15-30个碱基对，引物应该具有合适的Tm值，并且在引物双链的末端至少有2个碱基对是纯G或纯C。
引物可以使用商业引物合成公司合成。
三、PCR扩增外源基因片段使用引物扩增外源基因片段是构建重组质粒的一个关键步骤。
PCR反应一般包括DNA模板、引物、dNTPs和DNA聚合酶。
根据需要，可以使用特异性引物对目标基因进行PCR扩增，然后通过凝胶电泳检查PCR产物长度和纯度，并使用PCR产物进行下一步处理。
四、DNA连接与重组将PCR扩增得到的外源基因片段与质粒骨架进行连接和重组。
连接通常通过使用限制酶切和连接酶来实现。
限制酶切是利用限制酶切剪切DNA，生成具有互补粘性末端的DNA片段，然后将外源基因片段与质粒骨架进行连接。
连接酶可以使DNA片段之间的末端骨架参与phosphodiester结合反应，从而形成连体分子。
五、质粒扩增与提取将重组质粒转化到宿主细胞中，通过培养和培养基筛选来扩增质粒。
质粒扩增一般在含有抗生素的琼脂糖平板上进行，抗生素可以选择对宿主细胞有毒作用但不对重组质粒有毒的抗生素。
载体构建质粒构建步骤有哪些？
载体构建质粒构建步骤有哪些？载体构建过程：1、引物设计2、⽬的⽚段选取：RNA提取、RNA反转录、PCR扩增、PCR产物纯化3、双酶切4、连接:T4 DNA ligase连接或者同源重组连接（新贝⽣物：#B101、#B102）5、转化6、菌落PCR7、测序：1)摇菌；2)送样; 3)⽐对；8、菌种保存：菌种⽐对成功，则可保存菌种备⽤。
9、质粒提取：菌种⽐对成功，冻存菌种后，菌液⽤于提取质粒。
⼀、载体构建基本原理分、切、连、转、筛1、分：分离出要克隆的⽬的基因及载体。
2、切：⽤限制性内切酶切割⽬的基因和载体，使其产⽣便于连接的末端。
限制性内切酶：是⼀类能识别双链DNA中特定碱基顺序的核酸⽔解酶。
限制性核酸内切酶根据识别切割特性，催化条件及是否具有修饰酶活性分为三⼤类。
其中Ⅱ型酶能识别双链DNA的特异顺序，并在这个顺序内切割，产⽣特异性DNA⽚段，是DNA 重组技术中常⽤的酶。
Ⅰ型酶：具有修饰和切割功能，⽆固定切割位点Ⅲ型酶与Ⅰ型类似，能识别特异位点，但切割位点在识别位点以外Ⅱ型酶特点：①识别顺序⼀般为4－6个碱基对②识别顺序具有180度的旋转对称性，呈完全的回⽂结构③Ⅱ型酶对双链DNA两条链同时切割，可产⽣两种不同末端：平末端，粘末端平末端：在识别顺序的对称轴上，对DNA同时切割形成平末端，如：SmaI5’－CCC GGG－3’ 5’－CCC GGG－3’3’－GGG CCC－5’ 3’－GGG CCC－5’5′突出粘末端：在识别序列的两侧末端切割DNA双链，于对称轴的5 ′末端切割产⽣5 ′端突出的粘性末端，如：Hind Ⅲ5’―AAGCTT―3’ 5’― A 5’－AGCTT―3’3’―TTCGAA―5’ 3’― TTCGA－5’ A―5’3′突出粘末端:与5′突出粘末端作⽤相反，产⽣3 ′端突出粘末端，如：PstI5’―CTGCAG―3’ 5’―CTGCA－3’ G―3’3’―GACGTC―5’ 3’―G 3’－ACGTC―5’3、连：将切割后的⽬的基因和载体⽤T4 DNA连接酶连接或者同源重组⽅法连接。
质粒和PCR产物测序
DNA（质粒和PCR产物）测序操作程序一、P CR反应体系标准反应体系（20 μL）试剂用量DNA X μL（根据模板确定）BigDye 8 μL引物 (3.2 pmol / μL) 1 μL灭菌去离子水补充到20 μL总体积20 μL优化反应体系（10 μL）试剂用量DNA X μL （根据模板确定）BigDye 2 μL引物 (3.2 pmol / μL) 1 μL灭菌去离子水补充到20 μL总体积10 μL测序PCR热循环条件：96 ︒C 1 min96 ︒C 10 se50 ︒C 5 sec x 25个循环60 ︒C 4 min4 ︒C保温二、测序产物纯化：10 μL反应体系，384孔板，酒精/EDTA/NaAc法1.每管加入1 μL 125 mM EDTA到管底，每管加入1 μL 3M NaAc到管底。
2.每管加入25 μL 100%酒精，铝箔封严密，震荡混匀4次，室温放置15 min。
3.1400-2000 x g离心45 min 或者2000-3000 x g离心30 min，马上倒置384孔板，离心至185 x g 停止离心（从离心机启动到达到185 x g停止离心总共1 min时间）。
4.每管加入35 μL 70% 酒精，1650 x g 4 ︒C离心15 min；马上倒置384孔板，离心至185 xg 停止离心（从离心机启动到达到185 x g停止离心总共1 min时间）。
5.重复第4步1次。
6.室温挥发净酒精，加入10 μL Hi-Di Formamide溶解DNA；或者铝箔密封后于4 ︒C保存。
7.溶解后的样品需要在 95 ︒C变性4 min，迅速置冰中冷却4 min后，上样电泳。
三、测序产物纯化：单离心管法请参照20 μL反应体系，96孔板，酒精/EDTA/NaAc法操作，只需要将“倒置96孔板，离心至185 x g 停止离心”这一操作改为用枪吸尽上清液。
1.每管加入2 μL 125 mM EDTA到管底，每管加入2 μL 3M NaAc到管底。
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质粒测序引物设计
随着基因研究的不断深入，质粒测序成为了分析基因信息的重要工具之一，同时，为了获得更真实、更准确的序列，准确设计序列特异性强的引物是非常重要的。
本文将重点讲述质粒测序所需的引物设计流程及其注意事项，以期为大家提供参考。
1. 引物设计的基本原则引物是一种在PCR反应体系中使DNA聚合酶特异性扩增所需的寡核苷酸。
正确认识引物的作用和特点，对于准确设计合适的引物具有很重要的意义。
引物的主要特点有以下几个方面：
（1）序列特异性：引物应特异性地与目标序列结合，确保扩增出的片段为所需的序列，而非与其它非靶DNA结合。
（2）稳定性：使其与模板DNA的双链DNA进行稳定的配对。
（3）温度特异性：引物与模板结合的温度应该略低于生产它们的反应体系的温度。
基于以上特点，我们需要基于引物设计的原则进行质粒测序引物的设计。
具体来说，主要考虑以下几个方面：（1）序列特异性：引物应设计成特异性的，避免产生与目标序列无关的PCR产物。
其特异性应通过序列比对和BLAST进行验证，以确保最终设计出的引物能够对所需的目
标序列特异性扩增。
在引物设计时，还应注意要在引物中避开GC/AT区域和重复序列的部位。
（2）长度优化：引物的长度应该合适，过短容易导致扩增不全，过长则容易出现引物间的竞争关系，同时也容易产生温度特异性方面的问题。
一般来说，引物长度应该控制在20个核苷酸左右，但是对于某些特殊的情况，比如复杂基因组、高度变异基因等，可能需要设计更长的引物。
（3）序列特征：引物中不应含有重复结构、长程序列、寡聚物或者常见的RNA序列，这些都可能导致不特异扩增、引物二聚或聚合酶滞留等问题。
2. 引物设计流程
在对质粒进行测序之前，需要先设计合适的引物，紧密契合上述引物设计原则，具体流程如下：
（1）数据获取：首先需要获取目标DNA序列，并确定所需要进行的PCR扩增区域。
（2）引物设计：根据目标区域，按照上述设计原则进行引物的设计。
一般来说，可以利用一些公共的软件或者在线工具进行引物设计，比如Primer 3、OligoCalc、Primer Premier等。
（3）引物评估：设计好的引物需要进行验证，包括序列特异性、设计可靠性等方面。
可以利用序列比对、
BLAST、熔解曲线分析、三维结构分析等手段进行引物的评估。
如果存在不确定因素，还需要进行实验验证，可以利用端点PCR、荧光比色PCR、分子条带电泳等方法进行验证。
（4）引物改进：如果引物设计后出现问题，如存在非特异扩增产物、引物JC值过高等情况，可以通过引物的结构调整、长度变化、位置调整等手段进行引物的改进。
3. 引物设计注意事项
引物设计在实际应用中也存在一些值得注意的问题，具体来说主要有以下几个方面：
（1）检查引物特异性：在引物设计过程中，我们需要对每个引物的特异性进行检查，确保设计的引物可以特异性扩增所需的目标序列。
（2）定量引物浓度：在实际操作中，我们需要按照一定的比例来定量引物浓度。
如果引物的浓度过低，则可能导致扩增效率不高，产物浓度不够；如果引物的浓度过高，则可能出现引物之间的竞争关系，甚至会出现非特异性扩增产物。
（3）注意引物之间的互相作用：引物在反应体系中会相互作用，如果引物之间的互相作用过强，那么就可能会导致非特异性扩增产物产生，这时候需要调整引物浓度的配比。
总之，在进行质粒测序的过程中，引物的设计是一个比较关键的步骤，合理、科学的引物设计可以获得更加稳定、可靠的实验结果，对于我们理解基因信息具有很大的帮助。