蓖麻BCH基因的克隆与序列分析

蓖麻BCH基因的克隆与序列分析冯紫洲;李平;张继星;陈永胜【摘要】β-carotene hydroxylase(beta-carotene hydroxylase, BCH)is an anabolic plant carotenoid key enzyme, has important significance in plant resistance to environmental stress. Using RACE Technique to obtain 3' region and 5' region. Design the whole primer to obtain the whole sequence of BCH. The results showed:The gene coding re-gions consists of 912 bp, which can encode 303 amino acids. The BCH has 10 typical conserved histidine sites(h)ofβ-carotene hydroxylase protein. It belongs to the transmembrane protein. Campared the BCH with otherβ-caro-tene hydroxylase protein, it has high homology coincident index reached73.43%.%β-胡萝卜素羟化酶（beta-carotene hydroxylase, BCH）是植物类胡萝卜素合成代谢中的关键酶，在植物抵抗逆境环境方面具有重要意义.利用RACE方法克隆了蓖麻BCH基因的3'端和5'端片段.最后设计全长引物获得蓖麻BCH全长序列.结果表明：蓖麻BCH基因的编码区的核苷酸数为912bp，推测编码303个氨基酸；具有典型的β-胡萝卜素羟化酶蛋白的10个保守的组氨酸位点（h）；属于跨膜蛋白.蓖麻BCH蛋白与其它植物的β-胡萝卜素羟化酶蛋白有较高同源性，一致指数达73.43%.【期刊名称】《内蒙古民族大学学报（自然科学版）》【年(卷),期】2016(031)005【总页数】8页(P408-415)【关键词】蓖麻;RACE;β-胡萝卜素羟化酶;克隆【作者】冯紫洲;李平;张继星;陈永胜【作者单位】内蒙古民族大学农学院，内蒙古通辽 028043;内蒙古民族大学生命科学学院，内蒙古通辽 028043;内蒙古民族大学生命科学学院，内蒙古通辽028043;内蒙古民族大学生命科学学院，内蒙古通辽 028043【正文语种】中文【中图分类】Q78蓖麻（Ricinus communis L.）是大戟科（Euphorbiaceae）植物的一种，籽粒中油脂含量可达50%以上，因其含油量极高而被作为世界十大油料作物之一〔1〕.蓖麻的各个组织器官都有丰富的工业用途〔2〕，如叶片可以养蚕；茎秆可以造纸；脱毒的蓖麻饼粕可以制成植物高蛋白饲料；蓖麻油更是生产高级润滑油的原料.因此，蓖麻产业受到越来越多的关注〔3,4〕.β-胡萝卜素羟化酶（beta-carotene hydroxylase,BCH）是植物类胡萝卜素合成代谢中的关键酶，催化β-胡萝卜素经中间产物β-隐黄素（β-cryptoxanthin）合成一种玉米黄素（zea-xanthin）.强光胁迫下植物过量吸收光能时，玉米黄素能够促使植物以热能等形式释放多余的能量，抑制单线态活化氧的生成，防止光氧化对植物细胞的破坏，起到光保护的作用〔5〕.β-胡萝卜素羟化酶基因（BCH）的表达，影响着植物的抗逆性.如Lagarde等〔6〕得到了过表达该基因的蓝藻，章丽等〔7〕获得了过表达基因的盐生杜氏藻，Davison等〔8〕研究了过表达该基因的拟南芥植株，这些转基因植物抵抗强光、紫外线和高温等非生物胁迫的能力得到明显提高.许峰等〔9〕对转盐生杜氏藻BCH基因烟草的耐盐性做了较为系统地研究，发现转基因烟草的耐盐性得到了显著提高，表明BCH基因在植物抵抗盐胁迫方面也起着重要作用.植物BCH基因的克隆及功能研究，为进一步阐明该基因的作用机理奠定了基础，为提高作物的抗逆性提供了新的思路.本试验利用RACE方法克隆了蓖麻β-胡萝卜素羟化酶基因，系统地对该基因进行生物信息学分析，详细地了解其蛋白生理生化性质.克隆和分析这一基因为我们研究蓖麻BCH基因结构功能方面的应用创造条件，为提高蓖麻抗逆能力提供可能，具有一定的实践意义.1.1 材料蓖麻种植于内蒙古民族大学工程训练中心516室，品种为通蓖5号，取新鲜叶片为供试材料.1.2 方法1.2.1 蓖麻叶片总RNA的提取使用改良的Trizol提取法提取总RNA〔10〕，几乎没有DNA和蛋白质的污染，其纯度较高而具有较好的效果.1.2.2 3'RACE扩增根据其他植物上的BCH蛋白的保守序列设计，设计3'RACE简并引物：BMBCH3'-1：5'-TWTTRTNGGYAGMTGGMGKGYGGA-3'（V=C/G;W=T/A/C;R=T/A;Y=C/G/A;B=C/G/T）.反应按照3'-Full RACE Core Set with PrimeScript™RTase（6106,Takara）试剂盒说明书进行.使用3'RACE Adaptor（来自3'-Full RACE Core）为反转录引物进行反转录，反应条件：42℃60m in；70℃15min；4℃保存.第一轮PCR利用引物BMBCH3'-1和3'RACE Outer Primer（来自3'-Full RACE Core），反应条件：94℃3min；94℃30s, 55℃40s,72℃60s,20个循环；72℃10min；4℃保存.第二轮PCR利用引物BMBCH3'-1和3'RACE Inner Primer（来自3'-Full RACE Core），反应条件：94℃3min；94℃30s,58℃40s,72℃60s,30个循环；72℃10min；4℃保存.1.2.35 'RACE扩增利用前阶段试验已经克隆得到的蓖麻BCH3'端基因片段，利用引物设计软件prime primer 5设计：BMBCH5'-1：5'-GACCTTCTCTTGGTCGATGGTGAGA-3'；BMBCH5'-2；5'-ACCCACAGCAGCCCCTACGGATAGA-3'.反应按照5'-Full RACE Kit with TAP（6107,Takara）试剂盒说明书进行.使用Random 9 mers （来自5'-Full RACE Kit）为反转录引物进行反转录获得cDNA第一条链.第一轮PCR利用引物BMBCH5'-1和5'RACE Outer Primer（来自5'-Full RACE Kit），反应条件：94℃3min；94℃30s,55℃40s,72℃60s,20个循环；72℃10min；4℃保存.第二轮PCR利用引物BMBCH5'-2和5'RACE Inner Primer（来自5'-Full RACE Kit），反应条件：94℃3min；94℃30s,58℃40s,72℃60s,30个循环；72℃10min；4℃保存.1.2.4 BCH基因全长的克隆采用DNAMAN软件对测定的核苷酸5'端和3'端序列进行电子序列的拼接合并，从而获得cDNA全长，在该基因编码区域的两端设计全长特异性引物：BMBCHQC5'-1：5'-ATGGCGGCTGGACTATCCGCCGCGCC-3'；BMBCHQC3'-1：5'-TCATCTACCATTGTATGATTTTTTTCTC-3'.反转录使用Oligo dT为引物，反应条件65℃5min;42℃60min;70℃5min；4℃保存.PCR扩增利用引物BMBCHQC5'-1和BMBCHQC3'-1，反应条件：94℃3min；94℃30s,55℃40s,72℃60s,30个循环；72℃10min；4℃保存.1.2.5 BCH序列分析对测序结果进行分析，确定克隆获得蓖麻BCH基因cDNA序列完整开放阅读框.利用TMHMM、DNAMAN等生物学软件进行生物信息学分析.2.1 蓖麻叶片总RNA活性的检测将提取好的蓖麻总RNA用DEPC水进行10倍稀释，然后通过琼脂糖凝胶电泳，检测其纯度，结果如下：2.2 RcBCH基因3'端克隆以反转录液为模板，利用保守区设计上游简并引物（BMBCH3'-1）与3'-Full RACE Core中的巢式锚定引物进行套式PCR扩增，可进行多步套式扩增，得到一条近650bp的特异性DNA片段（图2）.2.3 RcBCH基因5'端克隆利用前阶段试验已经克隆得到的蓖麻BCH3'端基因片段，设计引物BMBCH5'-1和BMBCH5'-2与5'-Full RACE Kit with TAP中的巢式锚定引物进行套式PCR扩增，可进行多步套式扩增，得到一条近750bp的特异性DNA片段（图3）.2.4 RcBCH基因cDNA全长ORF克隆利用DNAMAN软件对已经获得的目的基因3'端序列和5'端序列进行电子拼接，从而得到BCH全长序列.在该序列ORF（open reading frame，ORF）两端设计特异性引物，扩增出约为1000bp的BCH cDNA基因编码区序列（图4），该序列的长度符合两引物间序列的长度.2.5 RcBCH基因ORF分析利用DNAMAN软件对获得的BCH基因全长序列进行分析（图5，6）.包括912bp完整的开放阅读框，可推测编码303个氨基酸的多肽.2.6 RcBCH蛋白保守区分析克隆得到BCH基因全长序列，利用NCBI的Conserved Domains（/Structure/ cdd/wrpsb/cgi）预测基因保守区，结果表明BCH含有脂肪酸羟化酶家族保守区，表明BCH与这些家族的蛋白具有相似的功能，是蓖麻的一种脂肪酸羟化酶（图6）.2.7 RcBCH基因编码的氨基酸序列分析利用DNAMAN软件对RcBCH基因编码的氨基酸序列分析，结果表明BCH蛋白的分子量为34.158KDa，等电点（pI）值为9.32，pH7.0时电荷为8.55.预测蓖麻BCH蛋白氨基酸序列的疏水性，结果表明（图7），该蛋白多肽链整体表现为疏水性，可确定为疏水性蛋白.运用SOPMA软件预测RcBCH蛋白的二级结构，表明该蛋白含约40.92%的α-螺旋，17.49%的延伸链，7.26%的β-转角，34.32%的无规卷曲（图8）.2.8 RcBCH基因编码的氨基酸序列同源性比对与系统发育分析将获得的蓖麻RCH蛋白氨基酸序列在NCBI网站上运用Blastp对序列进行在线对比，发现该基因的氨基酸序列与β-胡萝卜素羟化酶蛋白有非常高的相似度.其中，与麻风树的BCH蛋白（Jatropha curcas, XP_012090186.1）一致性最高，达到84%；其次与可可BCH1蛋白（Cacao,XP_007038805.1）的一致性达到了78%（图9）.利用DNAMAN软件对蓖麻BCH与麻风树（Jatropha carcasL,XP_012090186.1）、大豆（Glycine max（Linn.）Merr,KRH08862.1）、烟草（Nicotiana tabacum L,NP_001313021.1）、胡杨（Populus euphratica,XP_011046016.1）、苹果（Malus pumila,XP_008343769.1）、葡萄（Vitis vinifera L,XP_002273581.1）、拟南芥（Arabidopsisthaliana,P_194300.1）、番木瓜（Carica papayaL,ADZ14893.1）的β-胡萝卜素羟化酶蛋白氨基酸序列对比（图10）.结果表明，蓖麻的BCH蛋白与所选取植物一致指数（Identity）为73.43%，可推测它们具有较高的同源性.图中“h”为β-胡萝卜素羟化酶蛋白的10个保守的组氨酸位点.从GenBank中搜索一些有代表性的β-胡萝卜素羟化酶蛋白氨基酸序列，利用DNAMAN软件对不同来源的β-胡萝卜素羟化酶蛋白之间的遗传关系进行了系统发育分析（图11）.结果表明，RcBCH基因编码蛋白与同为大戟科的麻风树的亲缘关系最近，达到86%；其次是胡杨，与大豆、苹果、拟南芥的亲缘关系较远.2.9 RcBCH基因编码的氨基酸序列结构域分析利用软件TMHMM对蓖麻BCH蛋白的氨基酸序列进行跨膜区的结构分析，结果表明，RcBCH蛋白的氨基酸序列中共有4个跨膜结构区（图12）.蓖麻BCH蛋白的4个跨膜结构域与其它植物的β-胡萝卜素羟化酶蛋白高度相似.经RACE法克隆得到912bp的蓖麻β-胡萝卜素羟化酶基因cDNA完整的开放阅读框序列，推测其可编码303个氨基酸的多肽.蓖麻BCH蛋白含有典型的β-胡萝卜素羟化酶蛋白的10个保守的组氨酸位点（h）；经跨膜分析后推断该基因序列编码的氨基酸序列存在4个跨膜结构域与其它植物的β-胡萝卜素羟化酶蛋白相当，属于跨膜蛋白；对其氨基酸含量进行测定发现其属于疏水性蛋白；在NCBI网站BLASTp对蓖麻BCH与植物中已克隆的BCH蛋白序列比对发现，蓖麻BCH与其它植物的β-胡萝卜素羟化酶蛋白具有较高同源性，一致指数达73.43%.随着β-胡萝卜素羟化酶蛋白研究的深入，β-胡萝卜素羟化酶基因在多种植物中被克隆和表达分析，这有利于在分子水平鉴定β-胡萝卜素羟化酶蛋白的结构和功能特性.β-胡萝卜素羟化酶在抵抗强光、紫外线、高温和盐碱等非生物胁迫方面，具有显著的作用.因此，可以利用分子生物学方法研究该基因，并转化到蓖麻植株内，以培育出抗逆效果显著的蓖麻新品种.〔1〕郑鹭,祁建,陈绍军,等.蓖麻遗传育种进展及其在生物能源与医药综合利用潜势〔J〕.中国农学通报，2006，22（09）: 109-113〔2〕严明芳,谭美莲,严兴初,等.蓖麻的离体再生培养研究〔J〕.内蒙古民族大学学报（自然科学版），2012，27（05）: 541-544.〔3〕林岩陆,建飞,周桂生.基于产业链视角的中国蓖麻产业发展的分析〔J〕.中国农学通报,2011，27（29）:124-127.〔4〕孙振钧,吕丽媛,伍玉鹏.蓖麻产业发展:从种植到利用〔J〕.中国农业大学学报,2012，15（06）:341-344.〔5〕Adams B D,Gilmore A M,Adams W W.In vivo functions of carotenoids in higher plants〔J〕.Faseb Journal,1996,10（4）: 403-412.〔6〕Lagarde D,Beuf L,Vermaas W.Increased Production of Zeaxanthin and Other Pigments by Application of Genetic Engineering Techniques to Synechocystis sp.Strain PCC 6803〔J〕.Applied and Environmental Microbiology，2000，66:64-72.〔7〕章丽,龚一富,刘晓丹,等.盐生杜氏藻β-胡萝卜素羟化酶基因（chyb）的克隆及表达分析〔J〕.农业生物技术学报,21（8）:920-930〔8〕Davison P A,Hunter C N.Horton P.Overexpression of beta-carotene hydroxylase enhances stress tolerance in Arabidopsis〔J〕.Nature,2002,418（6894）:203-206.〔9〕许峰,龚一富,刘林,等.转盐生杜氏藻β-胡萝卜素羟化酶基因（chyb）烟草的获得及耐盐性鉴定〔J〕.农业生物技术学报,2015,23（9）:1149-1156.〔10〕张继星,刘鹏,黄凤兰,等.蓖麻总RNA提取〔J〕.内蒙古民族大学学报（自然科学版），2010，25（1）:540-542.。