琼脂糖凝胶电泳及其影响因素
琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物
琼脂糖凝胶浓度对电泳结果的影响
总结词
琼脂糖凝胶浓度对DNA分子的迁移速度和分离效果具有重要影响。
详细描述
不同浓度的琼脂糖凝胶对DNA分子的迁移速度和分离效果不同。高浓度的琼脂糖凝胶可以增加DNA分子的阻力， 减缓其迁移速度，从而提高分辨率。而低浓度的琼脂糖凝胶则会使DNA分子迁移速度加快，但分辨率降低。因此， 应根据DNA分子的大小和数量选择合适的琼脂糖凝胶浓度。
可视化
通过染色剂染色，可以 将DNA片段可视化，便 于观察和记录结果。
缺点
分辨率有限
琼脂糖凝胶电泳的分辨率有限，对于一些长度相近的DNA片段可能无 法区分。
易产生误差
由于操作过程中涉及到人为因素，如加样、凝胶制作等，容易产生误 差。
对小片段DNA检测效果不佳
对于小片段的DNA，琼脂糖凝胶电泳的检测效果不佳，可能会漏检。
电泳温度对电泳结果的影响
总结词
电泳温度对DNA分子的运动速度和琼脂糖凝胶的黏度有影响，进而影响电泳结 果。
详细描述
在一定范围内，较高的电泳温度可以提高DNA分子的运动速度，从而提高分辨 率。但温度过高可能导致凝胶变形和DNA分子变性，影响电泳结果。因此，应 根据DNA分子的大小和性质选择适宜的电泳温度。
在电场中，DNA分子会受到正极的吸引，向正极方向移动。
迁移速度与DNA分子大小相关
02
DNA分子越小，迁移速度越快；DNA分子越大，迁移速度越慢。
分离效果
03
通过琼脂糖凝胶的孔径大小和电场强度，可以将不同大小的
DNA分子进行分离。
琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物的原理
琼脂糖凝胶孔径大小
DNA染料染色
琼脂糖凝胶具有不同孔径大小，可分离不 同大小的DNA分子。
琼脂糖凝胶电泳常见问题分析
文档来源为:从网络收集整理.word 版本可编辑.欢迎下载支持.1文档来源为:从网络收集整理.word 版本可编辑.欢迎下载支持.琼脂糖凝胶电泳常见问题分析问题可能原因解决方法DNA Marker 降解 核酸酶污染每次吸取时更换灭菌枪头，勿将电泳缓冲液带入管中；用后密闭4°C 保存保存不当4°C 或-20°C 保存，避免多次反复冻融；不可加热DNA Marker 无法正确分离 琼脂糖质量差使用质量可靠的琼脂糖制胶 电泳缓冲液多次使用后失效 更换缓冲液 条带黯淡核酸浓度过低 增加上样量核酸降解使用不含核酸酶的试剂和耗材制备样品 DNA 条带被示踪染料掩盖提高上样量；避免使用与目的片段迁移率相同的示踪染料条带模糊或弥散电泳缓冲液多次使用后失效 更换缓冲液核酸部分降解使用不含核酸酶的试剂和耗材制备样品 核酸样品纯度差，含有DNA 结合蛋白或高浓度的盐份 酚/仿抽提或乙醇沉淀去除蛋白、盐份等杂质电压过低，电泳时间过长根据凝胶大小和电泳缓冲液类型，使用适当的电压进行电泳染色时间过长或拍照前放置过久，DNA 条带弥散电泳结束后及时观察、拍照 条带缺失DNA 条带分子量过大使用脉冲凝胶电泳分子量接近的DNA 条带没有分开 选择适当的凝胶浓度进行电泳电泳缓冲液使用不当SD 和TBE 缓冲液适于分析较小分子量的DNA 片段，大片段分子不能完全分离；TAE 缓冲液不适于分离很小的DNA 片段电泳时间过长或电压过高，DNA 走出凝胶缩短电泳时间，调整电压电极插反，DNA 走出凝胶正确连接电极方向 条带大小不正确核酸降解或形成聚合物加热处理或重新制备样品λ DNA 酶切Marker 的cos 位点复性 电泳前65°C 加热5分钟，冰上冷却5分钟以后再上样相同分子量的DNA 片段由于结构或判断DNA 分子是否有特殊结构，分子是否有特殊结构，如缺口、超如缺口、超序列的差异而有不同的迁移率 螺旋、二聚体等；富含AT碱基的DNA迁移率比同分子量富含GC碱基的DNA片段慢 梳子变形，点样孔不在同一水平线上 使用完好的梳子制胶带型异常 不同样本的上样条件不同 选用相同的上样缓冲液，上样量尽可能接近上样量过大或过小 选择合适大小的上样孔，样品应完全覆盖点样孔底部核酸样品纯度差，含有DNA结合蛋白或高浓度的盐份酚/仿抽提或乙醇沉淀去除蛋白、盐份等杂质电泳缓冲液未完全浸没凝胶 上样和电泳时，确保缓冲液始终能完全覆盖凝胶电压过高或电泳时间过长致使凝胶过热和DNA变性 根据凝胶大小和电泳缓冲液类型，使用适当的电压进行电泳凝胶中加入EB造成染色不均 加入EB时充分混匀或电泳结束后再染色凝胶中有气泡或污染物 使用纯水和洁净容器制胶；缓慢灌胶，并赶除气泡点样孔质量差 待凝胶完全凝聚后再取出梳子小片段扩散,条带模糊,粗 错误选择了低浓度凝胶错误选择了低浓度凝胶,,观察大片段用低浓度凝胶用低浓度凝胶,,观察小片段要用高浓度比如观察100bp的小片段用2%2%凝胶跑电泳凝胶跑电泳 琼脂糖质量不好琼脂糖质量不好,,质量不好的琼脂糖分离小片段容易扩散分离小片段容易扩散,,即使是使用高浓度凝胶换用质量好的琼脂糖选择了不合适的电泳缓冲液 SD和TBE缓冲液适于分析较小分子量的DNA片段，大片段分子不能完全分离；TAE缓冲液不适于分离很小的DNA片段DNA凝胶电泳简介一、实验原理DNA电泳是基因工程中最基本的技术，DNA制备及浓度测定、目的DNA片段的分离，重组子的酶切鉴定等均需要电泳完成。
如何分析琼脂糖凝胶电泳图
如何分析琼脂糖凝胶电泳图凝胶电泳结果分析常见问题原因对策DNA条带模糊DNA降解实验过程中应避免核酸酶污染。
电泳缓冲液陈旧电泳缓冲液多次使用后，离子强度降低，PH值上升，缓冲能力减弱，从而影响电泳效果。
TBE建议使用10就更换。
所用电泳条件不合适电泳时电压不应超过20V/cm，温度<30℃，巨大DNA链电泳，温度<15℃，检查所用电泳缓冲液的缓冲能力，注意经常更换。
DNA上样量过多减少凝胶中DNA上样量DNA含盐过高电泳前通过乙醇沉淀去除多余盐分。
有蛋白污染电泳前酚抽提去除蛋白。
DNA变性电泳前勿加热，用20mM NaCl缓冲液稀释DNA。
出现片状拖带或涂抹带PCR扩增时出现涂抹带、片状带或地毯样带，往往由于酶量多或者酶的质量差，dNTP浓度高，Mg2+浓度高，退火温度过低，循环次数多。
减少酶量或更换酶，减少dNTP浓度，适当降低Mg2+浓度，增加模板量，减少循环次数。
不规则DNA 带迁移电泳条件不合适电泳时电压不应超过20V/cm，温度<30℃，巨大DNA链电泳，温度<15℃，检查所用电泳缓冲液的缓冲能力，注意经常更换。
DNA变性电泳前勿加热，用20mM NaCl缓冲液稀释DNA。
带弱或无DNA 带DNA上样量不够增加DNA上样量，聚丙烯酰胺凝胶电泳比琼脂糖电泳灵敏度高，上样量可适当降低。
DNA降解实验过程中应避免核酸酶污染。
DNA跑出凝胶缩短电泳时间，降低电压，增加凝胶浓度。
EB染色的DNA所用光源不合适应用短波长（254nm）的紫外光源。
DNA带缺尖DNA跑出凝胶缩短电泳时间，降低电压，增加凝胶浓度。
分子大小相近的DNA带不易分辨增加电泳时间，核准正确凝胶浓度DNA变性电泳前勿加热，用20mM NaCl缓冲液稀释DNA。
DNA链大，常规电泳不合适。
在脉冲凝胶电泳上个分析。
电泳时ladder 扭曲配胶的缓冲液与电泳的缓冲液不是同时配制。
同时配制，电泳缓冲液高出胶的1-2mm即可。
琼脂糖凝胶电泳注意事项
琼脂糖凝胶电泳常见错误及注意事项琼脂糖凝胶电泳是一种常用的分子生物学实验技术。
在实验过程中，为避免常见错误和提高实验效果，需要注意以下几点：1. 样品制备：在样品制备过程中，需要严格控制样品的来源、处理和质量。
避免污染和杂质的污染，以免影响实验结果。
2. 凝胶制备：在凝胶制备过程中，需要严格按照实验方案的要求制备凝胶。
应避免在制备过程中产生气泡和缺陷，保证凝胶质量的均一性和完整性。
3. 负载样品：样品的负载量也是影响实验结果的一个重要因素。
负载量过多或者过少，都会影响实验结果的准确性。
因此，需要根据实验要求和样品特点调整合适的负载量。
4. 配置电解液：电解液是凝胶电泳实验中的重要组成部分。
配置电解液应按照实验方案的要求进行，不能进行随意变更。
5. 进行电泳实验：在进行电泳实验时需要注意以下几点：（1）电泳时间：电泳时间应根据实验要求和实验人员的经验来调整，以保证样品可以在凝胶中分离出来。
（2）使用电源：电源是电泳实验中的重要设备，需要使用与实验要求相符的电源，避免因电源不适应或使用不当引起实验故障。
（3）电极夹：电极夹应牢固可靠，避免在实验过程中出现松动或断电等情况。
6. 结果解读：琼脂糖凝胶电泳实验结果的解读需要根据实验要求和实验人员的经验进行。
在进行实验结果的解读时需要注意以下几点：（1）确定分离带：分离带越清晰越好，可以通过显微镜来观察分离带是否正常。
（2）确定目标DNA：确定目标DNA时需要考虑实验目的和分离带的特点来确定是否符合要求。
（3）保留样品：需要在实验结果出来后保留样品，以备后续实验需要。
总之，在进行琼脂糖凝胶电泳实验时需要注意以上几点，以达到实验目的并减少实验错误的发生。
核酸电泳方法
核酸电泳是一种分离核酸的方法，主要包括琼脂糖凝胶电泳和聚丙烯酰胺凝胶电泳。
以下是两种核酸电泳方法的介绍：
1.琼脂糖凝胶电泳：
（1）将琼脂糖在所需缓冲液中加热熔化成清澈、透明的溶胶，然后倒入胶模中，凝固后将形成一种固体基质，其密度取决于琼脂糖的浓度。
（2）将凝胶置电场中，在中性pH值下带电荷的核酸通过凝胶网孔向阳极迁移，迁移速率受到核酸的分子大小、构象、琼脂糖浓度、所加电压、电场、电泳缓冲液、嵌入染料的量等因素影响。
（3）在不同条件下电泳适当时间后，大小、构象不同的核酸片段将处在凝胶不同位置上，从而达到分离的目的。
（4）凝胶的制备和电泳操作方法包括以下步骤：选择琼脂糖、配制缓冲液、加热熔化琼脂糖、灌制凝胶、电泳、染色和观察。
2.聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）：
（1）聚丙烯酰胺凝胶是由丙烯酰胺和交联剂聚乙烯吡咯烷酮（PVP）在催化剂作用下形成的三维网状结构。
该凝胶具有孔径大小适合核酸分离，且与样品间无反应的特点。
可通过改变基质的百分比来调整孔径大小，从而有效分离不同大小的核酸。
（2）凝胶电泳常用于分离蛋白质，例如SDS-PAGE技术是常用的蛋白表达分析技术之一。
它根据检体中蛋白质分子量大小的不同，使其在电泳胶中分离。
在大肠杆菌表达纯化外源蛋白的实验中，SDS-PAGE 是必不可少的操作步骤。
（3）聚丙烯酰胺凝胶电泳适用于分离同工酶及其亚型、大分子核酸等。
琼脂糖凝胶电泳
原理琼脂糖凝胶电泳是用琼脂糖作支持介质的一种电泳方法。
其分析原理与其他支持物电泳的最主要区别是：它兼有“分子筛”和“电泳”的双重作用。
琼脂糖凝胶具有网络结构，物质分子通过时会受到阻力，大分子物质在涌动时受到的阻力大，因此在凝胶电泳中，带电颗粒的分离不仅取决于净电荷的性质和数量，而且还取决于分子大小，这就大大提高了分辨能力。
但由于其孔径相当大，对大多数蛋白质来说其分子筛效应微不足道，现广泛应用于核酸的研究中。
蛋白质和核酸会根据pH不同带有不同电荷，在电场中受力大小不同，因此跑的速度不同，根据这个原理可将其分开。
电泳缓冲液的pH在6~9之间，离子强度0.02~0.05为最适。
常用1%的琼脂糖作为电泳支持物。
琼脂糖凝胶约可区分相差100bp的DNA片段，其分辨率虽比聚丙烯酰胺凝胶低，但它制备容易，分离范围广。
普通琼脂糖凝胶分离DNA的范围为0.2-20kb，利用脉冲电泳，可分离高达10^7bp的DNA片段。
操作流程准备干净的配胶板和电泳槽注意DNA酶污染的仪器可能会降解DNA，造成条带信号弱、模糊甚至缺失的现象。
选择电泳方法一般的核酸检测只需要琼脂糖凝胶电泳就可以；如果需要分辨率高的电泳，特别是只有几个bp的差别应该选择聚丙烯酰胺凝胶电泳；用普通电泳不合适的巨大DNA链应该使用脉冲凝胶电泳。
注意巨大的DNA链用普通电泳可能跑不出胶孔导致缺带。
正确选择凝胶浓度对于琼脂糖凝胶电泳，浓度通常在0.5～2％之间，低浓度的用来进行大片段核酸的电泳，高浓度的用来进行小片段分析。
低浓度胶易碎，小心操作和使用质量好的琼脂糖是解决办法。
注意高浓度的胶可能使分子大小相近的DNA带不易分辨，造成条带缺失现象。
适合的电泳缓冲液常用的缓冲液有TAE和TBE，而TBE比TAE有着更好的缓冲能力。
电泳时使用新制的缓冲液可以明显提高电泳效果。
注意电泳缓冲液多次使用后，离子强度降低，pH值上升，缓冲性能下降，可能使DNA电泳产生条带模糊和不规则的DNA带迁移的现象。
琼脂糖凝胶电泳条带不清晰的原因
琼脂糖凝胶电泳条带不清晰的原因琼脂糖凝胶电泳是一种常用的分析和分离生物大分子的方法。
然而，有时候在进行琼脂糖凝胶电泳实验时，我们可能会遇到条带不清晰的问题，这给结果的解读和分析带来了困扰。
下面我将介绍一些可能导致琼脂糖凝胶电泳条带不清晰的原因。
1. DNA样品质量不佳琼脂糖凝胶电泳的前提是获得高质量的DNA样品。
如果DNA样品质量不佳，比如存在脏带、降解或者污染，都会导致条带不清晰。
因此，在进行实验之前，我们需要对DNA样品进行质控，确保其质量符合要求。
2. 样品预处理不当在进行琼脂糖凝胶电泳之前，我们通常需要对DNA样品进行一些预处理，比如酶切、PCR扩增或者纯化等。
如果预处理过程中存在问题，比如酶切反应时间过长、PCR扩增过程中出现非特异性扩增等，都会导致条带不清晰。
3. 聚丙烯酰胺凝胶浓度选择不当琼脂糖凝胶电泳中，聚丙烯酰胺凝胶的浓度是影响条带清晰度的重要因素之一。
一般来说，较低浓度的凝胶适用于较大的DNA片段分离，而较高浓度的凝胶适用于较小的DNA片段分离。
如果选择的凝胶浓度不合适，就会导致条带模糊不清。
4. 电泳条件设置不当电泳条件的设置也是影响琼脂糖凝胶电泳结果的重要因素。
比如，电泳电压、电泳时间和电泳缓冲液的配制等都会影响条带的清晰度。
如果电压过高或者电泳时间过长，都会导致条带模糊不清。
此外，如果电泳缓冲液的配制不正确，比如pH值不稳定或者离子浓度不合适，也会影响条带的清晰度。
5. 负载样品量过多或过少在进行琼脂糖凝胶电泳时，负载样品量的选择也是非常关键的。
如果负载样品量过多，会导致条带扩散，模糊不清；如果负载样品量过少，条带可能会变得非常弱或者根本看不到。
因此，在进行负载样品时，需要根据实验的需要选择适当的样品量。
琼脂糖凝胶电泳条带不清晰的原因可能是多方面的，包括DNA样品质量不佳、样品预处理不当、聚丙烯酰胺凝胶浓度选择不当、电泳条件设置不当以及负载样品量过多或过少等。
在进行琼脂糖凝胶电泳实验时，我们需要仔细检查每一个步骤，确保实验条件的准确性和合理性，从而获得清晰可靠的结果。
DNA琼脂糖凝胶电泳
DNA琼脂糖凝胶电泳一,实验原理琼脂糖凝胶电泳是分离和纯化DNA 片段的常用技术.把DNA样品加入到一块包含电解质的多孔支持介质(琼脂糖凝胶)的样品孔中,并置于静电场上.由于DNA分子的双螺旋骨架两侧带有含负电荷的磷酸根残基,因此在电场中向正极移动.在一定的电场强度下,DNA分子的迁移速度取决于分子筛效应.具有不同的相对分子质量的DNA片段泳动速度不一样,因而可依据DNA分子的大小来使其分离.凝胶电泳不仅可分离不同分子质量的DNA, 也可以分离相对分子质量相同,而构型不同的DNA分子.在电泳过程中可以通过示踪染料或相对分子质量标准参照物和样品一起进行电泳而得到检测.相对分子质量标准参照物相对可以提供一个用于确定DNA片段大小的标准.在凝胶中加入少量溴化乙锭(ethidium bromide, EB),其分子可插入DNA的碱基之间,形成一种络合物,在254～365nm波长紫外光照射下,呈桔红色荧光,因此也可对分离的DNA进行检测.一般琼脂糖凝胶电泳适用于大小在0.2kb～50kb范围内的DNA 片段.本实验介绍琼脂糖凝胶的制备以及琼脂糖凝胶电泳在DNA片段分离中的应用方法.琼脂糖凝胶浓度（%）线状DNA分子分离范围（kb）0.3 5--600.6 1--200.9 0.5--71.2 0.4--61.5 0.2--32.0 0.1--2琼脂糖凝胶电泳是用于分离纯化和鉴定核酸的方法，根据琼脂糖的溶解温度，把琼脂糖分为一般琼脂糖和低熔点琼脂糖。
低熔点琼脂糖的熔点为62--65,溶解后在37下维持液体状态约数小时,主要用于DNA片断的回收、质粒与外源性DNA的快速连接等。
DNA在琼脂糖凝胶中的迁移速度与琼脂糖浓度、DNA分子量及其构象、电泳缓冲液、电场强度等因素有关，一般说来，DNA片断越大或者琼脂糖浓度越大，其迁移速率越大；而电场强度越高，其迁移速率越大。
不同浓度琼脂糖凝胶DNA分离范围见上图表。
二,仪器及试剂1.仪器及耗材:水平电泳槽,电泳仪,凝胶成像分析系统,微波炉,微量移液器,透明胶带,点样或parafilm,100 ml或250 ml锥形瓶,量筒,吸头等.2.试剂及配制:50×TAE缓冲液的配制:2 mol/L Tris-乙酸,0.05 mol/L EDTA(pH 8.0)配制1000 mlTris 242 g冰乙酸 57.1 ml0.5 mol/L EDTA 100 ml加入600 ml去离子水后搅拌溶解,将溶液定容至1 L后.高温高压灭菌,室温保存.1×TAE缓冲液的配制:称量20 ml的50×TAE缓冲液,再加入980 ml的去离子水.溴化乙啶贮存液:10 mg/ml 溴化乙啶配制:100 ml称取1 g溴化乙啶,置于100 ml烧杯中,加入80 ml去离子水后搅拌溶解.将溶液定容至100 ml后,转移到棕色瓶中.室温保存.6×上样缓冲液:0.25%溴酚蓝,0.25%二甲苯青FF,30%甘油.配制:10 ml溴酚蓝 25 mg二甲苯青FF 25 mg甘油 3 ml用6×TAE缓冲液定溶至10 ml,分装成1 ml/管.-20℃保存.其它试剂:DNA样品,DNA Ladder ,琼脂糖三,操作步骤1. 制备1%琼脂糖凝胶(大胶用70ml,小胶用50ml):称取0.7 g(0.5g)琼脂糖置于锥形瓶中,加入70 ml(50ml)1×TAE,瓶口倒扣小烧杯.微波炉加热煮沸3次至琼脂糖全部融化,摇匀,即成1.0%琼脂糖凝胶液.2. 胶板制备:取电泳槽内的有机玻璃内槽(制胶槽)洗干净,晾干,放入制胶玻璃板.取透明胶带将玻璃板与内槽两端边缘封好,形成模子.将内槽置于水平位置,并在固定位置放好梳子.将冷却到65℃左右的琼脂糖凝胶液混匀小心地倒入内槽玻璃板上,使胶液缓慢展开,直到整个玻璃板表面形成均匀胶层.室温下静置直至凝胶完全凝固,垂直轻拔梳子,取下胶带,将凝胶及内槽放入电泳槽中.添加1×TAE电泳缓冲液至没过胶板为止.3. 加样:在点样板或parafilm上混合DNA样品和上样缓冲液,上样缓冲液的最终稀释倍数应不小于1X.用10 ul微量移液器分别将样品加入胶板的样品小槽内,每加完一个样品,应更换一个加样头,以防污染,加样时勿碰坏样品孔周围的凝胶面.(注意:加样前要先记下加样的顺序).4. 电泳:加样后的凝胶板立即通电进行电泳,电压60-100V,样品由负极(黑色)向正极(红色)方向移动.电压升高,琼脂糖凝胶的有效分离范围降低.当溴酚蓝移动到距离胶板下沿约1cm处时,停止电泳. (5)电泳完毕后,取出凝胶,用含有0.5 ug/ml的溴化乙锭1×TAE溶液染色约20 min,再用清水漂洗10 min.(6)观察照相:在紫外灯下观察,DNA存在则显示出红色荧光条带,采用凝胶成像系统拍照保存.四,常见问题及注意事项1.配琼脂糖时应使其完全熔化后方可制胶.2.琼脂糖凝胶易于破碎,操作时要轻缓.3.电泳时应注意电源线路,预防触电.4.溴化乙淀具有致癌作用,配制及使用时应带乳胶或一次性塑料手套.并在专门的实验室内使用.5.紫外线对人体有损伤作用,开灯时间不宜太长,注意防护.6.DNA带形状模糊:DNA加样过多;电压太高;凝胶中有气泡.7.质粒DNA的存在形式有3种,①共价闭环DNA(cccDNA),常以超螺旋形式存在;②开环DNA(ocDNA),此种质粒DNA的两条链中有一条发生一处或多处断裂,因此可以自由旋转从而消除张力,形成松弛的环状分子;③线状DNA,因质粒DNA的两条链在同一处断裂而造成.因此质粒DNA电泳的结果中有可能出现三条泳带,它们的泳动速度为: cccDNA > 线状DNA > ocDNA.添加来自TIANGEN的资料:1,琼脂糖:不同厂家＼不同批号的琼脂糖，其杂质含量不同,影响DNA的迁移及其荧光背景的强度,应有选择的使用.2,凝胶的制备:凝胶中所加的缓冲液应该与电泳槽中的相一致,溶化的凝胶应该及时倒入板中,避免倒入之前凝固结块,倒入板中的凝胶应该避免出现气泡,以免影响电泳结果.3,电泳缓冲液:为保持电泳所需的离子强度和PH,应经常更新电泳缓冲液.4,样品加入量:一般情况下,0.5CM宽的梳子可加0.5微克的DNA量,加样量的多少依据加样孔的大小及DNA中片断的数量和大小而定.当加样孔大时,样品上样量应相应加大,否则会造成条带浅甚至辨认不清楚;反之,则应该适当减少加样量,但是上样量过多会造成加样孔超载,从而导致拖尾或扩散,对于较大的DNA此现象更明显.5,DNA样品中盐浓度会影响DNA的迁移率,平行对照样品中应该使用同样的缓冲条件以消除这种影响.6,DNA迁移率取决于琼脂糖的浓度,迁移分子的形状及其大小.采用不同浓度的凝胶有可能分辨范围广泛的DNA分子,制备琼脂糖凝胶可根据DNA分子的范围来决定凝胶的浓度.小片断DNA的检测应采用聚丙烯酰胺凝胶电泳,以提高分辨率.。
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琼脂糖凝胶电泳及其影响因素
琼脂糖或聚丙烯酰胺凝胶电泳是分离鉴定和纯化DNA片段的标准方法。
该技术操作简便快速，可以分辨用其它方法（如密度梯度离心法）所无法分离的DNA片段。
当用低浓度的荧光嵌入染料溴化乙啶(Ethidium bromide, EB)染色,在紫外光下至少可以检出1-10ng的DNA条带,从而可以确定DNA片段在凝胶中的位置。
此外,还可以从电泳后的凝胶中回收特定的DNA条带,用于以后的克隆操作。
琼脂糖和聚丙烯酰胺可以制成各种形状、大小和孔隙度。
琼脂糖凝胶分离DNA片度大小范围较广,不同浓度琼脂糖凝胶可分离长度从200bp至近50kb的DNA片段。
琼脂糖通常用水平装置在强度和方向恒定的电场下电泳。
聚丙烯酰胺分离小片段DNA(5-500bp)效果较好,其分辩力极高,甚至相差1bp的DNA片段就能分开。
聚丙烯酰胺凝胶电泳很快,可容纳相对大量的DNA,但制备和操作比琼脂糖凝胶困难。
聚丙烯酰胺凝胶采用垂直装置进行电泳。
目前,一般实验室多用琼脂糖水平平板凝胶电泳装置进行DNA电泳。
琼脂糖主要在DNA制备电泳中作为一种固体支持基质,其密度取决于琼脂糖的浓度。
在电场中,在中性pH值下带负电荷的DNA向阳极迁移,其迁移速率由下列多种因素决定:
1、 DNA的分子大小:
线状双链DNA分子在一定浓度琼脂糖凝胶中的迁移速率与DNA分子量对数成反比，分子越大则所受阻力越大，也越难于在凝胶孔隙中蠕行，因而迁移得越慢。
2、琼脂糖浓度
一个给定大小的线状DNA分子,其迁移速度在不同浓度的琼脂糖凝胶中各不相同。
DNA电泳迁移率的对数与凝胶浓度成线性关系。
凝胶浓度的选择取决于DNA分子的大小。
分离小于0.5kb的DNA片段所需胶浓度是1.2-1.5%,分离大于10kb的DNA分子所需胶浓度为0.3-0.7%,
DNA片段大小间于两者之间则所需胶浓度为0.8-1.0%。
3、 DNA分子的构象
当DNA分子处于不同构象时,它在电场中移动距离不仅和分子量有关,还和它本身构象有关。
相同分子量的线状、开环和超螺旋DNA在琼脂糖凝胶中移动速度是不一样的,超螺旋DNA移动最快,而线状双链DNA 移动最慢。
如在电泳鉴定质粒纯度时发现凝胶上有数条DNA带难以确定是质粒DNA不同构象引起还是因为含有其他DNA引起时,可从琼脂糖凝胶上将DNA带逐个回收,用同一种限制性内切酶分别水解,然后电泳,如在凝胶上出现相同的DNA图谱,则为同一种DNA。
4、电源电压
在低电压时,线状DNA片段的迁移速率与所加电压成正比。
但是随着电场强度的增加，不同分子量的DNA片段的迁移率将以不同的幅度增长,片段越大,因场强升高引起的迁移率升高幅度也越大,因此电压增加，琼脂糖凝胶的有效分离范围将缩小。
要使大于2kb的DNA片段的分辨率达到最大,所加电压不得超过5v/cm。
5、嵌入染料的存在
荧光染料溴化乙啶用于检测琼脂糖凝胶中的DNA,染料会嵌入到堆积的碱基对之间并拉长线状和带缺口的环状DNA，使其刚性更强,还会使线状DNA迁移率降低15％。
6、离子强度影响
电泳缓冲液的组成及其离子强度影响DNA的电泳迁移率。
在没有离子存在时(如误用蒸馏水配制凝胶),电导率最小,DNA几乎不移动,在高离子强度的缓冲液中(如误加10×电泳缓冲液),则电导很高并明显产热,严重时会引起凝胶熔化或DNA变性。
对于天然的双链DNA,常用的几种电泳缓冲液有TAE[含EDTA (pH8.0)和Tris-乙酸],TBE(Tris-硼酸和EDTA),TPE(Tris-磷酸和EDTA),一般配制成浓缩母液,储于室温。