7.免疫组化结果分析和判断
免疫组化结果判断及常见问题的分析
精选
25
精选
26
四、免疫组化异常着色及对策
1.非特异性着色及其对策
非特异性着色原因 操作过程冲洗不充分 内源性过氧化物酶
内源性生物素 电荷吸附 抗体不纯
切片制片不当 加试剂后切片干燥
对策 每步冲洗3×5min
3％H2O2封闭 使用生物素阻断试剂盒阻断
非免疫动物血清封闭
采用单克隆抗体
改善取材和制片
2.染色的不均一性 阳性细胞的染色分布不均，片状或点状散在分布 染色强弱不等，颜色深浅反映抗原量的多少
3.排除人为造成的非特异性染色 切片的折叠、刀痕，色素沉着，组织细胞坏死。
4.颗粒性显色 DAB显色在高倍镜下呈颗粒状而非均匀着色。
精选
5
免疫组化标准化照片
CK10 ER CD44v6
精选
6
精选
切片制片不当 加试剂后切片干燥
对策 每步冲洗3×5min
3％H2O2封闭 使用生物素阻断试剂盒阻断
非免疫动物血清封闭 采用单克隆抗体 改善取材和制片 防止切片干燥
精选
43
无信号片
精C选D30
44
2. 染色的假阴性及其对策
染色假阴性原因
组织处理不当（固定、浸蜡） 一抗与二抗种属连接错误 抗体失效 显色系统不相适配 操作不当，遗漏重要步骤
精选
CD34
21
K-ras
精选
VEGF
22
附：定量分析——图象处理系统
1、图象处理：
利用仪器按照不同的目的进行图象的修正、变 换、特征提取和测量。 1）“狭义”指消除图象的模糊不清部分，校正 畸变。 2）“广义”包括对图象的结构分析，提取特征 进行测量。
精选
免疫组化结果判断及常见问题的分析
非特异性染色
总结词
非特异性染色是由于抗体与非目标组织成分的交叉反应导致的。
详细描述
非特异性染色是免疫组化实验中常见的问题，通常是由于抗体与组织中非目标成分的交叉反应。为了减少非特异 性染色，可以尝试降低抗体浓度、增加洗涤步骤或使用阻断剂等方法。
背景染色
总结词
背景染色是由于组织中其他成分的非特异性染色或由于抗体与组织中其他成分的交叉反应导致的。
免疫组化结果判断及常见问题 的分析
目
CONTENCT
录
• 免疫组化基本概念 • 免疫组化结果解读 • 常见问题及解决方法 • 免疫组化在临床上的应用 • 免疫组化技术新进展
01
免疫组化基本概念
定义与原理
定义
免疫组化是一种利用抗原-抗体反应原理，通过标记的抗体在组织 或细胞中检测特定抗原的方法。
免疫组化可以与其他技术如原位杂交、原位PCR等联合应用，以同时检测抗原和 相关基因的表达，提供更全面的分子信息，有助于深入了解疾病的发生发展机制 。
联合应用多种技术可以相互补充，提高检测的敏感性和特异性，为临床诊断和治 疗提供更可靠的依据。
THANK YOU
感谢聆听
数字免疫组化技术
数字免疫组化技术是一种基于数字图像分析的免疫组化技术 ，通过高分辨率数字成像系统获取组织切片图像，利用计算 机软件进行图像分析和处理。
数字免疫组化技术能够实现自动化、高通量的组织切片分析 ，提高检测效率，减少人为误差，特别适合大规模临床筛查 和流行病学研究。
免疫组化与其他技术的联合应用
04
免疫组化在临床上的应用
肿瘤诊断与鉴别诊断
肿瘤诊断
免疫组化技术可以检测肿瘤组织中特定抗原 的表达，从而确定肿瘤的性质和来源。通过 对不同肿瘤标志物的检测，有助于医生对肿 瘤进行准确的诊断。
实验结果免疫组化结果解读
实验结果免疫组化结果解读
免疫组化（immunohistochemistry，IHC）是一种用于检测组织中特定蛋白质表达的技术。
通过对组织切片进行染色，可以观察到特定蛋白在组织中的分布和表达水平。
在解读免疫组化结果时，需要考虑以下几个方面：
1. 样本准备，首先需要确认样本的质量和处理是否符合实验要求。
样本的保存和处理对免疫组化结果至关重要，因为不恰当的处理可能会导致蛋白质的降解或者失活，影响最终的结果。
2. 阳性对照，在解读免疫组化结果时，需要对照阳性对照组织切片，确保实验条件和试剂的有效性。
阳性对照通常是已知含有目标蛋白的组织切片，用于验证实验条件和试剂的有效性。
3. 组织结构，观察组织切片的整体结构和形态，确保实验过程中组织的完整性和准确性。
免疫组化结果需要在正确的组织结构基础上进行解读，以排除可能的伪阳性或伪阴性结果。
4. 染色结果，观察组织切片的染色结果，包括颜色强度、分布和细胞定位。
根据染色结果的强弱和分布情况，可以初步判断目标
蛋白在组织中的表达水平和分布情况。
5. 数据分析，将染色结果进行定量分析，通常使用图像分析系统或者手动计数的方式进行。
通过定量分析可以得到目标蛋白的表达水平，进一步验证免疫组化结果的可靠性和准确性。
6. 结果解读，根据样本准备、阳性对照、组织结构、染色结果和数据分析，对免疫组化结果进行综合解读。
需要考虑目标蛋白在组织中的表达水平和分布情况，结合实验条件和其他实验结果进行综合分析。
综上所述，解读免疫组化结果需要综合考虑多个因素，包括样本准备、阳性对照、组织结构、染色结果、数据分析和综合解读，以确保结果的准确性和可靠性。
免疫组化常见结果及解读
免疫组化常见结果及解读免疫组化是一种常用的实验技术，用于检测组织或细胞中特定蛋白质的表达情况。
通过免疫组化可以确定细胞或组织中特定蛋白质的存在、定位和表达水平，从而为疾病的诊断和治疗提供重要的依据。
下面将介绍免疫组化常见结果及其解读。
1. 阳性结果：阳性结果表示目标蛋白质在组织或细胞中存在。
阳性结果可以分为强阳性、中阳性和弱阳性。
强阳性表示目标蛋白质的表达水平很高，中阳性表示表达水平适中，弱阳性表示表达水平较低。
阳性结果的解读需要结合临床病史和其他检查结果来综合判断。
2. 阴性结果：阴性结果表示目标蛋白质在组织或细胞中不存在。
阴性结果可能有多种原因，如目标蛋白质在该组织或细胞中不表达、表达水平很低或实验操作不当等。
阴性结果的解读需要排除其他可能的原因，并结合临床病史和其他检查结果来综合判断。
3. 异常表达：有时免疫组化结果显示目标蛋白质的表达情况与正常组织或细胞有明显差异，称为异常表达。
异常表达可能是疾病的标志，也可能是实验操作不当或其他因素导致的假阳性结果。
解读异常表达结果需要结合临床病史和其他检查结果来综合判断。
4. 亚细胞定位：免疫组化可以确定目标蛋白质在细胞中的亚细胞定位。
常见的亚细胞定位结果包括细胞核、细胞质、细胞膜和细胞器等。
亚细胞定位结果的解读可以提供有关目标蛋白质功能和调控机制的重要信息。
5. 异常分布：有时免疫组化结果显示目标蛋白质在组织中的分布与正常组织有明显差异，称为异常分布。
异常分布可能是疾病的标志，也可能是实验操作不当或其他因素导致的假阳性结果。
解读异常分布结果需要结合临床病史和其他检查结果来综合判断。
6. 异常表达模式：有时免疫组化结果显示目标蛋白质的表达模式与正常组织有明显差异，称为异常表达模式。
异常表达模式可能是疾病的标志，也可能是实验操作不当或其他因素导致的假阳性结果。
解读异常表达模式结果需要结合临床病史和其他检查结果来综合判断。
总之，免疫组化常见结果的解读需要结合临床病史和其他检查结果来综合判断。
免疫组化结果判断标准
免疫组化结果判断标准免疫组化（Immunohistochemistry，IHC）是一种通过使用特定的抗体来检测组织样本中特定蛋白质的方法。
通过对免疫组化结果进行判断和分析，可以为临床医生提供重要的诊断和预后信息。
在免疫组化结果的判断中，常见的标准有阳性标记、定量分析、判定阴性、强度评分等。
免疫组化结果按照阳性标记分为阴性和阳性。
阳性结果表示目标蛋白质的表达存在，而阴性结果表示目标蛋白质的表达不存在。
在判断免疫组化结果时，需要注意结果的可靠性和准确性。
一般来说，阳性结果需要出现明显的染色反应，在组织样本中产生特定的颜色变化，而阴性结果则需要获得几乎无染色反应的结果。
除了阳性标记外，还可以通过定量分析来判断免疫组化结果。
定量分析可以通过使用计算机软件或图像分析系统，对免疫组化结果图像中的染色强度和染色面积进行计算和量化。
通过定量分析，可以量化目标蛋白质的表达水平，并与其他样本进行比较和分析，从而得出更加客观和可靠的结果。
在免疫组化结果的判断中，还有一种常见的标准是判定阴性。
判定阴性是指使用阴性对照和负对照来确定免疫组化染色的结果是否是阴性。
阴性对照是指在免疫组化实验中使用无目标蛋白质的组织样本或细胞，负对照是指在免疫组化实验中使用无抗体的组织样本或细胞。
通过对阴性对照和负对照的染色结果进行比较和分析，可以确定是否存在非特异性染色或假阳性结果。
除了以上几种标准外，免疫组化结果的判断还可以通过强度评分进行。
强度评分是根据染色的强烈程度对结果进行判断和评分的方法。
一般来说，免疫组化结果的强度可以分为负（0）、弱（1+）、中（2+）和强（3+）四个等级。
这种评分方法可以为临床医生提供蛋白质表达的定量信息，并帮助他们作出更加准确和可靠的诊断和预后判断。
总之，免疫组化结果的判断标准包括阳性标记、定量分析、判定阴性和强度评分等。
通过合理地应用这些标准，可以为临床医生提供重要的蛋白质表达信息，从而指导临床诊断和治疗决策。
免疫组化结果判断标准
免疫组化结果判断标准免疫组化结果判断标准指的是在免疫组化检测中，根据染色结果和特定的标准对检测样本进行判断和解读的规则。
免疫组化是一种常用的实验方法，用于检测组织切片或细胞中特定的蛋白质表达情况。
在免疫组化实验中，通常使用标记有特异性抗体的试剂与目标抗原结合，形成颜色沉积或荧光信号。
免疫组化结果根据检测物的染色程度、强度和分布模式来判断。
以下是一些常见的免疫组化结果判断标准：1. 阳性（Positive）：表示目标抗原在组织或细胞中存在。
阳性结果通常可以观察到明显的染色和强度，其分布模式可能是全细胞膜、核、细胞质等。
2. 阴性（Negative）：表示目标抗原在组织或细胞中不存在。
阴性结果通常观察不到染色或染色非常弱，且不符合阳性的染色模式。
3. 弱阳性（Weak Positive）：染色结果显示为弱的阳性信号，通常比阳性样本的染色强度要低。
4. 血管内内皮细胞阳性（Vascular Endothelial Cell Positive）：此结果表示目标抗原在血管内皮细胞中存在。
5. 炎症细胞阳性（Inflammatory Cell Positive）：表示目标抗原在炎症细胞中存在。
6. 异常强阳性（Aberrantly Strong Positive）：表示目标抗原在组织或细胞中出现异常高的染色强度，超过了正常表达水平。
每种免疫组化实验都具有独特的结果判断标准，这些标准通常由经验丰富的病理学家或专业领域的专家制定和解读。
此外，合适的对照实验和质量控制也是确保免疫组化结果可靠性的重要因素。
总之，免疫组化结果判断标准对于准确解读免疫组化实验结果至关重要。
了解并遵循这些标准可以确保免疫组化实验结果的准确性和可靠性，从而对研究和临床诊断产生重要的参考价值。
免疫组化5-结果的分析和判断
（ 三 ） 阳 性 标 记 组 织 学 特 征 （ 以 HRPDAB/H2O2为例） 免疫组化染色阳性细胞在 组织中的分布排列形式可以有如下7种：① 局灶型；②弥漫型；③片块型；④网状型； ⑤腺管型；⑥腔缘型和⑦菊团型，等。这主 要取决于抗原抗体复合物在细胞内的分布和 阳性细胞在组织内的群体分布特点。
⑷抑制试验 是指用标记抗体和未标记抗 体（可以是一抗，也可以是二抗或桥抗 体）两者的混合物作试剂，其他步骤不 变的免疫组化染色试剂对照，结果其阳 性着色应成比例的减弱（等量或1：9） 。此试剂对照多用于直接法。
这类阴性试剂对照的选用原则是： ①空白对照不能省，其他对照在预实验 中应尽量多做，尤其是应用新抗体试剂 ②对照必需与实验片同步进行染色
四、阳性标记的形态 特征和判断
免疫组化标记具有一定形态特点， 若能熟练掌握则有助于对免疫组化标记 结果的正确判断。内容包括定性、定位 和定量三方面。
定性定量指标---免疫显色强度和阳性细胞密度（抗原含量） 定位指标---阳性细胞的着色形态及组织分布特点（功能）
（一）阳性标记免疫特征：分"弱(+) 、中(++)、强(+++)"三级。免疫荧光法（ FITC为例） 则表现为浅绿色荧光、明显 绿色荧光和亮绿色耀眼荧光；
原因：组织处理不当，组织细胞抗原丢
失或试剂错误(如漏加、错加、失效、变 质等),操作失误等
对照结果判断：
阳性对照 阴性对照 替代对照 检测结果
结果判断
1 （－） 2 （＋） 3 （＋） 4 （－） 5 （＋） 6 （＋） 7 （＋）
（－） （＋） （＋） （－） （－） （－） （－）
（－）
（－） 抗体失活，操作有误
免疫组化结果判读标准
免疫组化结果判读标准
免疫组化技术用于检测和定量特定蛋白质在组织或细胞中的表达情况。
免疫组化结果的判读标准会因所检测的蛋白质和研究目的的不同而有所不同。
以下是一般免疫组化结果判读的一般原则：
1. 强阳性（Strong positive）：细胞或组织中存在大量的目标蛋白表达，通常显示为强烈的染色信号。
2. 中阳性（Moderate positive）：细胞或组织中存在适度的目标蛋白表达，染色信号强度介于强阳性和弱阳性之间。
3. 弱阳性（Weak positive）：细胞或组织中存在轻微的目标蛋白表达，染色信号强度较弱。
4. 阴性（Negative）：细胞或组织中不存在目标蛋白的表达，通常显示为无或非特异性染色。
需要注意的是，免疫组化结果的判读可能还需要结合组织或细胞的生理背景、对照组样本以及其他实验数据进行综合分析。
与实验室或领域专家进行讨论和解释结果也是非常
重要的。
此外，具体研究领域和目的可能会有特定的判读标准，因此建议参考相关的研究文献和指南以确定适用的判读标准。
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边缘反应、刀痕、皱折、坏死或
挤压区域不作为判断依据，应用“ 正反
法”原则
免疫组化标准化：
抗原特异性
抗体交叉反应和标记谱系 方法规范化 结果综合分析和判断
第七章 免疫组化结果的分析和判断
（要求：理解， 熟记， 会用）
第一节
免疫组化结果的判断原则
免疫组化结果的判断原则概括起来有 以下几点：
⒈必须同时设对照染色。没有对照染 色的免疫组化染色结果是不可信的。 ⒉抗原表达必须在特定部位。如LCA应 定位在细胞膜上；CK应定位在细胞浆内； PCNA及p53蛋白应定位在细胞核内；EMA应
当(组织固定不及时或固定不良所导致的
抗原弥散移位、洗涤不充分所导致的游 离试剂残留等)针对性的纠正对策，
即对症下药(具体纠正方法不展开讲了，
同学们可以自己阅读讲义p123-126) 。
第四节 阳性标记的形态特征和判断
免疫组化标记具有一定形态特点， 若能熟练掌握则有助于对免疫组化标记
三 、 阳 性 标 记 组 织 学 特 征 （ 以 HRPDAB/H2O2为例） 免疫组化染色阳性细胞在 组织中的分布排列形式可以有如下7种：① 局灶型；②弥漫型；③片块型；④网状型； ⑤腺管型；⑥腔缘型和⑦菊团型，等。这主
要取决于抗原抗体复合物在细胞内的分布和
阳性细胞在组织内的群体分布特点。
⒌对免疫组化标记结果的意义不能
绝对化，应结合临床资料、X线等影像 学及实验结果综合分析。
第二节
对照染色设计
(一）对照染色的目的
设对照的目的是为了排除假阴性和 假阳性。假阴性的原因主要有三：①组织 处理不当，抗原丢失过多或被遮蔽；②抗 体失活、效价过低或稀释度不合适（主要 指一抗，即特异性抗体）；③染色步骤遗
表中1～5结果无效，6、7结果可靠
染色失败原因：
均为阴性
均为弱阳性（除阴性对照）
背景染色过深
阳性对照好，待检标本弱阳性 阳性对照无背景，待检标本背景深
判断原则：
实验设计 抗体选择 抗原定位性
抗原分布不均一性
识别假阴性
识别假阳性
抗原丢失或减弱 抗体失活 操作不当 抗原弥散 抗原异位表达 瘤细胞吞噬 病变中正常组织残留 抗体交叉反应 内源性物质着色
第一抗体上清液取代第一抗体，其他步骤 不变的免疫染色试剂对照。结果应是阴性 或阳性着色明显减弱（吸收不全时）。
⑷抑制试验 是指用标记抗体和未标记抗
体（可以是一抗，也可以是二抗或桥抗
体）两者的混合物作试剂，其他步骤不 变的免疫组化染色试剂对照，结果其阳 性着色应成比例的减弱（等量或1：9） 。此试剂对照多用于直接法。
照、阴性组织及阴性试剂对照和自身
对照四大类：
⒈阳性组织对照 指用已证实含有靶抗原
的同源及不同源组织切片或细胞涂片与
待检实验切片同时作同样处理和免疫染 色的组织对照。正确的结果应呈现阳性 ，目的是为了证实所用免疫组化染色流 程的有效性，排除假阴性的可能。
⒉阴性组织对照
指用已证实不
含靶抗原的同步处理和免疫标记染 色的组织对照。正确的结果应为阴
绿色荧光和亮绿色耀眼荧光；
免疫酶标记（HRP- DAB/H2O2）则 表现为淡黄色细颗粒、棕黄色颗粒和褐
黄色粗颗粒，后者耀眼易见。一般图片
照像，原则上多取强阳性区域。
二 、 阳 性 标 记 细 胞 学 特 征 （ 以 HRPDAB/H2O2为例） 可分为①胞膜型；②胞核 型；③胞质(浆)型；④微绒毛型和⑤复合型 （胞膜-胞质兼有，胞核-胞质兼有，或微绒 毛-胞质兼有）等五种阳性细胞类型。这与 抗原所在部位相关联，但应注意排除因组 织固定不好引起的抗原弥散假象，尤其是 复合型图像。
假阳性是指实验切片呈阳性，阴性 组织对照或阴性试剂对照也呈阳性的结
果，谓之假阳性。其原因与内源性干扰 ，试剂不纯，交叉反应等有关。
假阴性是指实验切片呈阴性，阳性组
织对照及阴性试剂对照也均呈阴性的结果
，谓之假阴性。其原因与组织处理不当， 组织细胞抗原丢失或试剂错误(如漏加、 错加、失效、变质等),操作失误等有关。
对照结果判断：
阳性对照 1 2 3 4 5 6 7 （－） （＋） （＋） （－） （＋） （＋） （＋） 阴性对照 （－） （＋） （＋） （－） （－） （－） （－） 替代对照 （－） （＋） （－） （－） （＋） （－） （－） 检测结果 （－） （＋） (＋)(－) （＋） （＋） （－） （＋） 结果判断 抗体失活，操作有误 非特异性染色 阴性对照内含定位抗原 阳性对照不含定位抗原 非特异染色 检测标本不含抗体结合可靠 检测标本含抗体，结果可靠
指以缓冲液（PBS、TBS
等）取代第一抗体（主要的，必要时还
可做第二抗体及桥联抗体的空白取代） ，其他各步不变的试剂对照染色，结果 应为阴性。
⑵取代对照 指以所用方法第一抗体同源动
物的正常血清，或与本实验无关的抗体(靶
生物缺如的)取代第一抗体，其他步骤不变
的试剂对照染色，结果应为阴性。
⑶吸收试验 是指用事先经过量抗原吸收的
漏及差错，或显色剂的选择、缓冲液的pH
和离子强度不当等。
假阳性均系由多种因素造成的非特异
着色所致，原因主要有：①自发荧光或内
源酶等干扰；②抗体试剂不纯(特别是一 抗）；③操作失误，如污染、切片干枯或 显色剂操作不当等；④Fc受体的干扰，等 等。
（二）对照的种类及其选用目的 对照染色大致可分为阳性组织对
四、阳性标记强度特征
依照细胞阳性
着色程度（抗原含量），可分为弱阳性 （+）┅1分；中等阳性（++）┅2分；
强阳性（+++）┅3分。依照阳性细胞数
量，可分为：弱阳性（+ ，指阳性细胞 总数在25%以下）；
中等阳性（++,指阳性细胞总数在25%—
49%)；强阳性（+++ ，指阳性细胞总数 在50%以上)。目前多采用积分综合计量 。 计 算 公 式 为 ： （ + ） %x1 + （ ++ ） %x2+（+++）%x3；总数值<1.0者为（
+），1.0-1.5者为(++),>1.5者为(+++)。
至少随机观察5-10个HPF。
第五节
染色失败的可能原因
免疫组化染色的基本要求有二：①实验切片的阳
性抗原定位准确，呈色鲜明，背景着色浅或无，二者
的比值应大于1（阳性/背景）；②对照染色的结果应
附合要求。否则，所得实验结果都是错误的，或为假 阳性或为假阴性。
这类阴性试剂对照的选用原则是：
①空白对照不能省，其他对照在预实验
中应尽量多做，尤其是应用新抗体试剂 ；②对照必需与实验片同步进行染色； ③对照的结果应附合要求。
⒋自身对照
是指在同一标记切片上的自
身组织成分的阴性背景对照。即与靶抗原 阳性反应细胞或成分相邻的阴性背景结构 的显色，结果应为阴性或着色较浅，需与 阳性着色成分呈鲜明对比。目的在于排除
定位在细胞膜上，等等。不在抗原所在部
位的阳性着色，一概不能视为阳性。
⒊阴性结果不能视为抗原不表达。由 于检测方法灵敏度有高低之分，有时可因
染色方法灵敏度不够，而导致阴性反应， 判断时应注意。
⒋尽量避开出血、坏死及切片刀痕 和界面边缘细胞的阳性表达，特别是酶
免疫标记。因为这类阳性着色多系内源
干扰，或系人为因素所致。
结果的正确判断。特点包括定性、定位
和定量三方面。
免疫显色强度和阳性细胞密度是定
性定量指标，实际工作中常采用强度和
密度结合的方法综合计量，与抗原含量 有关；阳性细胞的着色形态及组织分布
特点主要是定位指标，与功能有关。
一、阳性标记免疫特征：分"弱(+) 、中(++)、强(+++)"三级。免疫荧光法（ FITC为例） 则表现为浅绿色荧光、明显
内源性干扰产生的假阳性和因抗原弥散移
位造成的错误结果。
第三节 非特异染色
非特异染色是指免疫组化染色过程
中产生的非靶抗原的呈色结果，属假阳
性，又称背景着色，能严重干扰免疫组 化染色结果的正确判断，应竭力避免或 减轻。其原因涉及免疫组化染色流程的 各个环节，可来自：
①内源性干扰(自发荧光、内源酶、内源 性生物素等)；②试剂污染(质量差，交 叉反应，Fc受体干扰等)；③组织处理不
性，目的是除外假阳性。
⒊阴性试剂对照
是指用于证实在免疫
组化染色中所用试剂，尤其是特异性抗
体试剂的有效性和可靠性而所设立的同
步免疫染色对照，包括有：空白对照；
替代对照；吸收试验和抑制试验，等。
目的在于除外假阳性和证实所用免疫组 化试剂及其技术方法的有效性和待检实 验切片免疫标记阳性结果的可靠性。
⑴空白对照