山东大学鸡血红细胞细胞融合
实验十 PEG法诱导鸡血细胞融合
（7）詹纳绿染液。
四、方法与步骤
（一）鸡血细胞的体外融合
1.鸡血细胞的获得 用肝素溶液润洗注射器，从家鸡的翼根静脉用注射器采血，
注入试管后，速加入肝素（100U肝素/5ml全血）混合，制 成抗凝全血。 2.鸡血细胞储备液的制备 在抗凝全血的试管中，加入4倍体积的0.85%NaCl溶液，制 成红细胞储备液，置于4℃冰箱内可供一周内使用。
• 影响原生质体融合的因素。 （1）首先是酶解条件： 渗透压稳定剂 Ca2+ 、Mg2+、蔗糖 可保持原生质体稳定利于再生；随着酶解时间的增加原生 质体的释放量增大；酶解浓度到达一定浓度后，原生质体 的再生率下降；再就是酶解温度。 （2）原生质体的脱壁是否完全会影响融合效果。有的原生质 体会很快再生细胞壁，因此在洗去酶液后，应立即进行融合 处理。 （3）原生质体的悬浮状况也会影响融合，如果两亲本原生质 体密度相差较大，就难以混和均匀，接触机会减少，这时应 用离心方法强迫它们密集
实验 十 PEG法诱导鸡血细胞融合
College of Life Science and Technology, XINJIANG Univercity
一、实验目的
了解聚乙二醇（PEG）诱导体外细胞融合 的基本原理。
通过PEG诱导鸡血细胞之间的融合实验， 初步掌握细胞融合的基本方法。
二、实验原理
荧光标记的细胞融合
三．实验仪器、材料和试剂
仪器、用具：注射器、刻度离心管、离心 机、血细胞记数板、水浴锅、滴管、显微 镜、烧杯、容量瓶、凹面载玻片、盖玻片、 酒精灯等。
材料：成年家鸡。
■ 试剂
（1）0.85%NaCl溶液:
鸡血细胞的体外融合
鸡血细胞的体外融合[实验目的]1、了解聚乙二醇（PEG）诱导体外细胞融合的基本原理。
2、通过PEG诱导鸡血细胞之间的融合实验，初步掌握细胞融合的基本方法。
[实验原理]细胞融合又称体细胞杂交，是指用人工方法使两个或两个以上的体细胞融合成异核体细胞，随后，异核体同步进入有丝分裂，核膜崩溃，来自两个亲本细胞的基因组合在一起形成只含有一个细胞核的杂种细胞。
依据融合过程采用的助融剂不同，细胞融合可分为：●病毒诱导的细胞融合，如仙台病毒（HVJ）；●化学因子诱导的细胞融合，如聚乙二醇（PEG）；●电场诱导的细胞融合；●激光诱导的细胞融合PEG是乙二醇的多聚化合物，可改变各类细胞的膜结构，使两细胞接触点处脂类分子发生疏散和重组，诱导产生细胞融合。
商品PEG存在一系列不同分子质量的多聚体，一般应用PEG4000~6000的溶液，能够产生高频率的细胞融合。
[实验材料]注射器、滴管、烧杯、容量瓶、凹面载玻片、盖玻片、离心机、水浴锅、显微镜、细胞计数板、酒精灯、刻度离心管、Hanks液：Hanks原液 100mL重蒸水 896mL0.5%酚红 4mL配好的Hanks液，分装包扎好贴上标签，经过灭菌后，4℃保存。
GKN液：50%（m/V）PEG溶液取50g PEG4000放入100mL瓶中，高压灭菌20min让PEG冷却到50~60℃，勿让其凝固加入50mL预热至50 ℃的Hanks液，混匀，至37 ℃保温备用。
詹纳斯绿染液、0.85% NaCl溶液[实验步骤]1、鸡血细胞悬液的制备在离心后的鸡血细胞沉淀中加入10ml的GKN溶液，将细胞悬浮。
取0.5ml鸡血细胞悬液，加3.5ml GKN溶液。
镜检，在血细胞计数板上计数。
稀释至1X107个/ml，于37℃保温。
2、鸡血细胞的收集吸取1ml鸡血细胞悬液放入离心管中，加入4mlHanks液混匀，1000rpm离心5min。
弃去上清液，用手指轻弹离心管底部，使沉淀的血细胞团块松散。
实验一：鸡血细胞融合
实验一：鸡血细胞融合一、实验目的1、熟悉细胞融合的理论；2、掌握PEG诱导的细胞融合方法。
二、实验原理1、细胞融合原理两个以上的细胞合并成为一个双核或多核细胞称为融合细胞。
在通常情况下，两个细胞接触并不发生融合现象，因为各自存在完整的细胞膜，在特殊融合诱导物的作用下，两个细胞膜发生一定的变化，就可促进两个或多个细胞聚集，相接触的细胞膜之间融合，继之细胞质融合，形成一个大的融合细胞。
利用PEG介导的动物细胞融合，其实验原理到目前为止还没有完全定论。
学者们一般认为，PEG改变各类细胞的膜结构，使两细胞相互接触部位的膜脂双层中磷脂分子发生疏散、进而使其结构发生重排，再加上膜脂双层的相互亲合以及彼此间表面张力的作用，引起相临的重排质膜在修复时相互合并在一起,使两细胞的胞质沟通,从而造成相互接触的细胞之间发生融合。
细胞与组织不同，不排斥异类、异种细胞。
不仅能产生同种细胞融合、种间细胞融合，而且也能诱导动植物细胞间产生融合。
细胞融合(Cell fusion)，即在自然条件下或用人工方法(生物的、物理的、化学的)使两个或两个以上的细胞合并形成一个细胞的过程。
人工诱导的细胞融合不仅能产生同种细胞融合，也能产生种间细胞的融合。
2、细胞融合方法诱导细胞融合的主要方法有：病毒诱导融合，化学融合剂诱导融合和电融合。
1. 病毒诱导融合：有许多种类的病毒能介导细胞融合，最常用的是灭活的仙台病毒（HVJ），为RNA病毒。
病毒诱导细胞融合的过程有：首先是细胞表面吸附许多病毒粒子，接着细胞发生凝集，几分钟至几十分钟后，病毒粒子从细胞表面消失，而就在这个部位邻接的细胞的细胞膜融合，胞浆相互交流，最后形成融合细胞。
2. 化学融合剂诱导融合：化学融合剂主要有高级脂肪酸衍生物、脂质体、钙离子、水溶性高分子化合物、水溶性蛋白质和多肽，其中最常用的是聚已二醇（PEG）。
PEG用于细胞融合至少有两方面的作用：①可促使细胞凝结；②破坏互相接触处的细胞膜的磷脂双分子层，从而使相互接触的细胞膜之间发生融合，进而细胞质沟通，形成一个打的双核或多核融合细胞。
动物细胞融合实验实验报告
动物细胞融合实验实验报告
实验目的：1、了解动物细胞融合的常用方法
2、学习化学融合的基本操作过过程
3、观察动物细胞融合过程中的细胞行为和变化
实验材料：鸡血红细胞、50%PEG溶液、0.85%氯化钠溶液、显微镜、离心机、载玻片、盖玻片等
实验原理：聚乙二醇（PEG）能够改变细胞膜脂质分子的排列，在去除这些物质之后，细胞膜趋向于恢复原有的有序结构。
在恢复过程中相接触的细胞由于接口处脂质双分
子层的互相亲和与表面张力，细胞膜融合，胞质流通，发生融合。
实验步骤：1、取鸡血，离心后去除上清液，以0.85%氯化钠溶液制成5%~10%的悬液
2、加入GKN液4ml，混匀
3、加入14滴PEG液，静置3~5min后混匀，放于显微镜下观察
实验结果：显微镜下可观察到有些细胞发生质膜融合
分析与讨论：细胞融合的应用有微生物原生质体融合构成新菌株、利用原生质体融合和培养技术培育新植物、细胞杂交瘤技术与单克隆抗体、用于基因定位和绘制人类基因
图谱、用于生产树突状细胞抗肿瘤疫苗、用于动物育种、用于细胞疗法等。
动物细胞融合--山东大学
姓名系年级13级生科组别同组者科目细胞生物学实验题目动物细胞融合学号动物细胞融合【实验目的】1.了解动物细胞融合的常用方法。
2.学习化学融合和电融合的基本操作过程。
3.观察动物细胞融合过程中细胞的行为和变化。
【实验原理】细胞融合是指在自发或者诱导条件下，两个或两个以上细胞合并为双核或者多核细胞的过程。
目前人们已经发现有很多方法可以诱导细胞融合，包括病毒诱导融合、化学诱导融合和电激诱导融合。
1.病毒诱导融合仙台病毒、牛痘病毒、新城鸡瘟病毒和疱疹病毒等可以介导细胞的融合。
这类病毒的被膜中含有融合蛋白，可介导病毒同宿主细胞融合，同时也可介导细胞与细胞的融合。
用紫外线灭活后，这些病毒即可诱导细胞发生融合。
2.化学诱导融合很多化学试剂能够诱导细胞融合，如聚乙二醇(PEG)、二甲基亚砜、山梨醇、甘油、溶血性卵磷脂、磷脂酰丝氨酸等。
这些物质能够改变细胞膜脂质分子的排列，在去除这些物质之后，细胞膜趋向于恢复原有的有序结构。
在恢复过程中相接触的细胞由于接口处脂质双分子层的相互亲和与表面张力，细胞膜融合，胞质流通，发生融合。
化学诱导方法，操作方便，诱导融合的概率比较高，效果稳定，适用于动、植物细胞，但对细胞具有一定的毒性。
PEG 是被广泛使用的化学融合剂。
3.电激诱导融合包括电诱导、激光诱导等。
其中，电诱导是先使细胞在电场中极化成为偶极子，沿电力线排布成串，再利用高强度、短时程的电脉冲击破细胞膜，细胞膜的脂质分子发生重排，由于表面张力的作用，两细胞发生融合。
电诱导方法具有融合过程易控制、融合概率高、无毒性、作用机制明确、可重复性高等优点。
【实验材料和用品】1.材料鸡血红细胞2.试剂50%PEG溶液、Alsever’s细胞保存液、GKN溶液、0.85%氯化钠溶液。
3.器材光学显微镜、离心机、载玻片、盖玻片、离心管、滴管等。
姓名系年级13级生科组别同组者科目细胞生物学实验题目动物细胞融合学号【实验步骤】本实验采用PEG促细胞融合法，实验步骤如下：1. 取鸡血2ml+2ml Alsever液，再加入6ml Alsever液，混匀后制悬液。
实验十一 鸡血细胞融合
4
PEG是乙二醇的多聚化合物，存在一系列 不同分子质量的多聚体。PEG可以改变各 类细胞的膜结构，使两细胞接触点处脂类 分子发生聚散和重组，引起细胞融合。 融合的频率和活力与所使用的PEG的相对 分子质量、浓度、作用时间、细胞的生理 状态与密度等相关。
5
实验步骤
(1)取鸡血储备液1mL，加入4mL0.85％生理盐水，混匀， 1200rpm/min 离心5min，弃去上清液。 (2)加入5mLGKN工作液制成鸡血细胞悬液。 (3)取1mL鸡血细胞悬液，加入4mLHanks液混匀，1000rpm/min 离心5min，去上清液，用手指轻弹离心管底部，使沉淀的血细胞 团快松散。 (4)取50％PEG溶液0.5ml，在1分钟内逐滴加入到鸡红细胞悬液， 边加边轻轻摇动混匀。待PEG全部加入后37℃水浴静置2分钟左 右。此全部过程都要求在37℃水浴内进行。 (5)缓慢加入5ml Hanks液，轻轻吹打混匀，在37℃水浴内静置5 分钟以终止PEG的作用，。 (6)用吸管轻轻吹打细胞团快数次使细胞团分散，1000转离心 5min，弃去多数上清液，留少许溶液混匀，取一滴融合后的细胞 悬液滴片，滴加一滴詹纳斯绿染液或者Giemsa染液，加盖片镜 检。
实验十一 鸡血细胞融合
1
实验目的
掌握细胞融合原理 应用聚乙二醇（PEG）融合细胞的方法 细胞融合率的计算。
2
实验用仪器及材料
实验仪器及材料
一、材料 鸡红细胞 二、器材和仪器：显微镜、离心机、水浴箱、 刻度离心管、试管、载玻璃片、盖玻片 三、试剂 50％PEG(MW4,000)、Hanks液(pH7.4)
6用吸管轻轻吹打细胞团快数次使细胞团分散用吸管轻轻吹打细胞团快数次使细胞团分散10001000转离心转离心5min5min弃去多数上清液留少许溶液混匀取一滴融合后的细胞弃去多数上清液留少许溶液混匀取一滴融合后的细胞悬液滴片滴加一滴詹纳斯绿染液或者悬液滴片滴加一滴詹纳斯绿染液或者giemsagiemsa染液加盖片镜染液加盖片镜77数据记录数据记录结果观察结果观察在高倍镜下可以看到有两个或两个以上的鸡红细胞膜在高倍镜下可以看到有两个或两个以上的鸡红细胞膜融合在一起形成一个异核体细胞
实验八 鸡红细胞融合
六、讨论
• 血细胞悬液密度与融合率的关系？ • 查阅近期资料，了解如何提高融合率？ • 本实验为什么用鸡血？
• 目前, 诱导细胞融合的方法有三种：病毒(Okada, 1958)、聚乙二醇(polyethylene glycol, PEG) (Pontecorvo, 1975)和电激(Zimermann, 1980)。
• PEG能改变各类细胞的膜结构，使两细胞相互接触 部位的膜脂双层中磷脂分子发生疏散、进而使其结 构发生重排，再加上膜脂双层的相互亲合以及彼此 间表面张力的作用，引起两个细胞邻接位置的重排 质膜在修复时相互合并在一起, 使两细胞的胞质沟 通, 从而造成相互接触的细胞之间发生融合。
实验八 鸡红细胞融合实验
一、实 验 目 的 1. 通过PEG介导的鸡血细胞融合实验, 理解
体细胞融合原理 2. 掌握利用PEG介导动物细胞融合的实验技
术，并观察细胞融合过程。
二、实验原理
• 细胞融合(cell fusion)或细胞杂交(cell hybridization) 是指真核细胞通过介导和培养，两 个或多个细胞合并成一个双核或多核细胞的过程。
1 器材：
三、实验用品
• 离心机，水浴锅，普通光学显微镜；量筒， 滴管，刻度离心管，等。
2 材料 ：新鲜鸡血
五、 实验结果
• 经PEG处理后，显微镜下，可观察到未融合的 单核细胞、融合后的双核细胞和融合后的多核细
胞。绘图说明各个时期。细胞融合后可观察到 哪几种类型的细胞？
• • 细胞融合率是指在显微镜的一个视野内，已发生
细胞生物学实验报告——动物细胞融合
山东大学细胞生物学实验报告聚乙二醇（PEG ）法诱导的动物细胞融合实验2012/9/11实验目的：了解细胞融合技术的发展过程和主要方法的基本原理，用聚乙二醇(PEG)化学诱导法进行鸡血红细胞的融合实验，掌握实验的基本操作，观察鸡血红细胞融合的不同时期。
实验原理：1. 细胞融合的概念两个或两个以上的细胞或原生质体在自然或人为诱导的情况下细胞质膜相互融合，细胞质相互混合成为一个整体杂合细胞的现象被称为细胞融合。
细胞融合可以发生在同种细胞之间也可以在不同物种间实现。
2. 细胞人工融合的主要方法及基本原理细胞体外融合的主要方法分为病毒诱导，化学诱导和物理诱导。
1953年，M. Kuroya 在临床中第一次分离到仙台病毒（HVJ ）[1]。
1958年，日本学者Okada 发现仙台病毒（HVJ ）能诱导动物细胞融合[2]，其基本原理是仙台病毒的衣壳上有细胞表面受体的结合位点，可以诱导不同细胞凝集，最终使不同细胞的细胞膜相互融合。
1974年，加拿大学者高国楠发明了细胞的聚乙二醇（Polyethyleneglycol ，PEG ）化学融合法，由于该方法对实验条件要求极低，试剂易得，操作简单，成为应用最广泛的细胞融合方法。
化学诱导细胞融合的基本原理是PEG 等化学物质能够诱导细胞膜磷脂分子的极性基团发生结构重排，相互接触的细胞在细胞膜恢复过程中借助磷脂分子的亲和作用和表面张力实现融合。
比之于仙台病毒诱导法，PEG 诱导法的效率提高了几百倍。
80年代，科学家发明了细胞电融合法[4, 5]，电融合法将细胞融合的产率提高到了50%-80%。
电融合法的建立是基于细胞膜表面带电荷的性质。
当在细胞悬液周围加入特定方向的电场时，细胞表面会发生极化现象，相邻的细胞将吸附在一起。
这时突然提高电场强度，细胞间彼此接触的细胞膜会被击穿，细胞膜修复时受到磷脂分子间的亲和作用和细胞膜表面张力的作用将会发生融合。
图2. 以电融合方法得到的3T3-C2融合细胞 （引自J. Teissie 等，1982 )。
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山东大学实验报告2015年3月6 日
姓名闫于倓班级13级生命基地班学号201300140112 同组者：彭旸科目细胞生物学实验题目细胞融合一，实验目的：
1、了解动物细胞融合的常用方法。
2、学习化学融合的基本操作过程。
3、观察动物细胞融和过程中细胞的行为和变化。
二、实验用品
1、材料鸡血红细胞
2、试剂50%PEG、Hank’s溶液（pH7.4）、Alsever’s细胞保存液0.85%氯化钠溶液。
3、器材普通光学显微镜、离心机、量筒、载玻片、盖玻片离心管、废液缸等。
三、实验原理
细胞融合是指在自发或者诱导条件下，两个或两个以上细胞合并为双核或者多核细胞的过程。
目前人们已经发现有很多方法可以诱导细胞融合，包括病毒诱导融合、化学诱导融和和电激诱导融合：
1、病毒诱导融和：仙台病毒、牛痘病毒、新城鸡瘟病毒和疱疹病毒等可以介导细胞的融时也可介导细胞与细胞的融合。
用紫外线灭活后，这些病毒即可诱导细胞发生融合。
2、化学诱导融合：很多化学试剂能够诱导细胞融合，如聚乙二醇(PEG)、二甲基亚砜、山梨醇、甘油、溶血性卵磷脂、磷脂酰丝氨酸等。
这些物质能够改变细胞膜脂质分子的排列，在去除这些物质之后，细胞膜趋向于恢复原有的有序结构。
在恢复过程中想接触的细胞由于接口处脂质双分子层的相互亲和与表面张力，细胞膜融合，胞质流通，发生融合。
化学诱导方法，操作方便，诱导融合的概率比较高，效果稳定，适用于动、植物细胞，但对细胞具有一定的毒性。
PEG是广泛使用的化学融合剂。
3、电激诱导融合：包括电诱导、激光诱导等。
其中，电诱导是先使细胞在电场中极化成为偶极子，沿电力线排布成串，再利用高强度、短时程的电脉冲击破细胞膜，细胞膜的脂质分子发生重排，由于表面张力的作用，两细胞发生融合。
电诱导方法具有融合过程易控制、融合概率高、无毒性、作用机制明确、可重复性高等优点。
四、实验步骤
1、鸡血细胞的制备与保存（老师完成）。
2、取鸡血1ml+0.85%的NaCl溶液4ml，在1200r/min的离心机内离心5分钟。
3、将上一步的沉降血球（去上清液后，约0.1-0.2ml），加入GKN 液至4ml，制成细胞悬液。
4、有下面两种方法：
方法一：取上步得到的细胞悬液1ml，加0.5ml的PEG液，静置5min
后摇匀，制片，在显微镜下观察。
方法二：取上步得到的细胞悬液0.5ml，加0.5ml的PEG液，静置5min，摇匀,制片，在显微镜下观察。
方法三：取上步得到的细胞悬液0.5ml，加1.0ml的PEG液，静置5min，摇匀,制片，在显微镜下观察。
五、实验结果
方法一：
细胞初步凝集细胞初步相接细胞融为一体细胞发生变形（10×40）（10×40）（10×40）（10×40）
方法二：
细胞初步凝集细胞初步相接细胞融为一体细胞发生变形
（10×40）（10×40）（10×40）（10×40）
方法三：
变形较为明显！
细胞初步凝集细胞初步相接细胞融为一体细胞发生变形（10×40）（10×40）（10×40）（10×40）
六、结果分析
1、结果中由于PEG的作用，细胞变形情况较为严重（圆形细胞几乎都变成了椭圆形甚至杆状！）。
2、因为PEG作用时间长（计时稍长），细胞受到严重损伤；且混合液粘度较高，没有观察到细胞的运动情况（也未观察到细胞融合状态在随时间的显著变化）。
3、因为PEG有的凝集作用，红细胞发生多细胞的凝集反应（大量出现多聚体！）。
4、因融合时间短的缘故，基本没有观察到细胞的完全融合。
5，细胞变形也有可能是吹细胞沉降物时过于剧烈导致。
6.融合后变形现象较为罕见，只有三组有几个
7.有大量多细胞融合的现象出现，且与方法无关：
8.查询资料，细胞融合的意义有：
在正常的育种过程中，有着远缘杂交不亲和的现象，即不同种的物种间杂交的后代高度不育，就像马和驴杂交产生骡子后，骡子无法产生下一代。
如果异种细胞融合后能正常表达的话就可以克服这一育种困难，可以让一个生物同时具有两种生物的性状，因为融合后的细胞拥有两个亲本全套的遗传物质，那样就有了遗传信息上的基础，加上体细胞融合一般都是二倍体融合，那样不会出现无法进行减数分裂的情况，保证了后代的遗传信息的稳定性，让杂交得到的后代的性状成为可遗传的性状。
植物的异种细胞融合现在多用于新的植物品种的培育。
动物的异种细胞融合现在多用于单克隆抗体的开发，还有膜蛋白的研究。
可以说增加了生物的遗传多样性吧！（也为人类开发新性状物种打下了基础）
核似
乎未
完全
融合 核似乎完全融合 疑似为细胞凝聚，非细胞融合
七、注意事项
1、PEG特性：亲脂性，与质膜结合，改变磷脂双分子层的结构；PEG可使膜脱水，以收缩促进融合；有促使细胞凝集作用。
2、PEG对细胞融合的作用效果与毒害作用随着分子量的增加而增大，在实验过程中一般取其分子量800-6000。
若做细胞融合培养实验则需考虑融合细胞的成活率，故使用分子量不大于1000的PEG溶液；做细胞融合实验，本次试验中采用分子量为4000的PEG。
3、PEG对细胞融合的作用效果和毒害作用随着浓度的增加而增大。
在实验过程中一般采用40%-60%浓度的PEG溶液。
4、在制备鸡血红细胞时要反复离心洗涤制备的鸡红细胞液以清洗掉杂质
八．参考资料《细胞生物学实验》
百度百科，豆丁网，。