乳酸链球菌素的研究进展

Ｎｏ．１．２００６乳酸链球菌素（Ｎｉｓｉｎ）是世界上公认安全的防腐剂，是一种由微生物代谢所产生的具有很强杀菌作用的天然代谢产物。

乳酸链球菌素本身具有许多优良性质：首先，容易被人体消化道中的一些蛋白酶和胰蛋白酶所降解，不会在体内蓄积而引起不良反应，并且对食品的色、香、味等无不良影响［１－２］。

使用它还可以降低杀菌温度，减少热处理时间，因此能改进食品的营养价值、风味、结构、颜色等性状，同时还可节省能耗。

Ｎｉｓｉｎ本身具有热稳定性，并耐酸、耐低温贮藏，Ｎｉｓｉｎ作为一种理想的天然防腐剂获得越来越广泛的应用。

１乳酸链球菌素的研究现状１．１乳酸链球菌素的分子结构乳酸链球菌素（Ｎｉｓｉｎ）的分子式为Ｃ１４３Ｈ２２８Ｎ４２Ｏ３７Ｓ７，含有３４个氨基酸残基，分子量为３５１０Ｄａ。

Ｎｉｓｉｎ在天然状态下主要有两种形式，分别为ＮｉｓｉｎＡ和ＮｉｓｉｎＺ［３］，它们之间的差别在于氨基酸顺序中第２７位氨基酸不同，在ＮｉｓｉｎＡ中是组氨酸，在ＮｉｓｉｎＺ中是天冬氨酸，在其基因结构上的第１４８位脱氧核苷酸不同是造成差别的根本原因。

一般而言，在同样浓度下，ＮｉｓｉｎＺ的溶解度和抑菌能力比ＮｉｓｉｎＡ要强。

１．２乳酸链球菌素的性质１．２．１物理和化学性质Ｎｉｓｉｎ的溶解性、稳定性都与溶液的ｐＨ值密切相关。

Ｎｉｓｉｎ的溶解度随ｐＨ值的下降而提高，ｐＨ值２．５时溶解度为１２％，ｐＨ值为５．０时下降到４％，在中性及碱性条件下几乎不溶解［４］。

实验结果表明，Ｎｉｓｉｎ在酸性条件下极为稳定，ｐＨ２．０条件下可耐受高温处理（１２１℃，１５ｍｉｎ），而无活力损失，而在中性或碱性条件下即发生失活。

１．２．２生物学特性当α－胰蛋白酶、胰酶制剂和枯草杆菌肽作用Ｎｉｓｉｎ后，会使其失去活性，但羧肽酶Ａ、羧肽酶Ｅ、肠肽酶、胃蛋白酶和胰蛋白酶对Ｎｉｓｉｎ无作用。

Ｈｕｒｓｔ报道，Ｎｉｓｉｎ对α－凝乳蛋白酶、胰酶、李红，赵春燕＊（沈阳农业大学，沈阳１１０１６１）摘要：乳酸链球菌素是某些乳链球菌产生的一种多肽物质，是一种高效、无毒副作用的天然生物防腐剂。

综述了乳酸链球菌素的研究开发与生产应用进展。

关键词：乳酸链球菌素；防腐剂；研究进展中图分类号：ＴＳ２０１．３文献标识码：Ａ文章编号：１００５－９９８９（２００６）０１－００７５－０４ＲｅｓｅａｒｃｈａｎｄｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｏｆｎｉｓｉｎＬＩＨｏｎｇ，ＺＨＡＯＣｈｕｎ－ｙａｎ（ＳｈｅｎｙａｎｇＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｓｈｅｎｙａｎｇ１１０１６１）Ａｂｓｔｒａｃｔ：ＮｉｓｉｎｉｓａｎａｎｔｉｂａｃｔｅｒｉａｌｍｕｌｔｉｐｅｐｔｉｄｅｐｒｏｄｕｃｅｄｂｙｃｅｒｔａｉｎｓｔｒａｉｎｏｆＬａｃｔｏｃｏｃｃｕｓｌａｃｔｉｓ．Ｉｔｉｓａｈｉｇｈ－ｅｆｆｉ－ｃｉｅｎｃｙａｎｄｎｏｐｏｉｓｏｎｏｕｓｅｆｆｅｃｔｎａｔｕｒａｌｂｉｏｐｒｅｓｅｒｖａｔｉｖｅ．Ｔｈｉｓｐａｐｅｒｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅｄｅｓｃｒｉｂｅｄｒｅｓｅａｒｃｈｅｘｐｌｏｉｔａ－ｔｉｏｎａｎｄｐｒｏｇｒｅｓｓａｂｏｕｔｐｒｏｄｕｃｅａｎｄａｐｐｌｉｅｓｏｆｎｉｓｉｎ．Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：ｎｉｓｉｎ；ｐｒｅｓｅｒｖａｔｉｖｅ；ｒｅｓｅａｒｃｈａｎｄｐｒｏｇｒｅｓｓ乳酸链球菌素的研究进展收稿日期：２００５－０７－３０＊通讯作者基金项目：沈阳农业大学青年教师科技基金（２００３）项目。

作者简介：李红（１９７９－），女，辽宁铁岭人，硕士研究生，研究方向为微生物资源。

７５Ｎｏ．１．２００６消化酶、唾液酶等很敏感，但对粗制凝乳酶、脂酶、淀粉酶不敏感，在酸性条件下，１００℃、１０ｍｉｎ对链酶蛋白酶不敏感［５］。

１．３乳酸链球菌素的抑菌谱Ｎｉｓｉｎ能抑制大部分革兰阳性菌及其芽孢的生长和繁殖，如葡萄球菌属、链球菌属以及梭状芽孢杆菌属和芽孢杆菌属的细菌，特别是对金黄色葡萄球菌、溶血链球菌、肉毒杆菌作用明显［６］。

在一定条件下，如冷冻、加热、降低ｐＨ值、ＥＤＴＡ处理等，乳酸链球菌素亦可抑制一些革兰阴性菌，如沙门氏菌、大肠杆菌、假单胞菌等的生长。

１．４乳酸链球菌素的抑菌机理Ｎｉｓｉｎ的抑菌机理是近年来的研究热点之一，并不断取得突破。

其抑菌作用主要是杀菌，而非抑菌或溶菌。

Ｎｉｓｉｎ对营养细胞的作用主要是在细胞膜上，它可以抑制细菌细胞壁中肽聚糖等的生物合成，使细胞膜和磷脂化合物的合成受阻，导致细胞内物质外泄，引起细胞裂解［７］。

１．５Ｎｉｓｉｎ合成的遗传学研究编码Ｎｉｓｉｎ的遗传密码的确切位置有两种理论，一种认为它与质粒连锁，另一种则认为是在染色体上。

支持前一种观点的主要证据有：１９４７年，Ｋｏｚａｋ研究产Ｎｉｓｉｎ菌株的突变现象时发现，若先以原黄素或溴乙啶诱变并进行高温处理，再以ＮＴＧ进行诱变，未检测到回复突变株。

并据此推测Ｎｉｓｉｎ基因可能位于质粒上。

进一步研究发现，Ｎｉｓｉｎ的产生与一个１７．５ＭＤａ的质粒有关。

１９９１年，Ｋａｌｅｔｔａ和Ｅｎｔｉａｎ从乳酸链球菌素６Ｆ３的质粒中成功克隆到了编码Ｎｉｓｉｎ的结构基因。

但是，另一些研究者认为Ｎｉｓｉｎ基因位于染色体上，并有实验证明一些产Ｎｉｓｉｎ的菌株并不存在质粒［８］。

对Ｎｉｓｉｎ基因定位的研究最近取得的一些突破性进展，一些研究者根据对染色体的缺失与杂交实验提出Ｎｉｓｉｎ结构基因与染色体上的一个可接合转移的转座子有关。

Ｈｏｒｎ等人则提出Ｎｉｓｉｎ基因存在于一个７０ｋｂ大小的转座子Ｔｎ５３０１中，同时另一些研究者的工作也证实了这个转座子的存在，且发现Ｎｉｓｉｎ基因座是不稳定的。

这些发现可能提示我们Ｎｉｓｉｎ基因位于一个可转座于质粒和染色体上的转座子中，在不同的菌株中，Ｎｉｓｉｎ基因的位置不一定相同［９］。

１９８８年，Ｎｉｓｉｎ基因首次被克隆出来。

不同于大部分的多肽类抗生素，Ｎｉｓｉｎ前体蛋白是由核糖体合成，经过一系列包括脱水、硫环形成等复杂的翻译后加工过程，最终形成有活性的成熟Ｎｉｓｉｎ分子［１０］。

对Ｎｉｓｉｎ遗传学研究的深入，将使我们有可能定向改变Ｎｉｓｉｎ的溶解度、稳定性、抑菌范围等，对于Ｎｉｓｉｎ的应用前景有着重大而深远的意义。

２Ｎｉｓｉｎ生产与应用研究进展２．１Ｎｉｓｉｎ产生菌的筛选目前主要是利用Ｎｉｓｉｎ产生菌中ｎｉｐ＋ｎｉｓｒｓｕｃ＋紧密连锁的原理，在添加乳链菌肽、蔗糖及溴甲酚紫的选择培养基上，从牛奶样品中定向筛选Ｎｉｓｉｎ产生菌［１１］。

也有通过检测在ＢＣＰ－ＣａＣＯ３培养基中溶钙圈大小而间接选择Ｎｉｓｉｎ生产菌方法的报道。

２．２Ｎｉｓｉｎ的发酵生产在Ｎｉｓｉｎ的生产中，主要是以乳链球菌和乳酸乳球菌作为生产菌，通过诱变方法获得高产菌株，并通过改变培养基配方以进一步提高产量。

其中，对培养基配方的研究进行的较为活跃。

一方面，可以扩大Ｎｉｓｉｎ应用，另一方面，对营养与产量关系的研究有助于了解Ｎｉｓｉｎ生物合成的途径和调控方式［１２］。

２．３发酵产物的提取工艺２．３．１有机溶剂法利用正丙醇作为主要的溶剂，因此也称正丙醇法。

它利用正丙醇、丙酮、乙酸等有机溶剂沉淀Ｎｉｓｉｎ，利用ＫＨ２ＰＯ４等进行盐析［１３］，反复沉淀、溶解的过程，是一种经典方法，但其缺点是回收率低，回收产物活性低。

１９６０年Ｈａｗｌｅｙ等用一种简单的方法提取Ｎｉｓｉｎ。

该法是先向发酵液中加入０．１％Ｔｗｅｅｎ－８０，然后从发酵液底部鼓气使产生大量的气泡，Ｎｉｓｉｎ本身具有表面活性剂的性质，因而伴随泡沫被鼓出，收集并破碎泡沫后，用丙酮沉淀，最后将沉淀干燥测活，比活仅为１．４×１０６ＩＵ／ｇ。

与正丙醇法相比鼓气吹泡法较容易形成规模化生产，操作简单，试剂消耗量少，但产品纯度低，回收率也不理想。

２．３．２吸附法随着对乳链菌肽分子性质的研究，科研工作者发现产Ｎｉｓｉｎ的乳酸菌对Ｎｉｓｉｎ具有一定的吸附作用［１４］。

１９７１年Ｂａｉｌｅｙ等利用Ｎｉｓｉｎ与菌体吸附特性先回收菌体，然后再获取Ｎｉｓｉｎ提取液，再将其经过柱层析纯化Ｎｉｓｉｎ。

１９９２年Ｙａｎｇ等对菌体吸附法的吸附及解吸附条件作了进一步研究［１５］，发现如果对吸附及解吸附选择合适的ｐＨ，无需破碎菌体就可大量提取回收Ｎｉｓｉｎ。

其结果是最佳吸附ｐＨ为６．５，而解吸附最佳ｐＨ为２．５。

１９９６年Ｊａｓｏｎ等通过对Ｎｉｓｉｎ与菌体吸附的深入研究，大胆地提出了一种设想，就是利用菌体对Ｎｉｓｉｎ在高ｐＨ吸附、低ｐＨ解吸附的特性，构建一种固定化细胞柱，将含Ｎｉｓｉｎ的粗品通过固定化细胞，Ｎｉｓｉｎ就被吸附从而达到分离浓缩的目的。

另一种吸附法是应用一些吸附剂在合适条件下Ｎｏ．１．２００６使其与Ｎｉｓｉｎ吸附以达到提取纯化的目的。

吸附剂包括硅酸、二氧化钛、硅化合物（硅酸钙、二氧化硅、硅藻土等）。

２．３．３柱层析法现在应用于分离纯化Ｎｉｓｉｎ的介质较多，并且均可达到纯化的目的，但是由于所选前处理的方法不同，使得需要过柱的数目也不同［１６］。

１９９５年我国山东大学刘稳等应用中空纤维超滤、非极性大孔网状吸附树脂ＸＡＤ－２层析、ＣＭ－ＳｅｐｈａｄｅｘＣ－２５层析和ＳｅｐｈａｄｅｘＣ－５０分子筛层析等步骤纯化Ｎｉｓｉｎ，分析其纯度不低于９５％，比活为２．６×１０７ＩＵ／ｇ，总回收率为２０．６％。

１９９５年Ｒｏｄ－ｒｉｇｕｅｚ等采用Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ介质纯化Ｎｉｓｉｎ，该法的预处理是用（ＮＨ４）２ＳＯ４沉淀浓缩Ｎｉｓｉｎ，然后依次通过Ｓｐ－Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ柱层析、Ｏｃｔｙｌ－ＳｅｐｈａｒｏｓｅＣｌ－４Ｂ柱层析及ＰｅｐＲｐｃＨＲ５／５Ｃ２／Ｃ１８反向柱层析等步骤纯化Ｎｉｓｉｎ［１７］。

１９９６年陈秀珠等应用正丙醇提取法将Ｎｉｓｉｎ浓缩后再用ＣＭ－ＳｅｐｈａｄｅｘＣ－２５层析一步纯化了Ｎｉｓｉｎ，其比活为３．９９×１０７ＩＵ／ｇ，回收率４１．７％。

１９９７年Ｓｕａｒｅｚ等又将一种传统的层析方法—免疫亲和层析应用分离纯化Ｎｉｓｉｎ并且获得了成功［１８］。

该法是用ＡＤ１０杂交瘤细胞制备Ｎｉｓｉｎ的单克隆抗体，并将其通过Ｎ－羟基琥珀酸亚胺葡聚糖柱，在一定条件下抗体与葡聚糖偶联，然后将Ｎｉｓｉｎ发酵液除菌后进行柱层析。

最终活性回收率可达７２．７％，应用ＲｅＲｐｃＨＲ５／５Ｃ２／Ｃ１８反向柱层析鉴定其纯度与Ｎｉｓｉｎ标准品接近。

这种利用抗体－抗原特异吸附性所设计的免疫亲和层析法纯化Ｎｉｓｉｎ不仅操作过程简单，而且速度快，特异性好，重复性强。

但其缺点是Ｎｉｓｉｎ的单克隆抗体较难获得。

２．４发酵产物的效价检测Ｎｉｓｉｎ可以抑制Ｇ＋菌的生长，可用微球菌作检测菌，测量其抑菌圈直径。

Ｎｉｓｉｎ在中性溶液中的溶解度远小于其在酸性溶液中的溶解度，这样使得它在琼脂平板中扩散受影响。

虽有一些方法，如用还原酶活性抑制剂、测定牛奶中酸产物的量、或测定ＯＤ值（比浊法）等可以作为衡量Ｎｉｓｉｎ量的标准。