用ImagePro Plus 分析免疫组化图片(1)
Image-Pro Plus图像分析软件在免疫组织化学定量分析中的基本应用
［９］潘 战 和 ，黄 慧 强 ，蔡 清 清 ，等 ．９６例 外 周 Ｔ 细 胞 非 霍 奇 金 淋 巴 瘤 预 后 分 析 ［Ｊ］．中 国 肿瘤 临 床 ，２００７，３４（１２）：７０２—７０５． （收 稿 日期 ：２０１４ ０４—３０）
（上 接 第 ３１４ 页 ）
定及 意 义 ［Ｊ］．广 东 医 学 ，２００８，２９（１０）：１６８８ ｌ６９０． ［５］常保 超 ，陈 卫东 ．来 氟 米 特 对 糖 尿 病 大 鼠血 清 高 敏 Ｃ反 应 蛋 白及
肾脏 病 理 的 影 响 ［Ｊ］．中 国 中 西 医 结 合 肾 病 杂 志 ，２００８，９（９）：
５７７—８７７．
ｌ ５５．
［２］ Ａ ｃｌｉｎｉｃａｌ ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｌｙｍｐｈｏｍａ Ｓｔｕｄｙ
Ｇｒｏｕｐ ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｎｏｎ—Ｈｏｄｇｋｉｎ Ｓ ｌｙｍ ｐｈｏｍａ．Ｔｈｅ ｎｏｎ—
Ｈｏｄｇｋｉｎ＇ｓ ｌｙｍｐｈｏｍａ ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｐｒｏｊｅｃｔ［Ｊ］．Ｂｌｏｏｄ，１９９７，８９
２４２－２４４．
［８］Ｉｂｒａｈｉｍ ＥＭ ，Ｅｚｚａｔ ＡＡ，Ｅ１一Ｗ ｅｓｈｉ ＡＮ，ｅｔ ａ１．Ｐｒｉｍａｒｙ ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ
ｄｉｆｆｕｓｅ ｌａｒｇｅ Ｂ—ｃｅｌｌ ｎｏｎ Ｈｏｄｇｋｉｎｓ ｌｙｍ ｐｈｏｍａ：ｃｌｉｎｉｃａｌ ｆｅａｔｕｒｅｓ，
ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ，ａｎｄ ｐｒｏｇｎｏｓｉｓ ｏｆ ６６ ｐａｔｉｅｎｔｓ［Ｊ］．Ａｎｎ Ｏｎｃｏｌ，
本 文 介 绍 了 Ｉｍａｇｅ—Ｐｒｏ Ｐｌｕｓ（ＩＰＰ）图 像 处 理 分 析 软件 在免 疫组 化 标本 定 量 分 析 中 的应 用 ，并 对 其 基本 操 作过 程进 行 了介 绍 。通 过 本 文 的 介 绍 ，大 家 按 照步 骤 即 可 以 利 用 ＩＰＰ图像 分 析 软 件 进 行 基 本 的病 理 图 像 分 析 。
Image Pro Plus教程
分析测量图象软件Imagepro-Plus教程一、入门Imageproplus（IPP）的主要用途是分析测量图象。
本人使用该程序进行生物图象分析有一段时间，写此帖的主要目的还是与大家交流使用心得，并总结一下使用方法。
如果你是刚接触IPP，最好先从本帖看起，并同时打开你电脑上的IPP程序照着操作。
学会一个软件需要花一段时间的，两分钟不可能学会。
两小时也太短。
但我相信，照着我这几个帖子作下来，至少是可以用IPP干一点事情了。
打开IPP后的界面是这样的，该从何处下手呢？既然是处理图片，当然是先要打开一张要处理的图片嘛这张照片中的黄色部分是免疫组化染色的阳性表达成分。
处理目标是通过测量图片中黄色部分的"黄"度来反映相应蛋白表达的的“量”。
对该图片进行观察，可以看到图片中主要有三种主要颜色，一是染成蓝色的细胞核，二是呈现出黄色的胞浆，三是细胞间的空隙区域，所以首先要把图片中呈现黄色的区域给挑选出来，这部分区域是我们最感兴趣的地方，叫作AOI（area of interest）。
AOI是IPP中最有用最重要的概念。
如何能够准确地选取AOI就是使用IPP的关键操作。
一旦准确地选取了AOI，下面的测量分析就好办了。
对不同的图片，需灵活地使用各种适当的AOI工具，就这张图片来说，AOI是黄色区域，因此用颜色分类的AOI工具是最有效的。
点击measure---count/size,弹出分类测量窗口在窗口中选中manual，再点击select color，弹出颜色选择窗口segmentation，这个工具是IPP最有特色的颜色选取工具之一。
用好这个工具是使用IPP的要点。
对于目标颜色鲜明的图片，用吸管工具是最简单的。
点一下吸管图标，在目标区域点一下，就可以选中该点的颜色，当然一下是不可能完全选中所需要指定的全部区域，可以在未选中的地方接着再点，这样多次选取，直到把想选中的区域全部选中为止。
在这张示例图中，选中的蓝色细胞核部分被标上了红色。
IPP 分析免疫组化图片
精选版课件ppt
15
哪一个染色物更多？
染色区域颜色深度接近，染色面积有差异。
精选版课件ppt
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使用不同的area会得到不同的结论 要结合切片情况来判断。
IOD对整张图片的面积作平均。 IOD对特定组织区域的面积作平均。 IOD对显色的组织区域作平均。
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对整张图片区域进行平均的情况比 较少，这张图片中黄色的IOD值主 要来自于中间一块区域内。
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Optical Density: 吸光物质的光学密度.
被测物质的量越多，光密度(OD值)越高，透射出的光越少，反 映在照片上就越黑。
OD值与物质的量直接相关，数字图象上点的灰度值与对应物 质OD值成对数关系，符合朗伯-比尔定律。
理论上OD值是从零到无穷大。实际应用中，OD值的范围常用 0-2.0或者0-3.0。
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2.从图片上分析光密度方法 的技术进步
简单测量整张照片的光密度值。 在照片上随机选取数个区域，测量其光密度值。
计算其平均值作为整张照片的光密度值。 在照片上准确选择被染上染料的特定颜色的区
域，计算这些区域的累积光密度值（IOD）， 进而计算统计区域的平均光密度值。
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照片B
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12
比较体积！
IODdensi(txy, y)ds
S
densi(tmy ea)nIOD/area
光 密 度
尺寸
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1.4 实际图片的情况很复杂的。
阳性样品染色深，阴性样品染色浅。
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直接比较整张图片的IOD 等于在比较整张图片的mean density
用ImagePro_Plus_分析免疫组化图片共39页
16、人民应该为法律而战斗，就像为 了城墙 而战斗 一样。 ——赫 拉克利 特 17、人类对于不公正的行为加以指责 ，并非 因为他 们愿意 做出这 种行为 ，而是 惟恐自 己会成 为这种 行为的 牺牲者 。—— 柏拉图 18、制定法律法令，就是为了不让强 者做什 么事都 横行霸 道。— —奥维 德 19、法律是社会的习惯和思想的结晶 。—— 托·伍·威尔逊 20、人们嘴上挂着的法律，其真实含 义是财 富。— —爱献 生
21、要知道对好事的称颂过于夸大，也会招来人们的反感轻蔑和嫉妒。——培根 22、业精于勤，荒于嬉；行成于思，毁于随。——韩愈
23、一切节省，归根到底都归结为时的节省。——马克思 24、意志命运往往背道而驰，决心到最后会全部推倒。——莎士比亚
25、学习是劳动，是充满思想的劳动。——乌申斯基
谢谢！
手把手教你使用Imagepro-Plus(1.入门
手把手教你使用Imagepro-Plus(1.入门)(修订0700905) - Welcome to Forum
mxh8174
2006-07-12 10:22
非常感谢，我已从网上下载下来了一个图像分析软件可是自己研究了好一阵还是一 头雾水，谢谢无私的奉献，使我有为实验节省了一点经费。祝工作顺利！
发贴: 2 积分: 0 得票: 0 状态: 离线
锦上添花：SCI论文修改润饰
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2006-04-21 07:54 陈老师，可否给我发一个中文说明书呢？英文水平太差了！感谢哦！ andybalake@
• 国际著名遗传学家谈家桢院士迎来百岁华诞
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2006-04-22 17:23
jss2004
• 【交流】甘露醇的临床应用误区及经验
2006-09-22 15:59 受益非浅，谢谢
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发贴: 64 积分: 3 得票: 5 状态: 离线
• "星光灿烂"的大地
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/bbs/post/view?bid=10&id=3554359&sty=1&tpg=2&ppg=2&age=0（第 7／12 页）2008-9-20 7:55:05
SCI医学论文翻译
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/bbs/post/view?bid=10&id=3554359&sty=1&tpg=2&ppg=2&age=0（第 2／12 页）2008-9-20 7:55:05
手把手教你使用Imagepro-Plus(1.入门)(修订0700905) - Welcome to Forum
医学文献看不懂怎么办？
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2005-12-30 11:03
手把手教你使用Imagepro-plus(第一版)-A4折页小版
教你使用Imagepro-Plus作 者 hbchendl编辑 doctor_li目 录1. 入门....................................................................................................- 1 -2. AOI技巧............................................................................................- 8 -3. AOI技巧续......................................................................................- 13 -4. 编制宏..............................................................................................- 19 -5. 计数..................................................................................................- 26 -6. 校正标尺..........................................................................................- 31 -7. 几何测量..........................................................................................- 39 -8. 图象分析策略..................................................................................- 41 -9. 雕虫小技..........................................................................................- 44 -10. 讨厌的光密度..................................................................................- 49 -11. 免疫组化光密度测量.......................................................................- 56 -12. 免疫组化图片光密度测量续..........................................................- 64 -13. 荧光强度测量..................................................................................- 70 -部区域，可以在未选中的地方接着再点，这样多次选取，直到把想选中的区域全部选中为止。
IPP-分析免疫组化图片 ppt课件
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2.1测定整张照片的光密度-图象分析仪
其测定原理有点象分光光度计，直接测定切片 的整体光密度。
可以根据照片上象素点的亮度来区分测定区域 其缺陷是显而易见的。复染上的其他颜色的染
料也会产生光密度吸收，导致严重的干扰。
PPT课件
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2.2 抽样测量光密度
在彩色电子图片上选取目标颜色区域，抽样测 量这些小区域的灰度值，取其平均值作为比较 染色深浅的指标。
PPT课件
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哪一个染色物更多？
染色区域颜色深度接近，染色面积有差异。
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使用不同的area会得到不同的结论 要结合切片情况来判断。
IOD对整张图片的面积作平均。 IOD对特定组织区域的面积作平均。 IOD对显色的组织区域作平均。
PPT课件
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对整张图片区域进行平均的情况比 较少，这张图片中黄色的IOD值主 要来自于中间一块区域内。
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1.3比较两张照片的染色物质量的差别
两张照片染色深度一样，染色面积大的质量大
照片A
照片B
PPT课件
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比较两张照片的染色物质量的差别
两张照片染色区域面积相同，染色深的质量大
照片A
照片B
PPT课件
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这回该怎么看？
A的颜色深，面积小。 B的颜色浅，面积大。
照片A
照片B
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1.2定量分析的指标： IOD ( Integrated option density ) 与Mean Density
将图片上各点的光密度值累加起来，得到IOD。 此值与目标物质的总量成正比。
IOD值除以有效目标分布区域的面积，得到 Mean density，此值反映了目标物质的单位面 积浓度。对样品照片进行数字图像分析比较时， 就是比较它们之间的平均光密度值的大小。
用ImagePro-Plus-分析免疫组化图片ppt课件
1.6
1.2
0.8 显著性
差异
0.4
0.2
0
阳性样品
0.1
阴性样品
1.2 1.1
1.0
无显著 性差异
背景
背景+阳性样品 背景+阴性样品
扣背景后依然没有显著性差异
阳性样品
阴1性.6样品
背景
1.2
阳性样品-背景
阳1性.2样品-背景
0.8
0.4
0
阳性样品
1.2
0.1
1.1
0.1
1 01..21 0.1
0.1 0.1 0.1 1.0
应当把照片存为无损压缩格式TIFF
特别是对于染色较浅的图片，保存为jpeg格式 后会损失亮度细节，导致测量误差增大。
注意那些 马赛克
总结拍摄注意事项：
调整显微镜光源亮度（电压9伏），足够白， 足够亮。
调整相机曝光时间，使背景呈现白色。灰度值 最好能达到230以上。
确认相机未使用自动白平衡功能。但要使用手 动校正白平衡功能校正背景色彩为纯白色。
3.用IPP分析免疫组化图片的过程
拍摄样品照片。 选取图片上具有染料色调的区域（AOI，area of
interesting）。 测量该区域的IOD。 选择并测量有效统计区域的面积 计算光密度平均值IOD/area（ mean density ） 计算同一实验组切片各照片的平均及标准差。 用统计学方法分析各实验组的平均mean density之间
处理照片时用的却是灰度
各种图象被拍摄成照片进行数字图象处理时， 计算机是对照片的灰度进行测量和计算的。为 了定量物质含量，最后还是需要转换为OD值 来表示。
所以对免疫组化照片的分析结果应该是一个 OD值，光密度。不应该是灰度。
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精品课件
Optical Density: 吸光物质的光学密度.
被测物质的量越多，光密度(OD值)越高，透射出的光越少，反 映在照片上就越黑。
OD值与物质的量直接相关，数字图象上点的灰度值与对应物质 OD值成对数关系，符合朗伯-比尔定律。
S
densi(tmy ea)nIOD/ area
光 密 度
精品课件
尺寸
1.4 实际图片的情况很复杂的。
阳性样品染色深，阴性样品染色浅。
精品课件
直接比较整张图片的IOD 等于在比较整张图片的mean density
精品课件
哪一个染色物更多？
染色区域颜色深度接近，染色面积有差异。
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使用不同的area会得到不同的结论 要结合切片情况来判断。
其测定原理有点象分光光度计，直接测定切片 的整体光密度。
可以根据照片上象素点的亮度来区分测定区域 其缺陷是显而易见的。复染上的其他颜色的染
料也会产生光密度吸收，导致严重的干扰。
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2.2 抽样测量光密度
在彩色电子图片上选取目标颜色区域，抽样测 量这些小区域的灰度值，取其平均值作为比较 染色深浅的指标。
理论上OD值是从零到无穷大。实际应用中，OD值的范围常用 0-2.0或者0-3.0。
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用OD值是正确的
分光光度计与酶标仪的测定值是OD值 透射的显微镜图象上的光强度要用OD值 蛋白电泳条带的测量也是OD值。 萤光显微镜及萤光分光光度计的测量值是萤光强度
(Fluorescence intensity) 用EB染色的DNA凝胶电泳条带也是萤光强度，但处理
方法与光密度相同，故也用OD值。这个OD与前面的OD 又有不同的意义。它就是荧光的光密度。反映着荧光 物质的多少。
精品课件
处理照片时用的却是灰度
各种图象被拍摄成照片进行数字图象处理时， 计算机是对照片的灰度进行测量和计算的。为 了定量物质含量，最后还是需要转换为OD值来 表示。
所以对免疫组化照片的分析结果应该是一个OD 值，光密度。不应该是灰度。
IOD对整张图片的面积作平均。 IOD对特定组织区域的面积作平均。 IOD对显色的组织区域作平均。
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对整张图片区域进行平均的情况比 较少，这张图片中黄色的IOD值主 要来自于中间一块区域内。
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右上角的空白区面积应该扣除。
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也许应是这个特定的组织区域
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这个区域是特定染色的区域。在计算 IOD时能同时计算出来，但以此为平均 面积往往并不正确。
用Image-Pro Plus ( IPP ) 分析免疫
组化图片
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1.免疫组化图片分析原理
根据染色染料颜色的深浅及分布面积大小来确 定目标蛋白的量。
染色区域分布面积与目标蛋白量成正比。 染色的颜色深浅与目标蛋白量的定量关系符合
朗伯-比尔定律，是对数关系。
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1.1光密度与灰度—迷惑人的不同概念
准确地说，是对免疫组化照片的特定染色区域 的灰度进行分析从而测量出组织切片的光密度 值。
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用标准样品才能把OD值 与样品量关联到一起
OD值是一个没有单位的相对值。 使用酶标仪或分光光度计时要作标准曲线。
对电泳条带进行定量分析时一样要作标准曲 线。 电泳条带照片的灰度值与样品量的关系为指 数函数。在把灰度值转换成OD值时，用一个 标准点进行定量分析是不准确的。多个标准 点的标准曲线亦有很大误差，因此只能说是 半定量分析。
光密度：吸收光的物质的光学密度。 （optical density,就是常说的OD值）光密度 值是直接与染色物质的量相关的。
灰度：灰是不够黑，是反射亮度的单位。电子 照片上像素的亮度称为灰度。
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Gray: between white and blEaxacmpkle:
1.The bright value on display screen is gray value.
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对单个细胞的分析比较
单个细胞的IOD 单个细胞的mean density 照片上各细胞IOD或mean density的平均值
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边界不清晰的贴壁细胞
整张图片IOD/细胞个数（照片中细胞数目不多， 数起来不费事）
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细胞簇的分析
测量整张图片黄色区域IOD。 再测量细胞分布的区域面积 area。 对染成蓝色的细胞核计数，作为细胞数N。 以 IOD /（N ）作为统计指标。或IOD/area
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1.2定量分析的指标： IOD ( Integrated option density ) 与Mean Density
将图片上各点的光密度值累加起来，得到IOD。 此值与目标物质的总量成正比。
IOD值除以有效目标分布区域的面积，得到 Mean density，此值反映了目标物质的单位面 积浓度。对样品照片进行数字图像分析比较时， 就是比较它们之间的平均光密度值的大小。
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Байду номын сангаас
1.3比较两张照片的染色物质量的差别
两张照片染色深度一样，染色面积大的质量大
照片A
照片B
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比较两张照片的染色物质量的差别
两张照片染色区域面积相同，染色深的质量大
照片A
照片B
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这回该怎么看？
A的颜色深，面积小。 B的颜色浅，面积大。
照片A
照片B
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比较体积！
IODdensi(txy, y)ds
随机选取几个区域 但是能作到“随机”吗？
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2.3 ImagePro plus的独特优势。
准确地按照一个颜色标准来选取一个AOI (area of interesting ) 。测量这个区域 的光密度参数。
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使用IPP比前两种方法更好。
在查到文献中使用的图象分析方法是前两种的 时候，完全可以用IPP的分析测量来代替。结 果更加准确。不必照搬文献上所述的方法。随 着计算机技术的发展，以后也许还会有更好的 图象分析方法及图象分析程序的。
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2.从图片上分析光密度方法
的技术进步
简单测量整张照片的光密度值。 在照片上随机选取数个区域，测量其光密度值。
计算其平均值作为整张照片的光密度值。 在照片上准确选择被染上染料的特定颜色的区
域，计算这些区域的累积光密度值（IOD）， 进而计算统计区域的平均光密度值。
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2.1测定整张照片的光密度-图象分析 仪