正相色谱和反向色谱及C18柱子
正相色谱vs反相色谱
正相色谱vs反相色谱点击次数：986 发布时间：2009-11-9现代高效液相色谱中,分离效果好坏很大程度上取决于色谱填料的选择.但是色谱填料的选择范围很宽,要做合适的选择,必须对此有一定的认识和了解.1,正相色谱正相色谱用的固定相通常为硅胶(Silica),以及其他具有极性官能团,如胺基团 (NH2,APS)和氰基团(CN,CPS)的键合相填料.由于硅胶表面的硅羟基(SiOH)或其他团的极性较强,因此,分离的次序是依据样品中的各组份的极性大小,即极性强弱的组份最先被冲洗出色谱柱. 正相色谱使用的流动相极性相对比固定相低,如:正乙烷(Hexane),氯仿(Chloroform),二氯甲烷(Methylene Chloride)等.2,反相色谱反相色谱填料常是以硅胶为基础,表面键合有极性相对较弱的官能团的键合相. 反相色谱所使用的流动相极性较强,通常为水,缓冲液与甲醇,已腈等混合物. 样品流出色谱柱的顺序是极性较强组合最先被冲出,而极性弱的组份会在色谱柱上有更强的保留. 常用的反相填料有C18(ODS),C8(MOS),C4(B),C6H5(Phenyl)等.二,聚合物填料聚合物调料多为聚苯乙烯-二乙烯基苯或聚甲基丙酸酯等,其主要优点是在PH值为1～ 14均可使用. 相对与硅胶基质的C18填料,这类填料具有更强的疏水性;大孔的聚合物填料对蛋白质等样品的分离非常有效. 现在的聚合物填料的缺点是相对硅胶基质填料,色谱柱柱效较低. 三,其他无机填料其它HPLC的无机填料色谱柱也已经商品化.由于其特殊的性质,一般仅限于特殊的用途.如石墨化碳也用于正逐渐成为反相色谱填料.这种填料的分离不同与硅胶基质烷基键合相,石墨化碳的表面即是保留的基础,不再需其它的表面改性,该柱填料一般比烷基键合硅胶或多孔聚合物填料的保留能力更强,石墨化碳可用于分离某些几何导构体,又由于HPLC流动相中不会被溶解,这类柱可在任何PH与温度下使用.氧化铝也可用于HPLC, 氧化铝微粒刚性强,可制成稳定的色谱柱柱床,其优点是可在PH高达12的流动相中使用. 但由于氧化铝与碱性化合物作用也很强,应用范围受到一定的限制,所以未能广泛应用, 新型氧化锆填料也可用于HPLC,商品化的仅有聚合物涂层的多孔氧化锆微球色谱柱,应用PH范围1～14,温度可达100℃.由于氧化锆填料几年才开始研究,加之面临的实验难度,其重要用途与优势尚在进行中.怎样选择填料粒度目前,商品化的色谱料粒度从1um到超过30um均有销售,而目前分析分离主要用3um, 5um和10um填料,填料的粒度主要影响填充柱的两个参数,即柱效和背压.粒度越小,填充柱的柱效越高;小于3um的填料应用,在相同选择性条件下,提高柱效可提高分离度, 但不是唯一的因素.如果固定相选择是正确,但是分离度不够,那么选择更小粒度的填料是很有用的,3um填料填充柱的柱数比相同条件下的5um填料的柱效提高近30%;然而, 3um的色相谱的背压却是5um的2倍.与此同时,柱效提高意味着在相同条件下可以选择更短的色谱柱,以缩短分析时间,另外,可以采用低粘度的溶剂做流动相或增加色谱柱的使用温度,比如用乙腈代替甲醇,以降低色谱柱的压力.如何选择液相色谱仪发布日期：[2009-10-30] 共阅[241]次如何选择液相色谱仪一台品质优良的液相色谱系统应从以下几个方面考虑：一．主要技术指标优异首先是如何看指标。
液相色谱柱的选择
液相色谱柱的选择液相色谱柱的选择、使用、维护和常见故障及排除液相色谱的柱子通常分为正相柱和反相柱。
正相柱大多以硅胶为柱，或是在硅胶表面键合-CN,-NH3等官能团的键合相硅胶柱；反相柱填料主要以硅胶为基质，在其表面键合非极性的十八烷基官能团（ODS）称为C18柱，其它常用的反相柱还有C8,C4,C2和苯基柱等。
另外还有离子交换柱，GPC柱，聚合物填料柱等。
本文重点介绍反相色谱柱的选择和使用：一、反相色谱柱的选择1．柱子的PH值使用范围反相柱优点是固定相稳定，应用广泛，可使用多种溶剂。
但硅胶为基质的填料，使用时一定要注意流动相的PH范围。
一般的C18柱PH值范围都在2-8，流动相的PH值小于2时，会导致键合相的水解；当PH值大于7时硅胶易溶解；经常使用缓冲液固定相要降解。
一旦发生上述情况，色谱柱人口处会塌陷。
同样填料各种不同牌号的色谱柱不尽相同。
如果流动相PH较高或经常使用缓冲液时，建议选择PH范围大的柱子，例如戴安公司的Acclaim柱PH 2-9或Zorbax的PH 2-11. 5的柱子。
2．填料的端基封尾（或称封口）把填料的残余硅羟基采用封口技术进行端基封尾，可改善对极性化合物的吸附或拖尾；含碳量增高了，有利于不易保留化合物的分离；填料稳定性好了，组分的保留时间重现性就好。
如果待分析的样品属酸性或碱性的化合物，最好选用填料经端基封尾的色谱柱。
3．戴安公司Acclaim柱子介绍—极性封尾C16固定相柱戴安公司有28种类型的柱子，Acclaim反相柱填料高纯，金属含量极低，完全封尾。
PH 2-9范围内兼容，低流失，高柱效。
尤其是2003年推出的Acclaim极性封尾C16柱，是最先商品化的磺酰氨-O链接键的色谱柱，具极低的硅羟基活性，能在极性溶剂甚至100%水的条件下长期使用。
对酸性和碱性化合物有极为尖锐的好的色谱峰形，与现有的一流色谱柱相比有更好的立体选择性。
（下图是Acclaim极性封尾C16柱和市售极性封尾一流色谱柱分离酸性化合物谱图的比较）二、液相色谱柱的使用色谱柱在使用前，最好进行柱的性能测试，并将结果保存起来，作为今后评价柱性能变化的参考。
色谱柱类型
色谱柱类型
色谱柱可分正相模式色谱柱、反相模式色谱柱和亲水模式柱。
一、正相模式色谱柱
正相模式色谱柱采用极性固定相（如乙二醇、氨基与腈基等键合相）；常用于分离中等极性和极性较强的化合物（如酚类、胺类、羰基类及氨基酸类等）。
二、反相模式色谱柱（ＲＰＣ）
反相模式色谱柱：一般用非极性固定相，以硅胶为基质键合不同的基团（如Ｃ１８、Ｃ８）；适用于分离非极性和极性较弱的化合物。
在现代液相色谱中应用最多，据统计它占整个ＨＰＬＣ应用的８０％左右。
由于超临界色谱的崛起，一些过去用正相色谱的实验逐渐被超临界色谱所代替，所以反相色谱柱的应用将会更加广泛。
随着色谱柱填料的快速发展，某些无机样品或易解离样品的分析也可用反相色谱法。
为控制样品在分析过程的解离，常用缓冲盐控制流动相的ｐＨ值。
硅胶基质键合相（Ｃ８和Ｃ１８）色谱柱使用的ｐＨ值通常为２．５～７．５（２～８），太高的ｐＨ值会使硅胶溶解，太低的ｐＨ值会使键合的烷基脱落。
近年来技术的更新，利用包被、空间位阻、杂化颗粒等新技术，已经可以使硅胶基质的色谱柱使用范围扩大到ｐＨ为１～１２，流动相为较强酸性或碱性时，可选择宽ｐＨ值的色谱柱。
三、亲水模式色谱柱（ＨＩＬＩＣ）
亲水（ＨＩＬＩＣ）模式不同于反相色谱技术，流动相为反相色
谱的流动相，它提供了相对于反相的互补选择性，通常可保留传统反相色谱方法无法保留的高极性化合物。
需要注意的是ＨＩＬＩＣ模式中硅胶基质无键合相的色谱柱，流动相ｐＨ适用范围。
c18色谱柱结构
c18色谱柱结构
C18色谱柱主要由柱管、压帽、卡套、筛板、接头、螺丝等部分组成。
柱管通常由石英或玻璃制成，内壁涂有一层由十八烷基硅烷（C18）组成的固定相。
固定相的结构通常为球形硅胶，具有高纯度（金属杂质<10ppm），孔径为120Å，粒径有多种规格如3、5和10µm 等，孔体积为1.0mL/g，比表面积为350m²/g。
固定相的结构还可能是三官能团单分子层全封尾，碳载量为19%。
C18色谱柱的pH耐受范围为1.5-10.5，适合分离酸性、中性和碱性化合物，以及多肽和蛋白等。
C18色谱柱的分离原理主要是基于样品分子与固定相之间的相互作用力差异，包括疏水作用、范德华力、氢键等。
在色谱分离过程中，样品分子随着流动相的移动在固定相表面进行吸附和解吸，根据分子间作用力的不同实现不同组分的分离。
需要注意的是，C18色谱柱的使用和维护需要遵循一定的规范，如避免过度使用、定期清洗和保存等，以保证其性能和寿命。
同时，在选择和使用C18色谱柱时，还需要根据具体的实验条件和分离需求选择合适的型号和规格。
反相色谱柱的选择和使用 色谱柱如何操作
反相色谱柱的选择和使用色谱柱如何操作液相色谱的柱子通常分为正相柱和反相柱。
正相柱大多以硅胶为柱，或是在硅胶表面键合—CN,—NH3等官能团的键合相硅胶柱；反相柱填料紧要以硅胶为基质，在其表液相色谱的柱子通常分为正相柱和反相柱。
正相柱大多以硅胶为柱，或是在硅胶表面键合—CN,—NH3等官能团的键合相硅胶柱；反相柱填料紧要以硅胶为基质，在其表面键合非极性的十八烷基官能团（ODS）称为C18柱，其它常用的反相柱还有C8,C4,C2和苯基柱等。
另外还有离子交换柱，GPC柱，聚合物填料柱等。
下面介绍一下反相色谱柱的选择和使用：一、反相色谱柱的选择1.柱子的PH值使用范围反相柱优点是固定相稳定，应用广泛，可使用多种溶剂。
但硅胶为基质的填料，使用时确定要注意流动相的PH范围。
一般的C18柱PH值范围都在2—8，流动相的PH值小于2时，会导致键合相的水解；当PH值大于7时硅胶易溶解；常常使用缓冲液固定相要降解。
一旦发生上述情况，色谱柱人口处会塌陷。
同样填料各种不同牌号的色谱柱不尽相同。
假如流动相PH较高或常常使用缓冲液时，建议选择PH范围大的柱子，例如戴安公司的Acclaim柱PH2—9或Zorbax的PH2—11.5的柱子。
2.填料的端基封尾（或称封口）把填料的残余硅羟基接受封口技术进行端基封尾，可改善对极性化合物的吸附或拖尾；含碳量增高了，有利于不易保留化合物的分别；填料稳定性好了，组分的保留时间重现性就好。
假如待分析的样品属酸性或碱性的化合物，可以选用填料经端基封尾的色谱柱。
二、液相色谱柱的使用色谱柱在使用前，可以进行柱的性能测试，并将结果保存起来，作为今后评价柱性能变化的参考。
在做柱性能测试时要依照色谱柱出厂报告中的条件进行（出厂测试所使用的条件是较佳条件），只有这样，测得的结果才有可比性。
但要注意：柱性能可能由于所使用的样品、流动相、柱温等条件的差异而有所不同。
1、样品的前处理a、可以使用流动相溶解样品。
c18柱原理
c18柱原理
柱原理（C18柱原理）是一种常用的液相色谱柱原理。
C18柱
是一种反相色谱柱，其柱填料通常是Octadecylsilane（ODS）
或Octadecylsilica（ODS）。
C18柱的工作原理是基于物质在固定相（C18柱填料）和流动
相之间的亲疏水性差异。
固定相上的碳链具有疏水性，因此有机物分子（具有亲疏水特性）更容易附着在固定相表面上。
相反，极性物质更容易与流动相相互作用并分离出来。
在液相色谱实验中，待分离的混合物通过进样装置送入柱中，其中固定相的C18填料将混合物中的不同组分吸附住。
然后，通过调整流动相的性质（如溶剂的亲疏水性、pH值等），可
以控制不同组分在柱中的保留时间和相互之间的分离程度。
通常采用梯度洗脱的方法，即在分离过程中逐渐改变流动相的亲疏水性，以实现更好的分离效果。
C18柱的应用十分广泛，特别适用于对非极性或微极性化合物
的分离和纯化。
常见的应用领域包括药物分析、天然产物提取和分析、环境监测等。
总之，C18柱原理基于固定相（C18填料）和流动相之间的亲
疏水性差异，通过调整流动相的性质实现不同组分的分离。
这种柱原理在液相色谱分析中有着广泛的应用。
c18色谱柱的适用范围
c18色谱柱的适用范围
C18色谱柱是一种常见的反相色谱柱，它由硅胶为基质，表面覆盖十八烷基官能团（ODS）构成。
C18的碳链长度为18个碳原子，因此被称为“C18”。
C18色谱柱还具有很好的耐酸碱性和耐溶剂性，可以在pH2-9的范围内使用。
这种色谱柱具有高分离度、高灵敏度和高稳定性等优点，因此在许多领域中都有广泛的应用。
包括药物、食品添加剂、环境污染物、天然产物等。
它可以用于正相、反相、离子对和离子交换等多种色谱模式。
在反相色谱中，C18色谱柱可以用于分离非极性或弱极性的化合物，如脂肪酸、醇类、酮类、酯类等。
此外，C18色谱柱还可以用于分离含有不同官能团的化合物，如酚类、胺类、羧酸类等。
它还具有良好的热稳定性，可以在高温下使用。
这些优点使得C18色谱柱在实验室和工业领域中都得到了广泛应用。
C18色谱柱是一种非常实用且功能强大的色谱柱，适用于分析各种类型的有机化合物。
它在药物分析、食品安全检测、环境监测等领域都有着重要的应用价值。
随着科学技术的不断发展，C18色谱柱在未来仍将发挥重要作用。
制备色谱柱型号
制备色谱柱的型号多种多样，具体取决于不同的应用和需求。
以下是一些常见的制备色谱柱型号及其特点：
1. 正相色谱柱：通常采用硅胶或氧化铝作为填料，适用于分离极性物质和官能团较为活泼的化合物。
常
用的正相色谱柱有：① Baseline正相色谱柱，适用于一般的有机化合物分离；② C18十八烷基键合球形硅胶色谱柱，适用于一般的有机化合物和生物大分子的分离。
2. 反相色谱柱：通常采用C18、C8、C4等烷基键合硅胶作为填料，适用于分离极性较弱的物质和蛋白
质、多肽等生物大分子。
常用的反相色谱柱有：① C18反相色谱柱，适用于一般的有机化合物和生物大分子的分离；② C8反相色谱柱，适用于分离极性较弱的有机化合物；③ C4反相色谱柱，适用于分离极性更弱的有机化合物。
3. 离子交换色谱柱：通常采用阴离子或阳离子交换剂作为填料，适用于分离带有电荷的离子化合物。
常
用的离子交换色谱柱有：①阴离子交换色谱柱，适用于分离带有负电荷的离子化合物；②阳离子交换色谱柱，适用于分离带有正电荷的离子化合物。
4. 凝胶色谱柱：通常采用多孔性的凝胶作为填料，适用于分离分子量较大的化合物。
常用的凝胶色谱柱
有：① Sephadex G系列凝胶色谱柱，适用于一般的凝胶过滤分离；② Superdex系列凝胶色谱柱，适用于分离生物大分子和多聚物。
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正相色谱和反向色谱及C18柱子
反相与正相的区别在于，固定相与流动相的极性大小。
反相：固定相的极性小于流动相的极性正相：固定相的极性大于流动相的极性反向色谱流动相极性大于固定相极性测定样品时极性大的先出峰，正向反之
在正相色谱中，一般采用极性键合固定相，硅胶表面键合的是极性的有机基团，键合相的名称由键合上去的基团而定。
最常用的有氰基（-CN）、氨基（-NH2）、二醇基（DIOL）键合相。
流动相一般用比键合相极性小的非极性或弱极性有机溶剂，如烃类溶剂，或其中加入一定量的极性溶剂（如氯仿、醇、乙腈等），以调节流动相的洗脱强度。
通常用于分离极性化合物。
一般认为正相色谱的分离机制属于分配色谱。
组分的分配比K值，随其极性的增加而增大，但随流动相中极性调节剂的极性增大（或浓度增大）而降低。
同时，极性键合相的极性越大，组分的保留值越大。
该法主要用于分离异构体，极性不同的化合物，特别是用来分离不同类型的化合物。
反相键合相色谱法
在反相色谱中，一般采用非极性键合固定相，如硅胶-C18H37（简称ODS或C18）硅胶-苯基等，用强极性的溶剂为流动相，如甲醇/水，乙腈/水，水和无机盐的缓冲液等。
目前，对于反相色谱的保留机制还没有一致的看法，大致有两种观点：
一种认为属于分配色谱，另一种认为属于吸附色谱。
分配色谱的作用机制是假设混合溶剂（水+有机溶剂）中极性弱的有机溶剂吸附于非极性烷基配合基表面，组分分子在流动相中与被非极性烷基配合基所吸附的液相中进行分配。
吸附色谱的作用机制是把非极性的烷基键合相，看作是在硅胶表面上覆盖了一层键合的十八烷基的“分子毛”，这种“分子毛”有强的疏水特性。
当用水与有机溶剂所组成的极性溶剂为流动相来分离有机化合物时，一方面，非极性组分分子或组分分子的非极性部分，由于疏溶剂的作用，将会从水中被“挤”出来，与固定相上的疏水烷基之间产生缔合作用。
另一方面，被分离物的极性部分受到极性流动相的作用，使它离开固定相，减少保留值，此即解缔过程。
显然，这两种作用力之差，决定了分子在色谱中的保留行为。
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一般地，固定相的烷基配合基或分离分子中非极性部分的表面积越大，或者流动相表面张力及介电常数越大，则缔合作用越强，分配比也越大，保留值越大。
在反相键合相色谱中，极性大的组分先流出，极性小的组分后流出。
1.C18是连接了18烷基碳链的反相固定相的总称。
ODS 是以硅胶为基质键合的C18填料，而C18还包括其他基质的填料，比如高聚物小球为基质，氧化铝为基质，氧化锆为基质等键合C18链形成的反相固定相，这些可以称为"C18"，但是不是ODS。
2.RP-18也是C18中的一种，不同的公司对C18填料有不同的商
业名称，本质应该都是一样的。
Merck公司的填料喜欢叫RP-18。
比如Merck 的LiChrospher RP-18，Superspher RP-18，Purospher RP-18。
因此，我认为说"RP-18"是改进型的不妥当。
Merck的改进表现在前边的名字上,比如LiCHrospher, Superspher, Purospher表现的是不同的性能
C8是硅胶键合辛烷基，C18是硅胶键合十八烷基，C18的极性较C8的极性小，C18对分析物的保留性能强于C8，含碳量对分离效果和主要组分的保留时间起很大的影响，所以含碳量高，主要组分的保留时间越长。
C8和C18都是反相色谱柱的一种，适用于分析弱极性的物质，C8适合分析弱极性物质里极性稍强的一类物质，C18适合分析弱极性物质里极性更弱的物质。
这是他们极性上的差别，但是差别并不是特别明显，一般能用C8分析的物质，在C18上也能分离。
C18比C8的碳链更长，因此带来更好的保留特性。
因此C8就更适合分析大分子类的物质，比如一些球蛋白等，都用C8和缓冲盐洗脱剂来配合使用。
相反，分子量较小的物质，经常用C18来进行分析和分离。
键合相不同，导致同种组分在不同色谱柱上的保留时间不一致，对各组分的保留能力也会不同，峰位置就变化啦。
C18前面看到“ODS”的字样，ODS是英文octadecyl silane的所写，意思是十八(烷)基硅烷，是以硅胶为基质键合的C18填料，由于大部分的C18柱都是硅胶基质，因此有时你还会看到色谱柱上只标称二者之一。
其中以ODS居多。
有时你还会看到ODS-x，x是不同的数字，
这个x虽然是数字，但是不同厂家的产品代表的含义不同，一般以含碳量区分，但这也不是绝对的。
有时还可能看到RP-18或RP-8，RP-18和C18意义基本一致，但是不同的厂家有不同的规定。
RP－C8、RP－C18，这里的RP是指"Reversal Phase"，就是“反相”的意思，所以RP－C8、RP－C18就是指反相C8和反相C18。
其实C8和C18也没怎么见过用于正相，它们本身就是反相柱，只是商家为了区别其它的C8或C18做出的一个标识。
键合烷基的链长对键合相的样品负荷量、溶质的容量因子及其选择性有不同的影响，当烷基键合相表面浓度相同时，随着烷基链长增加，碳含量成比例增加，溶质的何留值增加。
C18
C6、C8短链烷基，由于分子尺寸较小，与硅胶表面键合时可以有比长链烷基更高的覆盖和较少的残余羟基，适合极性样品或做离子抑制的样品的分析。
一般说，C18比C8的分离效果好。
但是如果遇到性质差别比较大的样品，也就是说比较容易分离的样品，C8比C18的效率高。