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种子超低温贮藏【优质】PPT文档
5.解冻后的发芽方法：液氮保存顽拗型种子难以成功，可能
与保存后的发芽方法不当有关，致使还有生活力的种子在发芽过程 中受损伤或死亡。
超低温贮藏的应用
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u极大地延长储藏种子的寿命， 而不产生遗传变异
从而有效地、 安全地长期保存那些珍贵稀有的种质资源,，起到了保存和抢救濒危物 种的作用。（例如红豆杉）
❖ 对于含水量高的种子, 可以采用组织培养与超低 种子超低温贮藏是指利用液态氮(-196℃)为冷源，将种子等生物材 料置于超低温下(一般为-196℃)，使其新陈代谢活动处于基本停止状
态，而达到长期保持（种子）寿命的贮藏方法。 科学的贮藏方法可以使种子寿命延长、生活力旺盛, 并且能保证作物出苗早、整齐、健壮; 但是如果贮藏方法不合理, 则种子易霉烂、变 质, 生活力降低, 播种后易造成缺苗、断垄, 给农户带来惨重的损失。 从而有效地、 安全地长期保存那些珍贵稀有的种质资源,，起到了保存和抢救濒危物种的作用。
u安全地保存许多植物的花粉、分生组织、芽、愈伤组织和细 胞等。 u利用液氮超低温保存花粉
已经在作物、蔬菜( 包括西甜瓜) 、果树 、花卉苗木、茶树、药材等植物上取得了
一定的进展。 利用液氮超低温保存花粉的一般程序是: 花粉采集→ 花粉干燥→花粉低温预处理→
❖ 超干贮藏 适合于长期保存珍贵稀有种质
在同一植物种中这个临界值有一个不大的变动范围，但是植物种间有明显的差异。 在同一植物种中这个临界值有一个不大的变动范围，但是植物种间有明显的差异。 2、外在因素对种子对液氮反应的影响 液氮保存的种子不需要特别干燥，能省去种子的活力监测和繁殖更新，是一种省事、省工、省费用的种子低温保存新技术。
植物细胞组织和器官超低温保存
低温保存是种质资源短期和中期保存常用的方法。
主要适用再生植株、分生组织培养物的保存
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2. 干燥保存
将愈伤组织或体细胞胚等培养物，适当干燥失水，移入适 宜的低温下，可成功保存种质。 （1）预处理：将蔗糖浓度增至0.15mol/L或更高，预处理 12-20d。 （2）干燥：包括胶囊化处理（encapasulation treatment） 和脱水处理（desiccation treatment）等方法。 （3）储藏：通常选用0℃以上低温，或室温储藏。
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当温度进一步下降，细胞内外都结冰，产生冰 晶损伤。但是如果在溶液中加入冷冻保护剂，则 可保护细胞免受溶质损伤和冰晶损伤。因为冷冻 保护剂容易同溶液中的水分子结合，从而降低冰 点，减少冰晶的形成，并且通过其摩尔浓度降低 未结冰溶液中电解质的浓度，使细胞免受溶质损 伤，细胞得以在超低温条件下保存。
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一、限制生长保存
限制生长保存（restricting conservation）是指改 变培养物生长的外界环境条件，限制离体保存材料 的生长速度，使细胞生长降至最小限度，但不死亡， 从而达到延长继代培养时间的目的。
目前使用较多的限制细胞生长的措施有改变培养 环境（如降低培养温度、减少培养瓶内氧气含量、 减少光照等）、提高培养基渗透压、加入生长抑制 剂、饥饿法、失水干燥保存等。
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(2)慢速冰冻法：通常成熟的植物细胞都具有大的 液泡，含有大量水分。对大多数植物材料说来，不 适宜采用快速冰冻法，而需要在冰冻保护剂存在的 条件下，采用慢速冰冻法。以每分钟0. 1-10℃的降 温速度(一般1~2℃／分较好)。降到-70℃左右，随 即浸入液氮，或者以此种速度连续降到-196℃。在 这种降温速度下，可以使细胞内的水分有充足的时 间不断流到细胞外结冰，从而使细胞内的水分减少 到最低限度，达到良好的脱水效应，避免细胞内结 冰。该方法适用于成熟含有大液泡和含水量高的细 胞。
植物种质的超低温保存
在培养基中添加生长延缓剂能有效减缓材料的生长。
a.不同抑制剂对不同植物材料的作用效果有所差 异 b.同一种抑制剂应用在不同植物中，要达到抑制 作用而不对植物造成伤害所需要的浓度也有所不 同。 c.在一种植物上有效地抑制剂在另一种植物上则 可能无效。
实验已经证明，利用多效唑可以使玉米、水稻、小麦和马铃 薯等的试管苗生长素率降低，同时移栽成活率提高。利用二 甲基氨基琥珀酰胺酸（B9）、矮壮素（CCC）可以使葡萄试 管苗的转管从3个月一次变为一年一次。如果将低温保存与 一些生长抑制剂配合使用，则效果更佳。
d.材料大小也有影响，太大影响预培养效果，冻 存易受冰晶伤害；太小则切取困难，而且增加切 取时对材料的伤害。 e.如果采用大田生长的植物的芽，最好选择在冬 季取材。因为夏季生长的芽都不耐寒，而经秋冬 季的低温锻炼后，植物体的抗冻能力提高，所以 动机去才有较高的存活率
10.2.2材料的预处理
预处理包括材料的预培养和低温预处理，目的是 减少系孢子油水的含量，使细胞经受低温锻炼， 以有效提高组织活细胞的抗冻能力。 •在冰冻保存前的预培养时常在培养基中加入一些 可以提高材料抗冻能力的物质，如山梨酸醇、脱 落酸、脯氨酸、和二甲基亚砜（DMSO）等，最 常用的方法是增加培培养基中蔗糖的浓度。
• （1）种子保存 目前常用的种质保存方法有以下几类： 特点：传统的种质资源保存的主要方式 种子保存占用空间少，保存期较长 易干燥、包装和运输 因此种子在低温下长期保存是防止良种衰变的一条重 要途径。 但是，随着储藏时间的延长，种子生活力逐渐下降， 而且易受病虫鼠害侵袭。 此外，这种方法对于无性繁殖的种类等不适用。
•
10.2.3.2保护剂预处理
配制保护剂时，应该将其溶解在培养基里， 或是溶解在有糖或无糖的水中。为防止对细 胞的渗透冲击，保护剂应在30~60min内逐 渐加入，如用甘油则加入速度需更慢。由于 DMSO有一定毒性，所以预处理应该在0℃ 左右的低温下进行。处理时间也不能过长， 一般不宜超过1h。
植物种质的超低温保存
（三）基本程序
• 冰冻保护剂0℃预处理 • 如何选择冰冻保护剂：易溶于水；适当浓
度下对细胞无毒害；化冻后容易从组织细 胞中清除。 • 常用的冰冻保护剂：DMSO、甘油、糖、 PEG等。
（三）基本程序
• 3、降温冰冻操作
– 1）直接快速冷冻 – 2）分级冰冻法 – 3）玻璃化法
– 4）干燥冷冻法 – 5）包埋冻存法
（二）关键问题及解决措施
• 关键问题：在超低温条件下，冰冻过程中避免细 胞内水分结冰，解冻过程中防止细胞内水分次生 结冰。
• 解决措施：
– 选取细胞内自由水少、抗冻力强的植物材料； – 采取预处理措施，提高植物的抗冻力； – 在冷冻和解冻过程中尽量减少冰晶的形成；
（三）基本程序
• 1、材料的选择：
致培养物的染色体和基因型的变异；费用较高 • 超低温冷冻保存：在液氮超低温下保存种质的
技术。应用前景广阔。
一、离体保存方法
• 使保存种质处于缓慢生长或无生长状态， 需要时可迅速恢复生长。
• 抑制生长的方式：
– 降低温度 – 降低环境中的氧含量 – 使用生长延缓剂 – 其它方法
离体种质保存的优点
• 占用空间少，节省人力 、物力和土地； • 便于种质资源的交流利用； • 需要时，可以利用离体培养方法很快大量
• 玻璃化：液体转变为非晶体（玻璃态）的固化 过程。
• 原理：将高浓度的保护剂在超低温环境下凝固 ，形成无规则的玻璃化液，将玻璃化液和材料 一起处理一段时间后投入液氮中，此时冰冻保 护液和材料一起进入玻璃化状态（冰冻过程中 水分子没有发生重排，不形成冰晶，也不产生 结构和体积的改变。
玻璃化法
• 优势：设备简单、操作方便、冻存效果好。 • 影响因素： ✓ 玻璃化冰冻保护液的组成及浓度； ✓ 植物材料的脱水温度和脱水时间。
种质资源的保存方法
种质资源的保存方法
种质资源的保存方法有以下几种：
1. 冷冻保存：将种子、胚胎、胚乳、芽等种质资源放入低温环境中进行保存，常见的冷冻保存方法包括液氮冷冻、超低温冷冻等。
2. 冷谷保存：将种质资源放入干燥的低温环境中保存，例如在干燥剂中保存。
3. 真空保存：将种质资源放入真空中进行保存，可以减少氧气的作用，减缓种质资源的老化和分解。
4. 无菌保存：将种质资源置于无菌条件下进行保存，防止微生物的污染和传播。
5. 酶处理保存：通过添加酶来保护种质资源，例如添加抗氧化酶来延缓氧化反应，添加脱水酶来抑制水分的作用等。
6. 组织培养保存：将种质资源进行组织培养，使其在人工培养基上生长和繁殖，以便长期保存。
7. 动物胚胎冻存：将种质资源保存在胚胎的形态中，通过冷冻来延长胚胎的存活时间，从而保存种质资源。
以上是常见的种质资源保存方法，不同的种质资源和保存目的可以选择适合的方法进行保存。
液氮超低温冻结保藏技术规范
液氮超低温冻结保藏技术规范液氮超低温冻结保藏技术规范1. 目的规范液氮超低温冻结方法保存各类微生物菌种的操作，保证菌种长期保藏的质量和安全。
2. 范围本规程适用于各类微生物菌种的液氮超低温冻结保存。
3. 基本原则和要求针对接收的不同类群的微生物菌种资源，保藏中心应根据工作经验和微生物菌种提供人的建议，选择合适的冻结速度和保护剂系统，进行微生物菌种的液氮超低温冻结保存，以保证这些微生物菌种在长期保藏过程中的活性和稳定性。
4. 规程4.1 准备冻存管4.1.1 用蒸馏水浸泡、冲洗干净耐低温（聚丙烯）塑料冻存管，干燥后备用。
4.1.2 保藏中心应为保存菌种的每一支冻存管标注明确的标识，标签内容应至少包括菌种的保藏编号和制备批号（日期），可将保藏编号排在第一行，制备批号用连续的年月日（八位数字）表示，排在第二行，并根据冻存管的容积将标签裁成合适的大小。
保藏中心应根据标签的放置位置选择符合要求的标签材质，以确保在长期的保藏过程中，标签不会发生自然或人为的脱落、污损。
4.1.2 将准备好的标签放置于冻存管规定的位置，加入或不加入合适体积的保护剂，拧上冻存管帽，装入塑料冻存盒中，1 公斤压力蒸汽灭菌30 分钟，备用。
4.2 准备保护剂根据需要保藏的微生物类别选择适宜的保护剂种类，按照配方配制、分装、灭菌备用。
用于保存厌氧微生物的保护剂，应除去保护剂中的溶解氧。
4.3 菌种保藏4.3.1 无菌操作将符合质量要求的、需要保藏的菌种接种在规定的培养基上，并尽量涂满整个斜面，置最适宜的条件下培养，单细胞微生物菌种培养至对数生长期后期（静止期初期），对于放线菌和产孢丝状真菌应培养至形成成熟的孢子。
对于生物量较低的菌种，应多准备几只斜面菌种。
对于不产孢子的丝状真菌，无菌操作将需要保藏的菌种接种在规定的平板培养基上，培养时间根据菌种的生长速度确定。
4.3.2 用无菌滴管将一定体积的灭菌保护剂无菌操作注入培养好的斜面菌种试管中，并将菌苔（或孢子）轻轻刮下，吹打数次，制成细胞或孢子悬浮液。
种质资源超低温冷冻保存
种质资源超低温冷冻保存
晏月明
【期刊名称】《世界农业》
【年(卷),期】1990(000)010
【摘要】超低温冷冻保存是70年代发展起来的一项现代保存技术,随着研究的不断深入和完善,近年来已取得了显著进展。
超低温保存是将植物种质(包括种子、花粉、胚原、生质体、细胞组织和器官等)贮存在-196℃的液态氮中。
由于在此温度下几乎所有的新陈代谢活动都处于暂停状态,因此从理论上讲,液氮保存可使植物种质得到无限期保存。
此外,液氮保存系统稳定可靠。
【总页数】3页(P25-27)
【作者】晏月明
【作者单位】无
【正文语种】中文
【中图分类】S325
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第10章 超低温植物种质保存
第10章超低温植物种质保存——离体植物器官、组织和细胞的超低温冰冻保存技术.种质保存的常见形式:种子保存;种植保存;离体培养保存;超低温冷冻保存。
第1节抑制外植体生长的离体保存方法1 降温2 降氧3 使用生长延缓剂4 其他第2节超低温冰冻保存技术1 原理在液氮(-196o C)的超低温条件下,细胞的整个代谢和生长活动完全停止.在组织和细胞的超低温储存过程中, 不会发生遗传性状的变异,也不会丧失形态发生的潜能.主要仪器设备用于组织和细胞培养的全套设备；普通电冰箱；低温冰箱；程序降温器；液氮罐；装材料用的玻璃或塑料试管；显微镜；分光光度计；……2 材料的准备和预处理2.1材料的选择生理状态；大小；培养阶段；取材季节；……2.2 预培养和预低温处理预培养：培养基中加入一些能使抗寒力提高的物质,可以提高培养细胞的抗冰冻能力.低温预处理：将选好的细胞等材料放在低温下锻炼数天，可能大大提高液氮保存的存活率.2.3 冰冻保护剂预处理1）冰冻保护剂（冷冻保护剂，抗冻剂）常用：甘油、二甲基亚砜(DMSO)、糖类(山梨糖醇、甘露糖醇、蔗糖、葡萄糖等)、脯氨酸等.冷冻保护剂使用的浓度和种类因植物种类不同而异.对许多植物来说,DMSO最佳.DMSO对于培养细胞的适宜浓度是5~8%.2) 保护剂预处理：保护剂配制：可以溶解在培养基里,也可溶解在有糖或无糖的水中使用：为避免对细胞的渗透冲击，加保护剂应慢。
由于DMSO等有毒，冰冻保护剂预处理时必须在0o C下进行，时间一般不超过1h。
许多情况下,几种保护剂混合使用可以减低药剂的毒性,提高细胞的存活率。
可能原因：A、彼此减小甚至消除单一成分的毒害作用;B、使各种成分的保护作用得到综合协调的发展。
3 降温冰冻基本操作3.1 慢冻法在有冰冻保护剂存在的条件下,慢速降温。
通过细胞外结冰,使细胞脱水,直到细胞质的冷冻点.然后转到液氮中.适于不抗寒的植物，及悬浮培养的细胞等。
3.2 快冻法一般是将材料经低温预处理后直接投入液氮.利用超速冷冻使细胞内的水迅速通过冰晶生长的危险温度区。