食品微生物实验之革兰氏染色
革兰氏染色实验报告
革兰氏染色法的原理摘要：革兰氏染色反应是细菌重要的鉴别特征，所以学习微生物学，进行革兰氏染色实验是很重要的。
为保证染色结果的正确性，采用规范的的染色操作方法是十分必要。
本实验主要对大肠杆菌（Escherichia coli）、金黄色葡萄球菌（Staphyloccocus aureus Rosenbach）、枯草杆菌（Bacillus subtilis）进行革兰氏染色，观察它们的染色特征，辨别是革兰氏阴性还是阳性，从而掌握其染色方法。
染色方法与过程很清晰，但实验结果中金黄色葡萄球菌(S.aureus Rosenbach）多组呈现假阴性。
本实验的主要目的是熟悉并掌握革兰氏染色方法及原理，但要想做出很好的染色得多加练习。
本实验还可以锻炼显微镜操作技术和无菌操作技术。
关键词：革兰氏染色大肠杆菌(E.coli) 金黄色葡萄球菌(S.aureus Rosenbach) 枯草杆菌(B.subtilis)引言革兰氏染色是微生物学中最重要的鉴别染色方法，它可以直接将细菌分为革兰氏阴性和革兰氏阳性。
革兰氏染色法可将细菌分为革兰氏阳性（G+）和革兰氏阴性（G-）两种类型，这是由这两种细菌细胞壁结构组成与结构的差异所决定的。
经过一定的染色过程后，革兰氏阳性的细菌会因为细胞壁肽聚糖的含量高，脂质含量低而保持第一次染色的蓝紫色。
革兰氏阴性细菌细胞壁的脂质含量高，乙醇处理时脂质溶解，蓝色被洗脱，复染后变为红色。
革兰氏染色原理很简单，染色时需注意要注意使用处在活跃生长期的细菌，涂片不宜过厚，严格控制脱色时间。
大肠杆菌(E.coli)是革兰氏阴性细菌，金黄色葡萄球菌(S.aureus Rosenbach)与枯草杆菌 (B.subtilis)都是革兰氏阳性细菌，染色后在显微镜下容易区别。
同时它们的形态各异，可以根据具体颜色和形态差异来判断染色是否成功。
本实验还涉及到高倍油镜的使用。
使用油镜与用一般的镜头不同，具体使用在实验方法中描述。
实验三革兰氏染色
革兰氏染色– 染色
6 镜检 干燥后，用油镜观察。蓝紫色为G+,红色为G-。 7 混合涂片染色 将大肠杆菌和金黄色葡萄球菌作混合涂片、染色、镜检进行 比较。
Procedures of Gram Staining
Gram positive or Gram negative?
实验报告
1．绘图说明经革兰氏染色后大肠肝菌和金黄色葡萄球 菌的染色结果。
细菌的等电点较低，pH值大约在2—5之间，故在中性、碱性或弱酸 性溶液中，菌体蛋白质电离后带负电荷；而碱性染料电离时染料离子带 正电。因此，带阴电的细菌常和带阳电的碱性染料进行结合。所以，在 细菌学上常用碱性染料进行染色。
2 染色方法
微生物染色方法一般分为单染色法和复染色法两种。前者用一种染 料使微生物染色，但不能鉴别微生物。复染色法是用两种或两种以上染 料，有协助鉴别微生物的作用，故亦称鉴别染色法。常用的复染色法有 革兰氏染色法和抗酸性染色法，此外还有鉴别细胞各部分结构的（如芽 胞、鞭毛、细胞核等）特殊染色法。
革兰氏染色– 制片
A.ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ加小滴水
B. 涂成薄层
C. 固定菌体
2 初染 滴加结晶紫（以刚好将菌膜覆盖为宜）,染色1－2 min，水洗。 3 媒染 用碘液冲去残水，并用碘液覆盖菌膜约1min，水洗。 4 脱色 用滤纸吸去玻片上的残水，将玻片倾斜，用滴管流加95％的乙 醇脱色，直至流出的乙醇无紫色时，立即水洗。脱色时间一般 液20－30 S。脱色不足与过度都会影响和改变染色的结果。 5 复染 用番红液复染约2min，水洗。
实验三 细菌的单染色与革兰氏 染色法
1 微生物染色的基本原理
微生物染色的基本原理，是借助物理因素和化学因素的作用而进 行的。物理因素如细胞及细胞物质对染料的毛细现象、渗透、吸附作 用等。化学因素则是根据细胞物质和染料的不同性质而发生的各种化 学反应。酸性物质对于碱性染料较易吸附，且吸附作用稳固；同样， 碱性物质对酸性染料较易于吸附。如酸性物质细胞核对于碱性染料就 有化学亲和力，易于吸附。
实验革兰氏染色法
细菌呈现第一次染色的 效果紫色，革兰氏阳性 菌（紫阳G+）
呈现第二次染色的效果 红色；称革兰氏阴性菌 （红阴G -）
G+ 菌: 金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、 甲型和乙型链球菌、枯草杆菌 G- 菌: 大肠杆菌、变形杆菌、绿脓杆菌、 卡他双球菌、淋球菌等
四、注意事项：
1、选用培养18～24小时菌龄的细菌为宜，若细菌太老， 由于菌体死亡或自溶常使革兰氏阳性菌转呈阴性反应。 2、加热固定时要使用载玻片夹子，以免烫伤。不要将 载玻片在火焰上烧烤时间过长，以免载玻片破裂。 3、革兰氏染色成败的关键是脱色时间，如脱色过度， 革兰氏阳性菌也可被脱色而被误认为革兰氏阴性菌；如 脱色时间过短，革兰氏阴性菌也会被误认为是革兰氏阳 性菌。因此必须 严格把握脱色时间。 4、使用染料时注意避免沾到衣物上，乙醇脱色时勿靠 近火焰。
三、实验原理：
1、无菌操作技术：
高温对微生物具有致死效应，因为在微生物的转接 过程中，一般在火焰旁进行，并用火焰直接灼烧接种环， 以达到灭菌的目的，但一定要保证其冷却后方可进行转 接，以免烫死微生物。
2、细菌制片：
涂片法：
涂抹——细胞个体在载玻片上均匀分布，避免菌体堆 积而无法观察个体形态。 加热——固定使细胞质凝固，使细胞固定在载玻片上， 这种加热处理还可以杀死大多数细菌而且不破坏细胞 形态。
染色 (1) 初染:滴加结晶紫染液数滴 于涂片上1 分钟,水洗; (2) 媒染:滴加碘液媒染1 分钟,水洗; (3) 脱色:滴加95 %酒精,轻轻不断摇动 玻片,使染液尽可能脱去,持续20~30s, 水洗; (4) 复染:滴加稀释石炭酸复红染液数 滴于涂片上复染1 分钟,水洗。吸水纸 吸干,油镜观察。
3、革兰氏染色：
革兰氏染色是丹麦医生Hans Christian Gram于1884年发明的 一种鉴别不同类型细菌的染色方法。
革兰染色实验报告
革兰染色实验报告革兰染色实验报告一、实验目的：通过革兰染色法，观察并区分细菌的革兰氏阳性和革兰氏阴性的特征，进一步了解革兰氏染色的原理和过程。
二、实验原理：革兰染色是病原微生物鉴定和分类的重要方法之一，可用于判断微生物是革兰氏阳性菌还是革兰氏阴性菌。
原理是革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌细胞壁组成不同，前者细胞壁中含有厚壁的murein层和一些多糖类物质，后者细胞壁中只含有薄壁的murein层，革兰染色的原理是根据这一差别来进行染色。
染色步骤如下：1.准备菌液：取一株具有不完全结构的细菌菌落，悬浮在蒸馏水中制备菌液。
2.烘干菌液：从菌液中取一滴，滴在清洁的玻片上，用火焰烘烤几秒钟，待菌液干燥。
3.革兰素溶液：制备革兰染色工作溶液，将1%的革兰素溶液稀释到10倍。
4.染色过程：将烘干的菌液滴在玻片上，滴上革兰素溶液，静置1分钟后用蒸馏水洗净，然后在玻片上滴上碱性紫试剂，再用蒸馏水冲洗，最后在玻片上滴上碘试剂，再用蒸馏水冲洗，使背景显色。
将玻片在浓度逐渐增大的乙酸酒精中漂洗，直到玻片漂洗后无色即可，然后用蒸馏水冲洗。
最后，在玻片上滴上红染试剂，染色10秒钟后用蒸馏水冲洗干净，晾干后，镜下观察。
三、实验步骤：1.准备菌液：取一株细菌菌液，用蒸馏水制备悬浮液。
2.烘干菌液：取一滴菌液滴在玻片上，用火焰烘干几秒钟，使菌液干燥。
3.加染料：滴上革兰素溶液，静置1分钟后用蒸馏水冲洗。
4.加试剂：滴上碱性紫试剂，再用蒸馏水冲洗；滴上碘试剂，再用蒸馏水冲洗。
5.漂洗：用浓度逐渐增大的乙酸酒精漂洗，直到玻片漂洗后无色。
6.染色：滴上红染试剂，染色10秒钟后用蒸馏水冲洗干净，晾干后，放在显微镜下观察。
四、实验结果和分析：在显微镜下观察，发现革兰染色后，革兰氏阳性菌呈紫色或蓝色，而革兰氏阴性菌呈红色。
革兰氏阳性菌的细胞壁厚，染色较蓝色。
而革兰氏阴性菌的细胞壁薄，染色较红色。
这是由于革兰染色方法中经过上述的染色步骤，革兰氏阳性菌能够保留革兰蓝的颜色，而革兰氏阴性菌会被红染剂覆盖掩盖住。
实验二细菌革兰氏染色
（一）革兰氏染色 涂片—风干—固定—初染—水洗—媒染—水洗—
脱色—水洗—复染—水洗—干燥—镜检
菌悬液
涂片
干燥
滴加无 菌水
取菌苔
涂片
固定
Smear preparation
Heat fixing
Staining
crystal violet stain
wash with water
Counterstain with Safranin
3、用乙醇或丙酮冲洗进行脱色。在经历脱色后 仍将结晶紫保留在细胞内的为革兰氏阳性细 菌，而革兰氏阴性细菌的结晶紫被洗掉，细 胞呈无色。
4、用一种与结晶紫具有不同颜色的碱性染料对 涂片进行复染。例如沙黄，它使原来无色的 革兰氏阴性细菌最后呈现桃红到红色，而革 兰氏阳性细菌继续保持深紫色
成分
肽聚糖 磷壁酸 类脂质 蛋白质源自占细胞壁干重的%革兰氏阳性细菌
革兰氏阴性细菌
含量很高（50~90）
含量很低（~10）
含量较高（＜50）
无
一般无（＜2）
含量较高（~20）
无
含量较高
三、实验材料
1、菌种：大肠杆菌（E.C）、枯草杆菌（B.S） 2、染料：结晶紫、复红、碘液等 3、材料：95%酒精等 4、标本片：芽孢、荚膜、孢子丝
四、实验方法
注意事项：
（1）在涂片时不可过厚，否则在染色脱色时，都不易均匀， 固定时，不可过热，以载玻片不烫手为宜。
（2）严格掌握脱色程度，是革兰氏染色的关键步骤。如脱色 时间太长，阳性菌会误为革兰氏阴性菌，时间不足，革 兰氏阴性菌会误为革兰氏阳性菌。
（3）在镜检时，以分散开的菌体的革兰氏染色反应为准。 （4）设定阴性和阳性对照，确保实验的可靠性。
微生物学实验-简单染色与革兰氏染色
（3）固定：手执玻片一端，让菌膜朝上，通过火焰2-3 次固定（以不烫手为宜）。
1 简单染色：
实验方法
2 革兰氏染色： （7）水洗：用水洗去碘液。 （8）脱色：将玻片倾斜，连续滴加95%乙醇脱色30 s
左右至流出液无色，立即水洗。
（9）复染：滴加蕃红复染2 min。 （10）水洗：用水洗去涂片上的蕃红染色液。 （11）晾干：将染好的涂片放空气中晾干或者用吸水
纸吸干。
（12）镜检：镜检时先用低倍，再用高倍，最后用油 镜观察，并判断菌体的革兰氏染色反应性。
实验器材
菌种： 苏云金芽胞杆菌、金黄色葡萄球菌 液体培养12-16h的枯草芽胞杆菌和培养24h的大肠 杆菌
染色液和试剂：结晶紫、碘液、95%酒精、蕃红、 美蓝、醇醚、香柏油
器材：废液缸、洗瓶、载玻片、接种杯、酒精灯、 擦镜纸（脱脂棉）、显微镜
实验方法
1 简单染色： （1）涂片：取干净载玻片一块，在载玻片上滴2滴蒸馏
实验完毕后的处理
将浸过油的镜头按下述方法擦拭干净： （1）先用脱脂棉将油镜头上的油擦去。 （2）用脱脂棉沾少许醇醚将镜头擦2—3次。 （3）再用干净的脱脂棉将镜头擦2—3次。 （4）注意擦镜头时向一个方向擦拭。
注意事项
1.革兰氏染色成败的关键是酒精脱色。如脱色过度， 革兰氏阳性菌也可被脱色而染成阴性菌；如脱色 时间过短，革兰氏阴性菌也会被染成革兰氏阳性 菌。脱色时间的长短还受涂片厚薄及乙醇用量多 少等因素的影响，难以严格规定。
2 革兰氏染色： （1）涂片：涂片方法与简单染色涂片相同。 （2）晾干：与简单染色法相同。 （3）固定，与简单染色法相同 （4）结晶紫色染色：将玻片置于废液缸玻片搁架上，
微生物的革兰氏染色实验报告doc
微生物的革兰氏染色实验报告.doc 微生物的革兰氏染色实验报告一、实验目的和要求本次实验的目的是学习并掌握革兰氏染色的基本原理和操作方法，了解革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌的细胞壁结构和染色特性的差异，以及革兰氏染色在微生物学研究和临床诊断中的应用价值。
实验要求学生掌握革兰氏染色的步骤和注意事项，能独立进行革兰氏染色操作，并能对染色结果进行正确分析和解释。
二、实验原理和方法革兰氏染色是一种常用的细菌分类和鉴定方法，其基本原理是通过不同的染色步骤和处理条件，使细菌细胞壁上的化学成分产生不同的反应，从而导致细菌细胞呈现出不同的颜色。
革兰氏阳性菌的细胞壁较厚，主要由肽聚糖和磷壁酸组成，能够抵抗革兰氏染色的脱色剂乙醇的处理，因此能够保留结晶紫的颜色，呈现出紫色。
而革兰氏阴性菌的细胞壁较薄，主要由脂蛋白、磷脂和脂多糖组成，容易被乙醇脱色，再用复染剂番红染色后呈现出红色。
革兰氏染色的具体步骤如下：1.涂片：在干净的载玻片上滴一滴无菌水，用接种环取少量细菌与水滴充分混合，制成薄而均匀的涂片。
2.固定：将涂片在空气中自然干燥或用火焰固定。
3.初染：用结晶紫染色液染色1-2分钟，用水冲洗。
4.媒染：用碘液媒染1分钟，用水冲洗。
5.脱色：用95%乙醇脱色30秒-1分钟，用水冲洗。
6.复染：用番红染色液染色1-2分钟，用水冲洗。
7.镜检：用油镜观察并记录细菌的颜色和形态。
三、实验步骤和结果本次实验选用大肠杆菌（E. coli）和金黄色葡萄球菌（S. aureus）作为革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌的代表，按照上述步骤进行革兰氏染色操作。
具体步骤如下：1.在干净的载玻片上滴一滴无菌水，用接种环取少量大肠杆菌和金黄色葡萄球菌分别与水滴充分混合，制成薄而均匀的涂片。
2.将涂片在空气中自然干燥或用火焰固定。
3.用结晶紫染色液染色1-2分钟，用水冲洗。
4.用碘液媒染1分钟，用水冲洗。
5.用95%乙醇脱色30秒-1分钟，用水冲洗。
6.用番红染色液染色1-2分钟，用水冲洗。
革兰氏染色法实验报告
革兰氏染色法实验报告革兰氏染色法实验报告引言：革兰氏染色法是微生物学中常用的染色方法之一，它可以将细菌分为革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌两类。
本实验旨在通过革兰氏染色法的应用，观察不同菌落的染色效果，进一步了解细菌的结构和分类。
实验材料与方法：1. 实验菌株：选择了两种细菌，分别为革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌。
2. 培养基：使用了含有足够营养物质的琼脂培养基。
3. 革兰氏染色试剂：包括结晶紫、碘酒和乙醇。
4. 实验器材：无菌培养皿、移液管、显微镜等。
实验步骤：1. 在无菌培养皿上分别接种革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌，并在恰当的温度下培养。
2. 将培养皿中的菌落取出，用无菌移液管加入适量的生理盐水，悬浮菌落。
3. 取一滴悬浮的菌液，滴于载玻片上，用火焰消毒玻片。
4. 将滴有菌液的玻片放在炉子中，用火焰烘烤至完全干燥。
5. 滴加结晶紫染色液，静置片面染色1分钟。
6. 用自来水冲洗玻片，直至水洗净。
7. 滴加碘酒，静置片面染色1分钟。
8. 用自来水冲洗玻片，直至水洗净。
9. 滴加乙醇，静置片面脱色30秒。
10. 用自来水冲洗玻片，直至水洗净。
11. 用吸水纸轻轻吸干玻片上的水分。
12. 将玻片放在显微镜下，观察菌落的染色效果。
实验结果与讨论：在显微镜下观察，革兰氏阳性菌呈紫色，革兰氏阴性菌呈红色。
这是因为在革兰氏染色法中，结晶紫染色液可以渗透进细菌细胞的胞质，使细菌呈紫色。
而碘酒可以形成结晶紫-碘复合物，使细菌细胞内的染色物质更稳定，不易被乙醇脱色。
乙醇的作用是脱去细菌细胞外的结晶紫，但革兰氏阳性菌由于细胞壁较厚，结晶紫不易脱色，因此呈紫色；而革兰氏阴性菌由于细胞壁较薄，结晶紫易被脱色，因此呈红色。
通过实验可以发现，革兰氏染色法是一种简单而有效的方法，可以快速区分细菌的类型。
革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌在细胞结构上有所不同，革兰氏阳性菌的细胞壁较厚，含有较多的胞质，而革兰氏阴性菌的细胞壁较薄，胞质较少。
这种区别导致了革兰氏染色法的染色效果不同。
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崇德和合
博学敦行
二、革兰氏染色的基本原理
• G+的细胞壁主要有肽聚糖形成的网状结构 组成，在染色过程中，当用95%乙醇处理 时，由于脱水而引起网状结构中的孔径变 小，细胞壁通透性降低，使结晶紫-碘复合 物被保留在细胞壁内而不易脱色，因此呈 蓝紫色。
崇德和合
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二、革兰氏染色的基本原理
• G-的细胞壁中肽聚糖含量低，脂类物质含 量高，当用乙醇处理时，脂类物质溶解， 细胞壁的通透性增加，使结晶紫-碘复合物 容易被乙醇抽提出来而脱色，然后又被染 上了复染剂（番红）的颜色，因此呈现红 色。
崇德和合
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操作要点
• 4、如脱色过度，则阳性菌可被误染为阴性 菌；而脱色不够时，阴性菌可被误染为阳 性菌。此外，菌龄也影响染色结果，如阳 性菌培养时间过长，或已死亡及部分菌自 行溶解了，都常呈阴性反应。过于密集的 细菌，也常常呈假阳性。
崇德和合Βιβλιοθήκη 博学敦行五、染色结果
大肠杆菌电镜图
大肠杆菌革兰氏染色图 （G-）
崇德和合 博学敦行
一、实验目的及要求
• 1、了解革兰氏染色的原理。
• 2、掌握革兰氏染色的方法。
• 3、学会观察及描述细菌的形态结构。
崇德和合
博学敦行
二、革兰氏染色的基本原理
G+、G-细菌的细胞壁成分和结构不同，经两 种不同的染料处理后，呈现出不同的颜色， 从而加以区分。
革兰氏阳性菌细胞壁结构图（左边）和为革兰氏阴性菌 细胞壁结果图（右边）
大肠杆菌平板菌落图
崇德和合
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五、染色结果
金黄色葡萄球菌 电镜图
金黄色葡萄球菌革兰 氏染色图 （G+）
金黄色葡萄球菌平板 菌落图
崇德和合
博学敦行
六、思考题
• 1．涂片后为什么要进行固定?固定时应注意 什么?
• 2．试分析革兰氏染色法在细菌分类中的意
义。
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食品微生物实验 之
革兰氏染色
主讲：曹冠华
崇德和合
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背景小知识
• 革兰氏染色法是细菌学中广泛使 用的一种鉴别染色法，这种染色 法是由一位丹麦医生 汉斯〃克里斯蒂安〃革兰 （Hans Christian Gram，1853年－1938年）于 1884年所发明，最初是用来鉴别肺炎球菌 与克雷白氏肺炎菌之间的关系。 • 经革兰氏染色后，可将细菌分为革兰氏阳性 菌（G+）和革兰氏阴性菌（G-）。
崇德和合 博学敦行
背景小知识
• 革兰氏阳性菌通常对青霉素类、第一（或 第二）代头孢菌素、万古霉素、克林霉素 等高度敏感。 • 革兰氏阴性菌对第三代头孢菌素（头孢他 啶等）、氨基糖苷类（庆大霉素等）多粘 菌素等高度敏感。 • 根据细菌的革兰氏染色性质，有利于对疾 病做出诊断。同时也可做为选用抗生素的 参考。
革兰氏阴性菌结构图
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三、实验器材及试剂
• • • • • • • • • 器材： 显微镜、酒精灯、载玻片、接接环等 菌种： 大肠杆菌、金黄色葡萄球菌 药品： 初染液：草酸铵-结晶紫 媒染液：碘液 复染液：番红溶液 脱色液：95%乙醇等
崇德和合 博学敦行
四、操作步骤及要点
涂片 加热干燥 固定 结晶紫初染
1min
1min
水洗
碘液媒染
水洗
95% 乙醇脱 色
30sec
水洗
番红复染
1min
镜检
崇德和合
水洗
博学敦行
革兰氏染色操作视频
崇德和合
博学敦行
操作要点
1、在涂片区滴上香柏油，用油镜观察。 2 、加热干燥固定时的温度不要太高，否则细 胞壁会受到损伤，细胞变形。 3 、掌握好乙醇脱色时间，将载玻片上面的水 甩净，并衬以白背景，用95％酒精滴洗至流 出酒精刚刚不出现紫色时为止，约20—30秒 钟，立即用水冲净酒精。