G418筛选tzmbl细胞适宜浓度实验

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G418原理及筛选方法

G418原理及筛选方法

G418原理及筛选方法原理分析转化得功能与表达需要DNA稳定转染至宿主细胞染色体。

外源基因进入细胞后,部分能够通过细胞质进入细胞核内,根据细胞类型,至多80%得进入核内得外源DNA得到瞬时表达。

极少数情况下,进入细胞得外源DNA通过系列非同源性分子间重组核连接,最终整合进细胞染色体。

细胞基因组自由部分表达,所以整合并不一左意味着表达,只有整合到表达区得基因才会表达,而且整合到不同得染色体区段得外源基因得表达得量也就是不同得。

由于摄取、整合、表达外源基因就是小概率事件,通常根据新表型筛选軽軽体。

一般情况下这种新表型由共转染得编码抗生素抗性基因提供。

细菌Tn5转座子序列(ne。

抗性基因)携带得氨基糖昔磷酸转移酶可以将G418转变成无毒形式。

G418就是一种氨基糖类抗生素,其结构与新霉素、庆大靈素、卡那靈素相似,它通过影响80S 核糖体功能而阻断蛋白质合成,对原核与真核等细胞都有毒性,包括细菌、酵母、植物与哺乳动物细胞,也包括原生动物与蠕虫。

就是稳定转染最常用得选择试剂。

当neo基因被整合进真核细胞基因组合适得地方后,则能启动neo基因编码得序列转录为niRNA,从而获得抗性产物氨基糖昔磷酸转移酶得高效表达,使细胞获得抗性而能在含有G418得选择性培养基中生长。

G418得这一选择特性,已在基因转移、基因敲除、抗性筛选以及转基因动物等方面得以广泛应用。

在进行转染时细胞膜受到影响,抗生素可能对细胞产生较大影响,加上0418有杀菌作用, 所以有人主张转染时不加英它抗生素。

英实G418本身有很好得杀菌效果,在用G418进行筛选得过程中很少会发生污染。

但有一点,其实我觉得问题也不就是很大,那就就是:在老外得一本实验手册中提到,在脂质体转染时所用培养基中最好不加任何抗生素。

我想她得想法可能就是脂质体对细胞膜有影响,可能此时加抗生素对细胞损伤较大。

因为庆大离素、链鑫素.0418 均就是氨基糖貳类药物,其药理作用完全一样。

G418筛选TZMBL

G418筛选TZMBL

建立细胞系所用G418 浓度的确定将TZM-bl细胞以1×103个细胞/孔的密度接种到96孔板中。

24 h后,分别用含有100 μg/mL、200 μg/mL、300 μg/mL……1 000 μg/mL G418的DMEM培养细胞。

2~3天更换新鲜培养基,培养2周,选择细胞全部死亡的最低G418浓度作为细胞筛选的浓度。

最终确定筛选用G418浓度为800 μg/mL。

在做稳定克隆筛选之前,一定要做细胞的梯度敏感实验。

通常用100、200、300、400、500、800 ug/ml六种梯度筛选之前确定G418浓度:1,由于每种细胞对G418 的敏感性不同,而且不同的厂家生产的G418有效成分的比重不同,一般1g的粉剂中有效的G418含量大约为0.722g。

2,G418是新霉素的类似物,两者都是通过抑制核糖体的功能和蛋白质的合成而杀死细胞的。

但是新霉素对真核细胞无作用而G418对细菌和真核细胞都起作用。

neo就是编码3‘磷酸转移酶的基因,它表达的蛋白能够分解新霉素和G418。

在进行转染时细胞膜受到影响,抗生素可能对细胞产生较大影响,加上G418有杀菌作用,所以有人主张转转染时不加其它抗生素。

3,汇合度对G418筛选结果的影响很大,一般筛选时汇合度不宜超过50%4,G418的活性不尽相同,所以在筛选之前,一定要确定G418的最佳筛选浓度。

具体如下:将细胞稀释到1000个细胞/ml,在100ug/ml~1mg/ml的G418浓度范围内进行筛选,选择出在10~14天内使细胞全部死亡的最低G418浓度来进行下一步的筛选试验。

一个具体试验:3*106个细胞电转后,分别接种1/4000,1/1000,1/300细胞到24孔板中,48h 后加药筛选,此时1/300细胞孔内大约50%汇合度。

理论上1/4000孔内应有4%的汇合度。

筛选9天后,观察1/4000孔内有两三个克隆,按比例1/300孔内应该有几十个克隆,事实上,它们几乎全死光了,只有几个克隆。

最全的G418筛选稳定表达细胞系总结1

最全的G418筛选稳定表达细胞系总结1

最全的G418筛选稳定表达细胞系简介G418是一种广谱抗生素,可以选择性地杀死没有正确整合的质粒DNA转染的细胞,从而筛选出具有稳定表达的细胞系。

G418筛选是基因转染中常用的一种选择方法,通过对G418敏感性的筛选来选择转化基因。

本文将G418筛选步骤和优化方案。

G418筛选步骤细胞株选取首先需要选取稳定转染所需的细胞株。

需要保证选取的细胞株生长健康、分裂正常、易于培养以及不易死亡。

常用的细胞株有293T、CHO、HEK293。

转染在开始筛选之前,需要将目的基因转染进入所选细胞株。

目前常用的转染方法有磷酸钙共沉淀法、电转染法和脂质体转染法等,需要根据实际情况选择转染方法。

初步筛选完成转染后,需要在培养基中加入G418,通常的加药浓度不超过1mg/mL,推荐浓度为400μg/mL。

在转染后24-48小时内开始进行初步筛选,通过观察细胞的生长状态以及基因表达情况来判断筛选效果。

细分筛选初步筛选后,需要将G418的浓度逐步增加,通常第二轮加药浓度是初步筛选浓度的2倍,第三轮加药浓度是第二轮的2倍。

逐渐递增药物浓度,可以让敏感的细胞死亡,生存的细胞逐渐表达目的基因,从而得到稳定的细胞株。

稳定维持筛选到稳定的细胞后,需要对细胞进行定期维护。

通常可以在培养基中加入适当的G418浓度,维持稳定表达的转染细胞。

优化方案药物浓度G418的加药浓度直接影响到细胞死亡率和筛选效果。

在进行筛选前需要先进行剂量反应实验,通过不同浓度药物的处理,检测细胞生长状态和基因表达情况。

细胞密度传统细胞密度在98%时,死亡率是最高的。

因此,为了降低G418对细胞的毒性,可以将细胞密度控制在70-80%左右。

同时,过稀的细胞密度也会影响到筛选效果,因此需要根据实际情况进行调整。

培养时间筛选时间也直接影响到G418对细胞的毒性程度和筛选效果。

不同的细胞株和实验条件下,对筛选时间的选择有所不同。

通常初步筛选时间在24-48小时,细分筛选筛选时间需要根据实际情况进行判断。

G418筛选转染克隆的注意事项

G418筛选转染克隆的注意事项

G418筛选转染克隆的注意事项G418作为稳定转染通用的一种筛选方式,在进行筛选前应该要注意几点:1. G418的浓度:G418是一种氨基糖苷类似物,它通过干扰核糖体功能来阻止哺乳动物细胞蛋白质的合成。

因此在筛选过程中G418的浓度将对转染细胞的筛选产生很大的影响。

在筛选之前最好进行条件优化确定最佳筛选浓度。

尽管文献有报道筛选浓度,最好还是要自己亲自做一下筛选浓度的确定。

2. 细胞状态:细胞状态会影响对药物的敏感性。

可以通过常规的培养步骤保持转染铺板前的细胞健康。

每周传代一到两次,稀释程度使得下次传代前细胞几乎融合。

不要使细胞保持融合超过24小时。

3. 细胞维护:根据培养基的颜色和细胞生长情况,定期更换新鲜培养基。

4. 其他抗生素的使用:对于稳定转染,不要在选择性培养基中使用青霉素和链霉素,因为这些抗生素是G418抗生素的竞争性抑制剂。

在转染培养基中不能使用抗生素,甚至在准备转染前进行细胞铺板时也要避免使用抗生素。

这样,在转染前也不必润洗细胞。

5. 细胞保存:细胞培养在实验室中保存数月和数年后会经历突变,总染色体重组或基因调控变化等而演化。

如果随时间发现这种变化,一管保存的新鲜的细胞可能会恢复原先的活性。

比如,新鲜融化的NIH 3T3细胞比传代8次的细胞表现出更高的转染效率。

融化细胞的进一步传代并没有降低转染效率。

因此,如果观察到细胞活性降低,可以试着复苏新鲜培养的细胞以恢复最佳结果。

一、筛选曲线的建立1. G418的配制:取G418共1g溶于1mol/L的HEPES溶液1ml 中,加蒸馏水至10ml,过滤除菌,4℃保存;2. 细胞培养:取待测培养细胞,制备成细胞悬液,按等量接种入多孔培养板中,培养6h左右开始加药;3. 制备筛选培养基:在100~1000ug/ml范围内确定几个梯度,比如先做个100、400、800、1000ug/ml,按梯度浓度用培养基稀释G418制成筛选培养基;4. 加G418筛选:吸除培养基,PBS洗涤一次,每孔中加入不同浓度的筛选培养基;5. 换液:根据培养基的颜色和细胞生长情况,每隔3~5d更换一次筛选培养基;6. 确定最佳筛选浓度:在筛选10~14d内能够杀死所有细胞的最小G418浓度即为最佳筛选浓度。

G418筛选

G418筛选

从G418筛选,转染到xx化的总结筛选之前确定G418浓度:1.由于每种细胞对G418的敏感性不同,而且不同的厂家生产的G418有效成分的比重不同,一般1g的粉剂中有效的G418含量大约为0.722g。

2.G418是新霉素的类似物,两者都是通过抑制核糖体的功能和蛋白质的合成而杀死细胞的。

但是新霉素对真核细胞无作用而G418对细菌和真核细胞都起作用。

neo就是编码3‘磷酸转移酶的基因,它表达的蛋白能够分解新霉素和G418。

在进行转染时细胞膜受到影响,抗生素可能对细胞产生较大影响,加上G418有杀菌作用,所以有人主张转转染时不加其它抗生素。

3.汇合度对G418筛选结果的影响很大,一般筛选时汇合度不宜超过50%4.G418的活性不尽相同,所以在筛选之前,一定要确定G418的最佳筛选浓度。

具体如下:将细胞稀释到1000个细胞/ml,在100ug/ml~1mg/ml的G418浓度范围内进行筛选,选择出在10~14天内使细胞全部死亡的最低G418浓度来进行下一步的筛选试验。

一个具体试验:3*106个细胞电转后,分别接种,,细胞到24孔板中,48h后加药筛选,此时细胞孔内大约50%汇合度。

理论上孔内应有4%的汇合度。

筛选9天后,观察孔内有两三个克隆,按比例孔内应该有几十个克隆,事实上,它们几乎全死光了,只有几个克隆。

加药时间和维持浓度1.由于基因转染到细胞内之后要一段时间才能表达出蛋白质。

所以筛选不能太早;但是也不能太晚,因为转染了外源基因的细胞代谢负荷较大,增值较慢,时间长了就会被没有外源基因转入的细胞所淹没,最终导致筛选不出阳性克隆,一般要在转染24小时之后才开始加G418筛选。

随着细胞的代谢G418的浓度和活性都回下降,所以每3~5天都要更换一次含有G418的筛选液。

这时药物浓度可以降至200ug/ml。

2.加抗生素的时机,主要是考虑插入到细胞基因组的抗性基因是否已经得到表达。

一般是转染48小时后加入抗生素。

g418筛选细胞原理

g418筛选细胞原理

g418筛选细胞原理一、引言在生物学研究中,细胞是一个非常重要的研究对象。

为了更好地理解细胞的功能和特性,科学家们经常需要筛选出特定类型的细胞。

本文将重点介绍一种常用的细胞筛选方法,即使用g418进行筛选的原理。

二、g418的作用机制g418是一种广谱抗生素,属于氨基糖苷类抗生素,常用于细胞筛选和基因转染实验。

它能够抑制细菌和真菌的生长,同时对哺乳动物细胞具有选择性毒性。

g418的作用机制主要是通过抑制细胞内的蛋白质合成而起作用。

三、g418筛选细胞的原理g418筛选细胞的原理是利用细胞对g418的敏感性来筛选出特定类型的细胞。

在细胞培养基中加入一定浓度的g418,只有对g418敏感的细胞才能够存活下来,而对g418不敏感的细胞则会死亡。

因此,通过调整g418的浓度,可以选择性地杀死或保留特定类型的细胞。

四、g418筛选细胞的步骤1. 准备细胞培养基:在培养基中添加适量的g418,使其浓度达到所需浓度;2. 培养细胞:将待筛选的细胞加入带有g418的培养基中,进行培养;3. 观察细胞生长:观察细胞在带有g418的培养基中的生长情况。

对于对g418敏感的细胞,它们将在培养基中存活和繁殖;而对g418不敏感的细胞,则会死亡或生长缓慢;4. 筛选细胞:根据细胞的生长情况,筛选出对g418敏感的细胞。

五、g418筛选细胞的注意事项1. g418的浓度要根据具体实验目的进行调整,过低的浓度可能无法有效筛选出特定细胞,而过高的浓度可能对所有细胞都具有毒性;2. g418的作用时间也需要根据实验目的进行调整,通常需要持续培养一段时间才能筛选出对g418敏感的细胞;3. 在筛选细胞的过程中,需要定期观察细胞的生长情况,及时调整培养基中的g418浓度,以保证细胞的生长和筛选效果。

六、g418筛选细胞的应用g418筛选细胞的方法在生物学研究中得到了广泛应用。

例如,在基因转染实验中,可以利用g418筛选出成功转染的细胞,以便进行后续的功能研究;在细胞分离和纯化实验中,也可以利用g418筛选出特定类型的细胞,以便进一步研究其特性和功能。

稳定细胞株筛选药物浓度确定方法

稳定细胞株筛选药物浓度确定方法

稳定细胞株筛选药物浓度确定方法
在使用G418、潮霉素B或嘌呤霉素筛选稳定细胞系细胞之前,需要先通过梯度实验确定适合该类细胞的最佳药物浓度。

对于一些常见的细胞系,通常可以在资料中找到推荐的药物浓度。

例如Hela细胞用400 μg/ml的G41或1 μg/ml的嘌呤霉素进行稳定细胞株筛选。

用G418或潮霉素B,选用在5天左右出现细胞大批死亡,2周全部死亡的浓度作为筛选浓度。

对于嘌呤霉素,通常采用在3-4天杀死全部细胞的浓度。

不同批次的药物活性有一定差异。

因此在使用新批次药物时,需要重新测定最佳浓度。

筛选抗生素的推荐使用浓度(μg/ml)
抗生素工作范围筛选浓度维持用量
G418 50-800 400-500 100
Hygromycin 50-800 200 100
Puromycin 0.25-2 0.5-10 0.25
1、在加入筛选药物前一天将细胞以50%密度接种到6孔板。

第二天在培养基中按G418(0,50,1000,200,400,800μg/ml)或者嘌呤霉素(0,1,2.5,5,7.5,10μg/ml)加入。

2、用G418筛选处理5-10天。

每2天观察细胞一次。

每4天跟换新的有抗生素的培养基(如果有必要可以更换得更勤)。

直到得到最佳浓度。

3、用嘌呤霉素处理4-7天。

每2天跟换新的有抗生素的培养基。

G418筛选程序

G418筛选程序

G418筛选程序一、杀伤曲线1. 在24 孔板内接种细胞,约3x104/孔(只是参考值,根据细胞的体积和生长速度调整),共11孔,培养过夜。

2. 第二天,观察细胞密度为20%-30%(如果密度不合格,请重新进行细胞接种,不要勉强进行,浪费时间)。

稀释G418 (0, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000 µg/ml,如果G418储液浓度较高,进行稀释时,所取体积很小,有困难,请先把储液进行稀释(需要多少,稀释多少),以稀释的储液在进行稀释)至培养基, 每孔加入0.75m l培养基。

3. 每隔2天观察细胞的存活情况(贴壁细胞飘起即为死亡,悬浮细胞,可以通过观察细胞的膜情况来判断,死亡细胞的细胞膜较为粗糙,有皱褶,没光泽,准确应以取少量细胞进行台盼蓝染色为准),每隔3-4天更换0.75m l含相应浓度G418的培养基。

4. 筛选5-10天(早也不行,晚也不行)内使细胞全部死亡的最低G418浓度,即为杀伤浓度(筛选浓度);二、细胞筛选1.转染(24孔板进行)或电转后培养24小时,按10%密度传代(传至35mm平皿),继续培养24小时,待细胞密度增至20%~25%汇合时;2.去掉培养液,PBS洗一次,加入按最佳筛选浓度(杀伤曲线实验确定)配制好的G418筛选培养基2-3ml。

3.根据培养基的颜色和细胞的存活情况,每隔3-4天更换一次筛选培养基(培养基用量为2-4ml,细胞多,多加培养基,细胞少,少加培养基), 一般在5-6天内出现细胞大量或少量死亡情况(如果转染效率或电转效率高,则死亡少;如果转染效率或电转效率低,则死亡多;如果筛选浓度偏低,筛选培养基用量少,细胞密度大于80%,会导致大量假阳性克隆)。

如果筛选第一周,出现细胞大量死亡,则在原培养皿中继续加入筛选培养基进行筛选一周;如果筛选第一周,出现细胞少量死亡,则把细胞按10%密度传代(传至35mm平皿,传一个皿即可,多余细胞丢弃),利用筛选培养基进行筛选一周;4.筛选第二周结束后,则把细胞消化下来,进行终点稀释(10ul培养基中含1个细胞,用筛选培养基稀释),把上述10ul细胞悬液加入96孔板中(提前加入40ul筛选培养基),一共加24孔,4小时后观察每个孔的情况,记录只含一个细胞的孔,含有一个细胞的孔用于继续筛选,其余孔舍弃;5.根据培养基的颜色和细胞生长情况换入新的筛选培养基,待细胞密度为80%时,将其传代至24孔板中增殖,待细胞密度为80%时,将其传代至6孔板中增殖,待细胞密度为80%时,将其传代至T25瓶(一传3)中增殖,每隔3天换液。

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4.
表1含有不同剂量组G418的DMEM培养基配制
0
1
2
3
4
5
G418体积(μL)
100
(从前一管中吸取,ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ面类推)640
5000
5000
5000
5000
DMEM体积(μL)
900
9360
5000
5000
5000
5000
管中G418浓度(μg/mL)
50000
3200
1600
800
400
200
每孔G418含量(μg)
建立MicoRNA稳转TZMbl细胞系所用G418筛选浓度实验
实验目的
实验细胞
G418
G418储液浓度
建立MicoRNA稳转TZMbl细胞系所需要的G418筛选浓度
TZM-bl细胞
实验室自制
2006
500mg/mL
一、将TZM-bl细胞以1000个/孔的密度接种到96孔板中。
二、1.24 h后,弃去旧的培养基,分别用含有200μg/mL、400μg/mL、800μg/mL、16 000μg/mL、3200μg/mL G418的DMEM培养细胞。
对照
C
D
表2不同剂量组G418的DMEM培养基加入96孔板
三、2~3天更换新鲜培养基,培养2周,选择细胞全部死亡的最低G418浓度作为细胞筛选的浓度。最终确定筛选用G418浓度为---------μg/mL。
320
160
80
40
20
每孔加入体积(μL)
100
100
100
100
100
G418工作液浓度(μg/mL)
3200
1600
800
400
200
(0号管为1.5 ml EP管,2-5号为15 ml无菌离心管)
2
3
4
5
6
7
B
3200μg/mL
1600μg/mL
800μg/mL
400μg/mL
200μg/mL
2.G418储液浓度为500mg/mL=500μg/μL,先用DMEM培养基将其稀释为50μg/μL的工作液。
3.每个剂量组做三个复孔,每孔加入100μL含有G418的DMEM培养基,每次准备的各个剂量DMEM培养基按500μL计算,一次性配制10次的培养基量,为5000μL。对照组,加入100DMEM培养基
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