G418筛选tzmbl细胞适宜浓度实验
G418原理及筛选方法
G418原理及筛选方法原理分析转化得功能与表达需要DNA稳定转染至宿主细胞染色体。
外源基因进入细胞后，部分能够通过细胞质进入细胞核内,根据细胞类型，至多80%得进入核内得外源DNA得到瞬时表达。
极少数情况下，进入细胞得外源DNA通过系列非同源性分子间重组核连接，最终整合进细胞染色体。
细胞基因组自由部分表达，所以整合并不一左意味着表达，只有整合到表达区得基因才会表达,而且整合到不同得染色体区段得外源基因得表达得量也就是不同得。
由于摄取、整合、表达外源基因就是小概率事件，通常根据新表型筛选軽軽体。
一般情况下这种新表型由共转染得编码抗生素抗性基因提供。
细菌Tn5转座子序列（ne。
抗性基因）携带得氨基糖昔磷酸转移酶可以将G418转变成无毒形式。
G418就是一种氨基糖类抗生素，其结构与新霉素、庆大靈素、卡那靈素相似，它通过影响80S 核糖体功能而阻断蛋白质合成，对原核与真核等细胞都有毒性，包括细菌、酵母、植物与哺乳动物细胞，也包括原生动物与蠕虫。
就是稳定转染最常用得选择试剂。
当neo基因被整合进真核细胞基因组合适得地方后，则能启动neo基因编码得序列转录为niRNA,从而获得抗性产物氨基糖昔磷酸转移酶得高效表达,使细胞获得抗性而能在含有G418得选择性培养基中生长。
G418得这一选择特性，已在基因转移、基因敲除、抗性筛选以及转基因动物等方面得以广泛应用。
在进行转染时细胞膜受到影响，抗生素可能对细胞产生较大影响，加上0418有杀菌作用, 所以有人主张转染时不加英它抗生素。
英实G418本身有很好得杀菌效果，在用G418进行筛选得过程中很少会发生污染。
但有一点，其实我觉得问题也不就是很大，那就就是:在老外得一本实验手册中提到，在脂质体转染时所用培养基中最好不加任何抗生素。
我想她得想法可能就是脂质体对细胞膜有影响,可能此时加抗生素对细胞损伤较大。
因为庆大离素、链鑫素.0418 均就是氨基糖貳类药物，其药理作用完全一样。
G418筛选TZMBL
建立细胞系所用G418 浓度的确定将TZM-bl细胞以1×103个细胞/孔的密度接种到96孔板中。
24 h后，分别用含有100 μg/mL、200 μg/mL、300 μg/mL……1 000 μg/mL G418的DMEM培养细胞。
2~3天更换新鲜培养基，培养2周，选择细胞全部死亡的最低G418浓度作为细胞筛选的浓度。
最终确定筛选用G418浓度为800 μg/mL。
在做稳定克隆筛选之前，一定要做细胞的梯度敏感实验。
通常用100、200、300、400、500、800 ug/ml六种梯度筛选之前确定G418浓度：1，由于每种细胞对G418 的敏感性不同，而且不同的厂家生产的G418有效成分的比重不同，一般1g的粉剂中有效的G418含量大约为0.722g。
2，G418是新霉素的类似物，两者都是通过抑制核糖体的功能和蛋白质的合成而杀死细胞的。
但是新霉素对真核细胞无作用而G418对细菌和真核细胞都起作用。
neo就是编码3‘磷酸转移酶的基因，它表达的蛋白能够分解新霉素和G418。
在进行转染时细胞膜受到影响，抗生素可能对细胞产生较大影响，加上G418有杀菌作用，所以有人主张转转染时不加其它抗生素。
3，汇合度对G418筛选结果的影响很大，一般筛选时汇合度不宜超过50%4，G418的活性不尽相同，所以在筛选之前，一定要确定G418的最佳筛选浓度。
具体如下：将细胞稀释到1000个细胞/ml，在100ug/ml~1mg/ml的G418浓度范围内进行筛选，选择出在10~14天内使细胞全部死亡的最低G418浓度来进行下一步的筛选试验。
一个具体试验：3*106个细胞电转后，分别接种1/4000，1/1000，1/300细胞到24孔板中，48h 后加药筛选，此时1/300细胞孔内大约50%汇合度。
理论上1/4000孔内应有4%的汇合度。
筛选9天后，观察1/4000孔内有两三个克隆，按比例1/300孔内应该有几十个克隆，事实上，它们几乎全死光了，只有几个克隆。
最全的G418筛选稳定表达细胞系总结1
最全的G418筛选稳定表达细胞系简介G418是一种广谱抗生素，可以选择性地杀死没有正确整合的质粒DNA转染的细胞，从而筛选出具有稳定表达的细胞系。
G418筛选是基因转染中常用的一种选择方法，通过对G418敏感性的筛选来选择转化基因。
本文将G418筛选步骤和优化方案。
G418筛选步骤细胞株选取首先需要选取稳定转染所需的细胞株。
需要保证选取的细胞株生长健康、分裂正常、易于培养以及不易死亡。
常用的细胞株有293T、CHO、HEK293。
转染在开始筛选之前，需要将目的基因转染进入所选细胞株。
目前常用的转染方法有磷酸钙共沉淀法、电转染法和脂质体转染法等，需要根据实际情况选择转染方法。
初步筛选完成转染后，需要在培养基中加入G418，通常的加药浓度不超过1mg/mL，推荐浓度为400μg/mL。
在转染后24-48小时内开始进行初步筛选，通过观察细胞的生长状态以及基因表达情况来判断筛选效果。
细分筛选初步筛选后，需要将G418的浓度逐步增加，通常第二轮加药浓度是初步筛选浓度的2倍，第三轮加药浓度是第二轮的2倍。
逐渐递增药物浓度，可以让敏感的细胞死亡，生存的细胞逐渐表达目的基因，从而得到稳定的细胞株。
稳定维持筛选到稳定的细胞后，需要对细胞进行定期维护。
通常可以在培养基中加入适当的G418浓度，维持稳定表达的转染细胞。
优化方案药物浓度G418的加药浓度直接影响到细胞死亡率和筛选效果。
在进行筛选前需要先进行剂量反应实验，通过不同浓度药物的处理，检测细胞生长状态和基因表达情况。
细胞密度传统细胞密度在98%时，死亡率是最高的。
因此，为了降低G418对细胞的毒性，可以将细胞密度控制在70-80%左右。
同时，过稀的细胞密度也会影响到筛选效果，因此需要根据实际情况进行调整。
培养时间筛选时间也直接影响到G418对细胞的毒性程度和筛选效果。
不同的细胞株和实验条件下，对筛选时间的选择有所不同。
通常初步筛选时间在24-48小时，细分筛选筛选时间需要根据实际情况进行判断。
G418筛选转染克隆的注意事项
G418筛选转染克隆的注意事项G418作为稳定转染通用的一种筛选方式，在进行筛选前应该要注意几点：1. G418的浓度：G418是一种氨基糖苷类似物，它通过干扰核糖体功能来阻止哺乳动物细胞蛋白质的合成。
因此在筛选过程中G418的浓度将对转染细胞的筛选产生很大的影响。
在筛选之前最好进行条件优化确定最佳筛选浓度。
尽管文献有报道筛选浓度，最好还是要自己亲自做一下筛选浓度的确定。
2. 细胞状态：细胞状态会影响对药物的敏感性。
可以通过常规的培养步骤保持转染铺板前的细胞健康。
每周传代一到两次，稀释程度使得下次传代前细胞几乎融合。
不要使细胞保持融合超过24小时。
3. 细胞维护：根据培养基的颜色和细胞生长情况，定期更换新鲜培养基。
4. 其他抗生素的使用：对于稳定转染，不要在选择性培养基中使用青霉素和链霉素，因为这些抗生素是G418抗生素的竞争性抑制剂。
在转染培养基中不能使用抗生素，甚至在准备转染前进行细胞铺板时也要避免使用抗生素。
这样，在转染前也不必润洗细胞。
5. 细胞保存：细胞培养在实验室中保存数月和数年后会经历突变，总染色体重组或基因调控变化等而演化。
如果随时间发现这种变化，一管保存的新鲜的细胞可能会恢复原先的活性。
比如，新鲜融化的NIH 3T3细胞比传代8次的细胞表现出更高的转染效率。
融化细胞的进一步传代并没有降低转染效率。
因此，如果观察到细胞活性降低，可以试着复苏新鲜培养的细胞以恢复最佳结果。
一、筛选曲线的建立1. G418的配制：取G418共1g溶于1mol/L的HEPES溶液1ml 中，加蒸馏水至10ml，过滤除菌，4℃保存；2. 细胞培养：取待测培养细胞，制备成细胞悬液，按等量接种入多孔培养板中，培养6h左右开始加药；3. 制备筛选培养基：在100~1000ug/ml范围内确定几个梯度，比如先做个100、400、800、1000ug/ml，按梯度浓度用培养基稀释G418制成筛选培养基；4. 加G418筛选：吸除培养基，PBS洗涤一次，每孔中加入不同浓度的筛选培养基；5. 换液：根据培养基的颜色和细胞生长情况，每隔3~5d更换一次筛选培养基；6. 确定最佳筛选浓度：在筛选10~14d内能够杀死所有细胞的最小G418浓度即为最佳筛选浓度。
G418筛选
从G418筛选，转染到xx化的总结筛选之前确定G418浓度：1.由于每种细胞对G418的敏感性不同，而且不同的厂家生产的G418有效成分的比重不同，一般1g的粉剂中有效的G418含量大约为0.722g。
2.G418是新霉素的类似物，两者都是通过抑制核糖体的功能和蛋白质的合成而杀死细胞的。
但是新霉素对真核细胞无作用而G418对细菌和真核细胞都起作用。
neo就是编码3‘磷酸转移酶的基因，它表达的蛋白能够分解新霉素和G418。
在进行转染时细胞膜受到影响，抗生素可能对细胞产生较大影响，加上G418有杀菌作用，所以有人主张转转染时不加其它抗生素。
3.汇合度对G418筛选结果的影响很大，一般筛选时汇合度不宜超过50%4.G418的活性不尽相同，所以在筛选之前，一定要确定G418的最佳筛选浓度。
具体如下：将细胞稀释到1000个细胞/ml，在100ug/ml~1mg/ml的G418浓度范围内进行筛选，选择出在10~14天内使细胞全部死亡的最低G418浓度来进行下一步的筛选试验。
一个具体试验：3*106个细胞电转后，分别接种，，细胞到24孔板中，48h后加药筛选，此时细胞孔内大约50%汇合度。
理论上孔内应有4%的汇合度。
筛选9天后，观察孔内有两三个克隆，按比例孔内应该有几十个克隆，事实上，它们几乎全死光了，只有几个克隆。
加药时间和维持浓度1.由于基因转染到细胞内之后要一段时间才能表达出蛋白质。
所以筛选不能太早；但是也不能太晚，因为转染了外源基因的细胞代谢负荷较大，增值较慢，时间长了就会被没有外源基因转入的细胞所淹没，最终导致筛选不出阳性克隆，一般要在转染24小时之后才开始加G418筛选。
随着细胞的代谢G418的浓度和活性都回下降，所以每3~5天都要更换一次含有G418的筛选液。
这时药物浓度可以降至200ug/ml。
2.加抗生素的时机，主要是考虑插入到细胞基因组的抗性基因是否已经得到表达。
一般是转染48小时后加入抗生素。
g418筛选细胞原理
g418筛选细胞原理一、引言在生物学研究中，细胞是一个非常重要的研究对象。
为了更好地理解细胞的功能和特性，科学家们经常需要筛选出特定类型的细胞。
本文将重点介绍一种常用的细胞筛选方法，即使用g418进行筛选的原理。
二、g418的作用机制g418是一种广谱抗生素，属于氨基糖苷类抗生素，常用于细胞筛选和基因转染实验。
它能够抑制细菌和真菌的生长，同时对哺乳动物细胞具有选择性毒性。
g418的作用机制主要是通过抑制细胞内的蛋白质合成而起作用。
三、g418筛选细胞的原理g418筛选细胞的原理是利用细胞对g418的敏感性来筛选出特定类型的细胞。
在细胞培养基中加入一定浓度的g418，只有对g418敏感的细胞才能够存活下来，而对g418不敏感的细胞则会死亡。
因此，通过调整g418的浓度，可以选择性地杀死或保留特定类型的细胞。
四、g418筛选细胞的步骤1. 准备细胞培养基：在培养基中添加适量的g418，使其浓度达到所需浓度；2. 培养细胞：将待筛选的细胞加入带有g418的培养基中，进行培养；3. 观察细胞生长：观察细胞在带有g418的培养基中的生长情况。
对于对g418敏感的细胞，它们将在培养基中存活和繁殖；而对g418不敏感的细胞，则会死亡或生长缓慢；4. 筛选细胞：根据细胞的生长情况，筛选出对g418敏感的细胞。
五、g418筛选细胞的注意事项1. g418的浓度要根据具体实验目的进行调整，过低的浓度可能无法有效筛选出特定细胞，而过高的浓度可能对所有细胞都具有毒性；2. g418的作用时间也需要根据实验目的进行调整，通常需要持续培养一段时间才能筛选出对g418敏感的细胞；3. 在筛选细胞的过程中，需要定期观察细胞的生长情况，及时调整培养基中的g418浓度，以保证细胞的生长和筛选效果。
六、g418筛选细胞的应用g418筛选细胞的方法在生物学研究中得到了广泛应用。
例如，在基因转染实验中，可以利用g418筛选出成功转染的细胞，以便进行后续的功能研究；在细胞分离和纯化实验中，也可以利用g418筛选出特定类型的细胞，以便进一步研究其特性和功能。
稳定细胞株筛选药物浓度确定方法
稳定细胞株筛选药物浓度确定方法
在使用G418、潮霉素B或嘌呤霉素筛选稳定细胞系细胞之前，需要先通过梯度实验确定适合该类细胞的最佳药物浓度。
对于一些常见的细胞系，通常可以在资料中找到推荐的药物浓度。
例如Hela细胞用400 μg/ml的G41或1 μg/ml的嘌呤霉素进行稳定细胞株筛选。
用G418或潮霉素B，选用在5天左右出现细胞大批死亡，2周全部死亡的浓度作为筛选浓度。
对于嘌呤霉素,通常采用在3-4天杀死全部细胞的浓度。
不同批次的药物活性有一定差异。
因此在使用新批次药物时，需要重新测定最佳浓度。
筛选抗生素的推荐使用浓度（μg/ml）
抗生素工作范围筛选浓度维持用量
G418 50-800 400-500 100
Hygromycin 50-800 200 100
Puromycin 0.25-2 0.5-10 0.25
1、在加入筛选药物前一天将细胞以50%密度接种到6孔板。
第二天在培养基中按G418(0,50,1000,200,400,800μg/ml)或者嘌呤霉素（0,1,2.5,5,7.5,10μg/ml）加入。
2、用G418筛选处理5-10天。
每2天观察细胞一次。
每4天跟换新的有抗生素的培养基（如果有必要可以更换得更勤）。
直到得到最佳浓度。
3、用嘌呤霉素处理4-7天。
每2天跟换新的有抗生素的培养基。
G418筛选程序
G418筛选程序一、杀伤曲线1. 在24 孔板内接种细胞，约3x104/孔（只是参考值，根据细胞的体积和生长速度调整），共11孔，培养过夜。
2. 第二天，观察细胞密度为20%-30%（如果密度不合格，请重新进行细胞接种，不要勉强进行，浪费时间）。
稀释G418 (0, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000 µg/ml，如果G418储液浓度较高，进行稀释时，所取体积很小，有困难，请先把储液进行稀释（需要多少，稀释多少），以稀释的储液在进行稀释)至培养基, 每孔加入0.75m l培养基。
3. 每隔2天观察细胞的存活情况（贴壁细胞飘起即为死亡，悬浮细胞，可以通过观察细胞的膜情况来判断，死亡细胞的细胞膜较为粗糙，有皱褶，没光泽，准确应以取少量细胞进行台盼蓝染色为准），每隔3-4天更换0.75m l含相应浓度G418的培养基。
4. 筛选5-10天（早也不行，晚也不行）内使细胞全部死亡的最低G418浓度，即为杀伤浓度（筛选浓度）；二、细胞筛选1.转染（24孔板进行）或电转后培养24小时，按10%密度传代（传至35mm平皿），继续培养24小时，待细胞密度增至20％～25％汇合时；2.去掉培养液，PBS洗一次，加入按最佳筛选浓度（杀伤曲线实验确定）配制好的G418筛选培养基2-3ml。
3.根据培养基的颜色和细胞的存活情况，每隔3-4天更换一次筛选培养基(培养基用量为2-4ml，细胞多，多加培养基，细胞少，少加培养基), 一般在5-6天内出现细胞大量或少量死亡情况（如果转染效率或电转效率高，则死亡少；如果转染效率或电转效率低，则死亡多；如果筛选浓度偏低，筛选培养基用量少，细胞密度大于80%，会导致大量假阳性克隆）。
如果筛选第一周，出现细胞大量死亡，则在原培养皿中继续加入筛选培养基进行筛选一周；如果筛选第一周，出现细胞少量死亡，则把细胞按10%密度传代（传至35mm平皿，传一个皿即可，多余细胞丢弃），利用筛选培养基进行筛选一周；4.筛选第二周结束后，则把细胞消化下来，进行终点稀释（10ul培养基中含1个细胞，用筛选培养基稀释），把上述10ul细胞悬液加入96孔板中（提前加入40ul筛选培养基），一共加24孔，4小时后观察每个孔的情况，记录只含一个细胞的孔，含有一个细胞的孔用于继续筛选，其余孔舍弃；5.根据培养基的颜色和细胞生长情况换入新的筛选培养基，待细胞密度为80%时，将其传代至24孔板中增殖，待细胞密度为80%时，将其传代至6孔板中增殖，待细胞密度为80%时，将其传代至T25瓶（一传3）中增殖，每隔3天换液。
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表1含有不同剂量组G418的DMEM培养基配制
0
1
2
3
4
5
G418体积（μL）
100
（从前一管中吸取，ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ面类推）640
5000
5000
5000
5000
DMEM体积（μL）
900
9360
5000
5000
5000
5000
管中G418浓度（μg/mL）
50000
3200
1600
800
400
200
每孔G418含量（μg）
建立MicoRNA稳转TZMbl细胞系所用G418筛选浓度实验
实验目的
实验细胞
G418
G418储液浓度
建立MicoRNA稳转TZMbl细胞系所需要的G418筛选浓度
TZM-bl细胞
实验室自制
2006
500mg/mL
一、将TZM-bl细胞以1000个/孔的密度接种到96孔板中。
二、1.24 h后，弃去旧的培养基，分别用含有200μg/mL、400μg/mL、800μg/mL、16 000μg/mL、3200μg/mL G418的DMEM培养细胞。
对照
C
D
表2不同剂量组G418的DMEM培养基加入96孔板
三、2~3天更换新鲜培养基，培养2周，选择细胞全部死亡的最低G418浓度作为细胞筛选的浓度。最终确定筛选用G418浓度为---------μg/mL。
320
160
80
40
20
每孔加入体积（μL）
100
100
100
100
100
G418工作液浓度（μg/mL）
3200
1600
800
400
200
（0号管为1.5 ml EP管，2-5号为15 ml无菌离心管）
2
3
4
5
6
7
B
3200μg/mL
1600μg/mL
800μg/mL
400μg/mL
200μg/mL
2.G418储液浓度为500mg/mL=500μg/μL，先用DMEM培养基将其稀释为50μg/μL的工作液。
3.每个剂量组做三个复孔，每孔加入100μL含有G418的DMEM培养基，每次准备的各个剂量DMEM培养基按500μL计算，一次性配制10次的培养基量，为5000μL。对照组，加入100DMEM培养基