微生物基本操作规范(4)接种、分离纯化
图4-5 倾注平板法（a）涂布平板法（b）图解
1.菌悬液 2.熔化的培养基 3.培养物 4.无菌水
稀释倒平板和涂布法
4.2.6涂布平板法
首先把微生物悬液通过适当的稀释， 取一定量的稀释液放在无菌的已经凝固的 琼脂平板上，然后用灭菌的L型玻璃棒把稀 释液均匀地涂布在培养基表面上，Байду номын сангаас恒温 培养后即可观察。（图4-5 b）
4.1.1接种工具
图4-1 接种和分离工具
1．接种针 2.接种环 3.接种钩 4.5.玻璃涂棒 6.接种圈 7.接种锄 8.小解剖刀
4.1.2无菌操作
培养基经高压灭菌后，用经过灭菌 的工具（如接种针和吸管等）在无菌条 件下接种含菌材料（如样品、菌苔或菌 悬液等）于培养基上，这个过程叫做无 菌接种操作。 在实验室检验中的各种接种必须是 无菌操作。
4.将已灭菌的接种环伸入菌种管中，从斜面上 取菌少许，迅速伸入待接种的培养基管中， 在斜面底部向上划一条直线，然后从底部起 向上作曲折连续划线，直至斜面上方顶端。 5.取出接种环，火焰灭菌管口，塞上棉塞（先 塞内管）；最后将接种环经火焰灭菌放好。 6.做好标识，置35℃培养 箱中培养18~24小时。 斜面培养一般形成均匀一 致的菌苔。一般可观察表 面、透明度、色泽等特征。
菌落形态观察
1)大小:以mm表示。菌落的大小随细菌种类、 培养基及培养时间等条件而不同。同一种细 菌在同一平板上，在密集处的菌落比疏散处 小。因此，表示菌落大小时，应注明培养基 名称。一般以培养18~24小时后，选散在处的 菌落大小。1mm左右为小菌落；2~3mm为中 等大；3mm以上为大菌落。 2)形状及边缘：圆形、不规则、放射状、树根 状、边缘整齐、波形、锯齿状、卷发状等。 3)隆起：平的、突起的、凸面的、凸形的等。 4)表面：光滑（S型）、粗糙（R型）；有无光 泽等。
5)构造:均匀、露滴状、颗粒状、发状、皱招状等。 6)颜色：无色、白色、灰色、灰白色或乳白色、荧 光绿、金黄色、柠檬色、红色等、 7)透明度：透明、半透明、不透明、微透明等。 8)硬度：硬、软、干燥、湿润，是否附着于培养基 上或嵌入培养基内不易刮取。 9)质地：脂状、粘液状、膜状等。 10)乳化性：在盐水中研磨是否形成均匀乳剂或颗 粒状。 11)溶血性：在血平板上，菌落周围有无溶血环。
3.方格划线法
将培养物涂布于平板上1/5处，接种环经 火焰灭菌后，自1/5划线处作平行划线5~6条， 将接种环灭菌后，划垂直线5~6条，使呈正方 形格。其他操作同前。
细菌在固体培养基表面只能在固定的 地方生长繁殖，经过一定的培养时间后， 可形成肉眼可见的菌落。菌落中只含有一 种细菌，而每种细菌的菌落各有其特征。 菌落形态往往有助于初步识别细菌；还可 以由此获得细菌而进行一系列的鉴定。 识别菌落的能力是从事微生物检验人 员的极为重要的基本功。
接种时，打开培养皿的时间应尽量短。用于接 种的器具必须经干热或火焰等灭菌。 接种环的火焰灭菌方法：通常接种环在火焰上 充分烧红（接种柄，一边转动一边慢慢地来回通过 火焰三次），冷却，先接触一下培养基，待接种环 冷却到室温后，方可用它来挑取含菌材料或菌体， 迅速地接种到新的培养基上。然后，将接种环从柄 部至环端逐渐通过火焰灭菌，复原。不要直接烧环， 以免残留在接种环上的菌体爆溅而污染空间。 平板接种时，通常把平板的面倾斜，把培养皿 的盖打开一小部分进行接种。在向培养皿内倒培养 基或接种时，试管口或瓶壁外面不要接触底皿边， 试管或瓶口应倾斜一下在火焰上通过。
a.发育程度：有无生长、微弱、中等、旺盛。 b.混浊度：有无及程度（混、中等、微混、透明）、均匀混浊、 有颗粒、絮状生长。 c.沉淀:有无及量多少、性状（粉状、颗粒状、絮状、沾性）。 d.表面：有无生长、性状（膜状、环状）、菌膜厚薄及表面特征 （光滑、颗粒、皱状）。 e.其他：有无特殊气味，色素。如果是糖发酵培养基则主要观察 是否产酸和有无气体。
4.2.4 穿刺接种法
多用于保存菌种、观察动力及厌氧培养等 也可以用于观察细菌的某些生化反应。 1.如斜面接种法持好菌种管及培养基管。 2.以灭菌接种针从菌种管取菌，垂直刺入培养基 的中心（半固体或一般琼脂高层）直达近管底 部（但不能完全刺到管底），接种针应沿原路 退出。 3.经培养后半固体培养基可观察到：沿穿刺线生 长，线外的培养基清亮表示细菌无动力；穿刺 线模糊不清，或沿穿刺线向外扩散生长，或整 个培养基混浊表示细菌有动力。
食品微生物检验 规范操作基础培训
4 接种、分离纯化
福建出入境检验检疫局技术中心食品所微生物实验室 2010.05
主要内容：
§
1 § 2 § 3
§
§
清洗、消毒和灭菌操作 培养基的制备 采样和取、制样
4
接种、分离纯化
制片、染色及显微观察 实验室安全基础知识
5 § 6
§4接种、分离纯化
4.1接种 将微生物接到适于它生长繁殖的人 工培养基上或活的生物体内的过程叫做 接种。
图4-3 细菌的培养特征 1.点状 2.圆形 3.丝状 4.不规则形 5.假根状 6.纺锤状 7.扁平 8.隆起 9.凸起 10.垫状 11.脐状 12.边缘整齐 13.波状 14.裂片状 15.啮蚀状 16.丝状 17.卷发状 18.丝线状 19.刺毛状 20.串珠状 21.疏展状 22.树根 状 23.假根状 24.丝状 25.串珠状 26.乳头状 27.绒毛状 28.树根状 29.量杯状 30.萝卜状 31.漏斗状 32.囊状 33.层状 34.絮状 35.环状 36.蹼状 37.膜状
4.2.2 斜面接种法
主要用于经划线分离培养所获得的单个菌 落的移种，以及观察细菌的某些培养特征。 以菌种移种为例，其接种方法是： 1.取一菌种管和培养基管，置左手食指、中指、 无名指间，拇指压住两管底部上侧面，使菌 种管位于外侧，培养基管位于内侧。 2.右手拇指和食指分别旋松两管棉塞。火焰灭菌 接种环。 3. 以右手小指与手掌，小指与无名指分别夹取 棉塞（先外管后内管），将两管口迅速通过 火焰1~2次。
图4-4 斜面接种时的无菌操作 (1)接种灭菌 (2)开启棉塞 (3)管口灭菌 (4)挑起菌苔 (5)接种 (6)塞好棉塞
4.2.3 液体接种法
1.如斜面接种法持好菌种管及培养基管。 2.灭菌接种环，从菌种管取菌，伸入培养基管中，在接近 液面的管壁上方轻轻研磨，并沾取少许培养基液体调和， 使细菌混合于培养基的液体中。液体培养基一般以 18~24小时培养后观察生长特征。 肉汤培养可观察如下几项：
图4-2 平板划线分离法 1.斜线法 2.曲线法 3.方格法 4.放射法 5.四格法
1.曲线划线分离法
1)先将接种环火焰灭菌,待冷后取培养物少许; 2) 左手拿起平板，以中指为支点，并用拇指和 食指将平板盖打开； 3)右手迅速将取有培养物的接种环从打开的空 间插入平板内，使接种环与培养基表面呈 45℃角，在酒精灯上方5~6cm处划线接种。先 在平板上1/5处轻轻涂布，然后即可左右来回 以曲线形式作连续划线接种，线与线间留有 适当距离，将整个平板表面划满曲线； 4)注明标识后，置35℃培养箱中培养，一般在 18~24小时后观察结果。
4.2接种法与纯培养的分离技术
含有一种以上的微生物培养物称为 混和培养物（Mixed culture）。 如果在一个菌落中所有细胞均来自 于一个亲代细胞，那么这个菌落称为纯 培养（Pure culture）。 在进行菌种鉴定时，所用的微生物 一般均要求为纯的培养物。得到纯培养 的过程称为分离纯化。
4.2.1平板划线分离培养法
平板划线分离培养法，用无菌的接种环取培养 物少许在平板上进行划线，使培养物中混在的多种 细菌在培养基表面分散生长，各自形成菌落，根据 菌落的形态及特征，挑选单个菌落，经过移种而获 得纯种细菌（纯培养）。 分离细菌的方法很多，最常用的是平板划线分 离法。根据划线的方式不同有斜线法、曲线法、方 格法、放射法、四格法等。（图4-2）
4.2.5倾注平板法
首先把微生物悬液通过一系列稀释，取 一定量（1mL）的稀释液加入已熔化并冷却至 45~50℃的15mL（使用直径90mm的平皿时）普 通琼脂管中，立即摇匀，趁琼脂未凝固前倾 注于已灭菌的平皿中，待凝固之后，将平板 倒置在培养箱中培养。 （图4-5 a） 培养后观察，细菌大部分分散于琼脂层 内，形成深层菌落，有一部分可生长于表面。
2.斜线(分区)划线分离法
1)用接种环先将培养物涂布于平板1区并作数次 划线,再在2、3……区依次划线。 2)每划完一个区域，均将接种环灭菌一次，待冷 后再划下一区域。 3)每一区域的划线均接触上一区域的接种线1~2次， 使接种量逐渐减少，以获得单个菌落。 4)其他操作与上述曲线划线分离法相同。
斜线接种示意图
4.3.2 微生物的培养方法
根据培养时是否需要氧气，可分为：
1.好氧培养：
(1)固体表面培养法 ：斜面、培养皿、克氏瓶等 (2)液体培养法：静止、摇瓶振荡
2.厌氧培养：
(1)深层穿刺培养 (2)化学吸氧与深层穿刺相结合 (3)抽气法：干燥器、简易的真空和气体交换法、厌氧罐
谢谢！
4.3 微生物的培养
研究和鉴定细菌时所提到细菌的特征指的是细菌 菌落的特征，而不是单个细菌的特征。大量食品微 生物的质量检测是对可见菌株的检测，现在衍变到 给待检测细菌提供适当的条件使之代谢繁殖后再进 行检测。因此在细菌学研究中，最基本的要求是有 能促使单个细菌生长和繁殖的物质和方法。能给细 菌提供适当生长环境的营养物质称为培养基。 根据接种培养方式的不同，可将培养基以多种形 式分装到试管、三角瓶或螺帽瓶中，试管或三角瓶 的瓶口可用适当的棉塞、金属帽、塑料帽等盖紧。 螺帽的优势是能够阻止蒸汽蒸发，避免培养基在保 存过程中干燥。
4.3.1 培养的类型
1.液体批量培养：在液体培养基中培养，培养过程不 需要加入新的培养基。 2.琼脂斜面培养：在试管中装入约5mL固体培养基融 化后摆成斜面冷却。将接种物涂布到斜面或用接种 环在斜面上划线。 3.穿刺培养：将含琼脂培养基的试管或瓶子垂直放置， 使培养基凝固，用接种针挑取少量接种物垂直穿入 至容器的中部。 4.半固体培养：菌株生长的培养基含有足够的琼脂 （0.02%~0.3%）使其有一定的黏度，但却没有完全 固化。 5.振荡培养：用摇床进行微生物振荡培养。 6.平板培养：平板划线法、倾倒平皿法。
微生物的分离纯化综合实验
一、实验方案
1. 实验现象与结果
2. 本实验的关键环节及改进措施
⑴、接种环的灭菌操作要到位:接种环使用前, 直接在酒精灯上烧灼灭菌, 把环和金属丝烧红即可。
接种环使用后, 先在火焰周围把环上标本烤干, 再烧灼灭菌, 以免标本汽化, 爆烈四溅, 污染环境。
金属杆快速通过火焰2－3次, 杀灭表面微生物。
⑵、划线技术要很娴熟,具体要求参照上图。
⑶、整个过程要严格防止实验中被污染,每个阶梯稀释换新的移液管,要等平板冷却后再倒置。
思考题
1.食品中微生物为何繁殖迅速、种类繁多？
2.食品被微生物污染后有哪些危害？
3、检样稀释时, 每个稀释度都要更换刻度吸管, 为什么？
1.答:因为食品中含有大量的淀粉、蛋白质、糖类、脂肪等有机物, 且无机盐含量相对较低, 食品中含有一定的水分, 并且食品包装后容易使内部升温, 这些都是很适合微生物(细菌、原虫、病毒)生长繁殖的情况, 因此食品中的微生物能够繁殖迅速且种类繁多。
所以很多食物要严格灭菌或者添加防腐剂、干燥剂、脱氧剂等, 或者真空包装。
2.答:⑴、降低食品的营养；
⑵、引起食品腐败变质；
⑶、引起呕吐、中毒或者某些疾病(如痢疾、腹泻、呼吸道感染等)和潜在性的慢性危
害等。
3.答: 每个稀释度都要更换刻度吸管可以在一定程度上保证不会沾有上一个稀释度得溶液, 且减少污染, 使浓度稀释得更加准确, 增加实验结果的准确性。
指导教师评语及评分:
签名: 年月日。
微生物的基本操作方法
微生物的基本操作方法
微生物的基本操作方法包括以下几个方面：
1. 无菌操作：在进行微生物实验或培养时，需要保持操作环境的无菌。
操作者应注意洗手、穿戴实验服、戴手套，并在无菌工作台或无菌室内进行操作。
可用酒精灯或紫外线灯消毒操作区域，以杀灭空气中的微生物。
2. 培养基的制备：根据所需的微生物类型选择适当的培养基，并按照配方制备。
培养基通常包括基础培养基、食物源、pH调节剂和琼脂等成分。
制备时需要称取和溶解成分，并用高压蒸汽或高温灭菌来杀灭培养基中的微生物。
3. 培养器具的消毒：使用前要对培养器具进行消毒处理，常用的方法有高压蒸汽灭菌、高温灭菌、紫外线消毒等。
确保培养器具的表面和内部都不带有致病菌。
4. 菌种的接种：将所需的菌种接种到培养基上。
通常使用接种环、接种针或接种环针进行接种。
在接种时要注意无菌操作，以避免外来细菌的污染。
5. 培养条件：对于每一种微生物，根据其生长特性和要求，设置适当的培养条件。
例如，合适的温度、湿度、pH值和氧气浓度等都会影响微生物的生长。
6. 培养观察：在培养过程中，定期观察微生物的生长情况。
可以使用显微镜观察细菌或酵母菌的形态，或者通过目测观察细菌悬浊液的浑浊度和沉淀情况来判
断微生物是否生长良好。
7. 分离纯化：将培养基上生长的微生物单克隆分离纯化，得到纯系菌株。
通常可以使用藻糖水平板或琼脂斜面触点法进行分离，将不同的菌落孤立开来。
8. 培养维持：根据微生物的生长要求，每隔一段时间更换培养基、条件，以保持微生物的生长和繁殖。
同时，也需要妥善保存纯化的菌株，以备后续实验使用。
实验二微生物的分离、纯化和接种
实验二微生物的分离、纯化和接种微生物的分离、纯化1、目的要求1.1了解微生物分离和纯化的原理1.2掌握常用的纯化分离微生物的方法2、基本原理从混杂的微生物群体中获得只含有某一种或某一株微生物的过程称为微生物的分离与纯化。
本实验采用平板分离法：该方法操作简便，普遍用于微生物的分离与纯化。
其基本原理是选择适合于待分离微生物的生长条件，如营养成分、pH值、温度和溶解氧等要求，或者加入某种抑制剂造成只利于该微生物生长，而抑制其它微生物生长的环境，从而淘汰一些不需要的微生物。
微生物在固体培养基生长形成的单个菌落可以是一个细胞繁殖而成的集合体，因此可通过挑取单菌落而获得一种纯培养。
获得单个菌落的方法可通过稀释涂布平板或平板划线等技术来完成。
而纯培养的确定除观察其菌落特征外，还要结合显微镜检测个体形态特征后才能确定，有些微生物的纯培养要经过一系列分离与纯化过程和多种特征鉴定才能得到。
本实验将在混合有几种微生物菌液中分离纯化出两种微生物来。
3、实验材料3.1培养基肉汤培养基（固体）。
3.2溶液或试剂盛4.5ml无菌水的试管，其中有一只盛有玻璃珠。
3.3仪器或其他用具无菌玻璃涂棒，无菌吸管，接种环，无菌培养皿，涂布器等。
4流程倒平板制备梯度稀释液涂布（或划线法）培养挑单菌落保存。
5、步骤5.1平板划线分离法5.1.1倒平板倒平板的方法：右手持盛培养基的试管或三角瓶置火焰旁边，用左手将试管塞或瓶塞轻轻地拔出，试管或瓶口保持对着火焰；然后左手拿培养皿并将皿盖在火焰附近打开一缝，迅速倒入培养基约15ml,加盖后轻轻摇动培养皿，使培养基均匀分布在培养皿底部，然后置于桌面上，待凝固后即成平板(教材p367图13-14)。
并用记号笔标明培养基名称、菌液编号和试验日期。
5.1.2划线在近火焰处，左手拿皿底，右手拿接种环，挑取菌悬液一环在平板上划线(教材p367图13-15)。
划线的方法很多，但无论采用哪种方法，其目的都是通过划线将样品在平板上进行稀释，使之形成单个菌落。
实验二微生物的分离、纯化和接种
实验二微生物的分离、纯化和接种微生物的分离、纯化1、目的要求1.1了解微生物分离和纯化的原理1.2掌握常用的纯化分离微生物的方法2、基本原理从混杂的微生物群体中获得只含有某一种或某一株微生物的过程称为微生物的分离与纯化。
本实验采用平板分离法：该方法操作简便，普遍用于微生物的分离与纯化。
其基本原理是选择适合于待分离微生物的生长条件，如营养成分、pH值、温度和溶解氧等要求，或者加入某种抑制剂造成只利于该微生物生长，而抑制其它微生物生长的环境，从而淘汰一些不需要的微生物。
微生物在固体培养基生长形成的单个菌落可以是一个细胞繁殖而成的集合体，因此可通过挑取单菌落而获得一种纯培养。
获得单个菌落的方法可通过稀释涂布平板或平板划线等技术来完成。
而纯培养的确定除观察其菌落特征外，还要结合显微镜检测个体形态特征后才能确定，有些微生物的纯培养要经过一系列分离与纯化过程和多种特征鉴定才能得到。
本实验将在混合有几种微生物菌液中分离纯化出两种微生物来。
3、实验材料3.1培养基肉汤培养基（固体）。
3.2溶液或试剂盛4.5ml无菌水的试管，其中有一只盛有玻璃珠。
3.3仪器或其他用具无菌玻璃涂棒，无菌吸管，接种环，无菌培养皿，涂布器等。
4流程倒平板制备梯度稀释液涂布（或划线法）培养挑单菌落保存。
5、步骤5.1平板划线分离法5.1.1倒平板倒平板的方法：右手持盛培养基的试管或三角瓶置火焰旁边，用左手将试管塞或瓶塞轻轻地拔出，试管或瓶口保持对着火焰；然后左手拿培养皿并将皿盖在火焰附近打开一缝，迅速倒入培养基约15ml,加盖后轻轻摇动培养皿，使培养基均匀分布在培养皿底部，然后置于桌面上，待凝固后即成平板(教材p367图13-14)。
并用记号笔标明培养基名称、菌液编号和试验日期。
5.1.2划线在近火焰处，左手拿皿底，右手拿接种环，挑取菌悬液一环在平板上划线(教材p367图13-15)。
划线的方法很多，但无论采用哪种方法，其目的都是通过划线将样品在平板上进行稀释，使之形成单个菌落。
微生物培养及实验基本操作技术
微生物培养及实验基本操作技术一、培养基配制培养基是指人工配制的、适合于微生物生长繁殖或累积代谢产物所需的各种营养物的混合基质。
配制培养基是进行微生物检验工作的基础,甚至是任何与微生物有关工作的基础。
注意事項–灭菌锅的使用①加水盖过底部铁板—②放入东西—③关门—④調整溫度時間—⑤关紧泄压阀灭菌結束後，等压力降回零時才可打開門進入灭菌锅之物品，蓋子不可關太緊或太鬆拿滅菌後物品請記得帶耐熱手套培养基中的主要成分及其作用：营养物质：N源、C源、无机盐、生长因子、水常用的N源：蛋白胨、牛肉膏、肉浸汁、酵母膏常用的C源：糖、醇类物质（单糖：葡萄糖、果糖、半乳糖、甘露糖双糖：蔗糖、麦芽糖、乳糖；多糖：淀粉、纤维素、菊糖；醇类：甘露醇、卫茅醇、甘油）水：用蒸馏水，不能用自来水凝固剂：琼脂、明胶、血清等抑制剂：1、作用：鉴定细菌、抑制杂菌的生长繁殖，增加待检菌的检出率2、种类：盐类：氯化钠、氯化锂、氰化钾、亚碲酸钾（钠）、亚硒酸钠等染色剂类：煌绿、蔷薇酸、结晶紫、孔雀绿、孟加拉红、玫瑰红胆盐类：猪（牛、羊）胆盐、混合胆盐、三号胆盐、去氧胆酸盐、胆石酸盐抗菌素：青霉素、链霉素、杆菌肽、多粘菌素指示剂1、作用：用于指示鉴别细菌可否利用分解糖醇类物质和含氮化合物，产酸产碱的能力。
2、常用的指示剂：酚红、溴甲酚紫、中性红、中国蓝、甲基红、复红、伊红、美蓝、孔雀绿等。
培养基的类型：●根据培养基的物理状态来区分：1、液体培养基：主要用于增菌培养、鉴别性培养2、固体培养基：用作微生物的分离、鉴定、检验杂菌、计数、保藏、生物测定3、半固体培养基：观察微生物的动力，有时用来保藏菌种4、脱水(商品)培荞基：脱水培养基也称为商品培养基、预制干燥培养基。
●将各种营养成分按比例配制完全,制成脱水的干粉状,装瓶出售;使用时只需按比例加人定量的水溶化、灭菌便可。
●根据培养基的用途来区分：➢增殖培养基选择培养基鉴别培养基1、增殖培养基：在普通培养基中加入一些某种微生物特别喜欢的营养物质，以增加这种微生物的繁殖速度，逐渐淘汰其它微生物，这种培养基称为增殖培养基。
微生物的纯培养、分离纯化和平板菌落计数法
微生物的纯培养、分离纯化和平板菌落计数法姓名摘要：纯培养技术是进行微生物学研究的基础。
从混杂的微生物群体中获得只含有某一种或某一株微生物的过程称为微生物的分离与纯化。
平板菌落计数法是一种应用广泛的测定微生物生长繁殖的方法，其特点是能测出微生物样品中的活细胞数。
本实验通过稀释涂布平板法和平板划线分离法分离纯化微生物以获得纯培养并进行平板菌落计数，旨在了解微生物的纯培养含义和意义、熟练掌握倒平板的方法和几种常用的分离纯化微生物的基本操作技术、了解利用平板菌落计数法测定微生物样品中活细胞的原理、学习平板菌落计数的操作步骤与方法。
实验结果表明，本实验达到了预期的目的。
关键词：微生物的纯培养、微生物的分离与纯化、平板菌落计数法1.引言自然界中各种微生物混杂生活在一起，即使取很少量的样品也是许多微生物共存的群体。
人们要研究某种微生物的特性，首先须使该微生物处于纯培养状态。
也就是说培养物中所有细胞只是微生物的某一个种或株，它们有着共同的来源，是同一细胞的后代。
只有纯培养物才能提供可以重复的有意义的结果，纯培养技术是进行微生物学研究的基础。
形状稳定的纯培养（菌种）是微生物学工作最重要的基本要求，否则生产或科研都无法正常进行。
从混杂的微生物群体中获得只含有某一种或某一株微生物的过程称为微生物的分离与纯化。
使用显微操作器单细胞挑取法可以直接得到纯培养。
稀释涂布平板法、稀释混合平板法或平板划线法是分离和纯化微生物的常规方法。
后几种方法不需要特殊的仪器设备，一般情况下都能顺利进行，达到好的效果。
常用的方法有：（1）简易单细胞挑取法：它需要特制的显微操纵器或其他显微技术，因而其使用受到限制。
简易单孢子分离法是一种不需显微单孢操作器，直接在普通显微镜下利用低倍镜分离单孢子的方法。
它采用很细的毛细管吸取较稀的萌发的孢子悬浮液滴在培养皿盖的内壁上，在低倍镜下逐个检查微滴。
将只含有一个萌发孢子的微滴放一小块营养琼脂片，使其发育成微菌落。
细菌的分离纯化和接种实验
环工综合实验细菌得分离纯化与接种实验实验报告环境科学与工程学院实验中心实验原理问答题：１、为什么湖水用10－4、１0-5、10－6稀释液进行平板稀释分离而不用更高或者更低得浓度？答：因为在这三个浓度范围内能尽量使样品中得微生物分散开，使其成单个个体/细胞存在,否则一个菌落就不只就是代表一个个体生长而成得，从而方便计数。
2、为什么平板培养皿要倒置放入恒温箱中进行培养?答：第一，为了防止重力对菌落得生成产生影响;第二,为了防止培养基中得水分蒸发后凝结在壁上,滴落后影响菌得生长与形态观察;第三，防止培养基干涸。
３、微生物常用接种方式有哪些?进行微生物接种应该注意哪些方面?答:⑴划线接种，涂布接种，穿刺接种,三点接种,浇混接种，液体接种,注射接种,活体接种等。
⑵接种用具及培养基等均需灭菌处理,接种过程必须在煤气灯旁进行,接种环、玻璃涂棒等器具要过火处理，把所要用到得器材与菌种培养基有序编号放置,操作时应避免已经灭菌处理得材料用具与周围得物品得接触，往培养基就是划线或点菌时动作要轻以防把培养基划破等。
四、实验步骤１、制备细菌稀释液:ﻭ使用5mｌ移液管加４、5ｍl无菌水放入贴有10—3、１0—4、10－5、10-6标签得小试管中,用一根1ml得无菌移液管吸取１0-2得湖水稀释液0、5ml放入贴有1０-３标签得小试管中，1ｍl得无菌移液管吸洗三次以混匀。
然后用另外一支1ｍl得无菌移液管从贴有１0-３标签得小试管中吸取10-3得湖水稀释液0、5ml放入贴1０—4标签得小试管中，吸洗三次以混匀。
同法依次连续稀释六、思考题１、氧化亚铁硫杆菌( Thｉoｂaciｌlｕsfｅrrooxiｄans,Ｔ、f ）为生物冶金重要菌种，属微生物中原核生物界、化能营养原核生物门、细菌纲、硫化细菌科、硫杆菌属。
广泛存在于土壤、海水、淡水、垃圾、硫磺泉与沉积硫内，尤以金属硫化矿与煤矿等酸性矿坑水(pH<4）中最为常见。
其化能自养,专性好氧，嗜酸,革兰氏阴性,,主要利用利用CＯ2为碳源,并吸收氮、磷等无机营养来合成自身细胞。
微生物实验中的接种分离和培养操作步骤
微生物实验中的接种、分离和培养操作步骤微生物实验中的接种、分离和培养操作步骤一、目的要求1、掌握各种分离、接种方法。
2、掌握无菌操作基本环节。
二、实验说明微生物在自然界中呈混杂状态存在，要获得所需菌种，必需从中把它们分离出来。
在保存菌种时不慎受到到污染也需予以分纯。
微生物分离和纯化的方法很多，但基本原理却是相似的，即将待分离的样品进行一定的稀释，并使微生物的细胞（或孢子）尽量以分散状态存在，然后使其长成一个个纯种单菌落。
然而上述工作又离不开接种，即将一种微生物移到另一灭过菌的培养基上的过程。
三、实验材料1、恒温培养箱。
2、接种环、玻璃棒、吸管、酒精灯。
3、培养基（上次实验配制的）。
4、大肠杆菌、枯草杆菌、金黄色葡萄球菌、酵母菌。
四、方法步骤（一）接种的操作1、斜面接种（接金黄葡萄球菌）（1）操作前，先用75%酒精擦手，待酒精挥发后点燃酒精灯。
（2）将菌种管和斜面握在左手大姆指和其它四指之间，使斜面和有菌种的一面向上，并处于水平位置。
（3）先将菌种和斜面的棉塞旋转一下，以便接种时便于拔出。
（4）左手拿接种环（如握钢笔一样），以火焰上先将环端烧红灭菌，然后将有可能伸入试管其余部位也过火灭菌。
（5）用右手的无名指、小指和手掌将菌种管和待接斜面试管的棉花塞或试管帽同时拔出，然后让试管口缓缓过火灭菌（切勿烧过烫）。
（6）将灼烧过的接种环伸入菌种管内，接种环在试管内壁或未长菌苔的培养基上接触一下，让其充分冷却，然后轻轻刮取少许菌苔，再从菌种管内抽出接种环。
（7）迅速将沾有菌种的接种环伸入另一支待接斜面试管。
从斜面底部向上作“Z”形来回密集划线。
有时也可用接种针仅在培养基的中央拉一条线来作斜面接种，以便观察菌种的生长特点。
（7）迅速将沾有菌种的接种环伸入另一支待接斜面试管。
从斜面底部向上作“Z”形来回密集划线。
有时也可用接种针仅在培养基的中央拉一条线来作斜面接种，以便观察菌种的生长特点。
（8）接种完毕后抽出接种环灼烧管口，塞上棉塞。
细菌的分离纯化和接种实验
环工综合实验细菌的分离纯化和接种实验实验报告环境科学与工程学院实验中心实验原理问答题：1.为什么湖水用10－4、10－5、10－6稀释液进行平板稀释分离而不用更高或者更低的浓度？答：因为在这三个浓度范围内能尽量使样品中的微生物分散开，使其成单个个体/细胞存在，否则一个菌落就不只是代表一个个体生长而成的，从而方便计数。
2.为什么平板培养皿要倒置放入恒温箱中进行培养?答：第一，为了防止重力对菌落的生成产生影响；第二，为了防止培养基中的水分蒸发后凝结在壁上，滴落后影响菌的生长和形态观察；第三，防止培养基干涸。
3.微生物常用接种方式有哪些？进行微生物接种应该注意哪些方面？答：⑴划线接种，涂布接种，穿刺接种，三点接种，浇混接种，液体接种，注射接种，活体接种等。
⑵接种用具及培养基等均需灭菌处理，接种过程必须在煤气灯旁进行，接种环、玻璃涂棒等器具要过火处理，把所要用到的器材和菌种培养基有序编号放置，操作时应避免已经灭菌处理的材料用具与周围的物品的接触，往培养基是划线或点菌时动作要轻以防把培养基划破等。
四、实验步骤1.制备细菌稀释液：使用5ml移液管加4.5ml无菌水放入贴有10-3、10-4、10-5、10-6标签的小试管中，用一根1ml的无菌移液管吸取10-2的湖水稀释液0.5ml放入贴有10-3标签的小试六、思考题1.氧化亚铁硫杆菌（Thiobacillusferrooxidans,T.f ）为生物冶金重要菌种，属微生物中原核生物界、化能营养原核生物门、细菌纲、硫化细菌科、硫杆菌属。
广泛存在于土壤、海水、淡水、垃圾、硫磺泉和沉积硫内，尤以金属硫化矿和煤矿等酸性矿坑水（pH<4）中最为常见。
其化能自养，专性好氧，嗜酸，革兰氏阴性，，主要利用利用CO2为碳源，并吸收氮、磷等无机营养来合成自身细胞。
请思考其分离纯化的方法和步骤。
答：采取酸性矿坑水或实验室浸矿培养液作为菌液，在实验室用9K或Leathen 培养基反复分离纯化。
微生物技术应用：第四章 微生物发酵产物的分离与纯化
电泳
凝胶电泳 等电点电泳 等速电泳 区带电泳
筛分、电荷
蛋白质、核酸
筛分、电荷、浓度差 蛋白质、氨基酸
筛分、电荷、浓度差 蛋白质、氨基酸
筛分、电荷、浓度差 蛋白质、核酸
离心 离心过滤 离心沉降 超离心
离心力、筛分 离心力 离心力
菌体、菌体碎片 菌体、细胞 蛋白质、核酸、糖类
二、分离纯化的基本过程
1.一般工艺过程
三、分离纯化方法的综合运用与工艺优化
应作好工序间的衔接工作，从加工产物质量、 产物收率与纯度的平衡、时间与经济性等角度出 发，对影响工艺流程整体纯化效果的加工条件进 行优化：
1 收率与纯度之间的平衡 2 经济性考虑 3 工艺放大 4 纯化过程中对产品的检测
1 收率与纯度之间的平衡
发酵产品有效成分分离纯化过程中，产品的 纯度与产率之间是一对矛盾的关系。比如，微生 物发酵产物为药品时，其有效成分的纯度是衡量 其质量优劣的重要指标，特别是非肠道药物，其 纯度的高低直接关乎用药的安全性。纯化产品产 率的提高往往伴随着纯度的下降，反之对产品纯 度要求的提高意味着纯化成本的提高和产物收率 的降低。
一、建立分离纯化工艺的根据
1.微生物发酵产物的特点
➢另一个特点是欲提取的生物物质通常很不 稳定，遇热、极端pH、有机溶剂会引起失 活或分解。
➢发酵或培养都是分批操作、生物变异性大， 各批发酵液不尽相同，要求下游加工有一 定的弹性。
一、建立分离纯化工艺的根据
2.原理
（1）物理性质 ① 力学性质：重力、离心力、筛分； ② 热力学性质：状态变化、相平衡； ③ 传质性质：粘度、扩散、热扩散； ④ 电磁性质：电泳、电渗析、磁化；
三、分离纯化方法的综合运用与工艺优化