鸡血细胞的体外融合
鸡血细胞的体外融合
鸡血细胞的体外融合【实验目的】1．掌握聚乙二醇（PEG ）诱导体外细胞融合的基本原理。
2．通过PEG 体外诱导鸡血细胞之间的融合实验，初步掌握细胞融合的基本方法。
【实验原理】细胞融合(cell fusion ）又称体细胞杂交，是指用人工方法使两个或两个以上的体细胞融合成异核体细胞，随后，异核体同步进入有丝分裂，核膜崩溃，来自两个亲本细胞的基因组合在一起形成只含有一个细胞核的杂种细胞(hybrid cell ）。
细胞融合技术是研究细胞遗传、基因定位、细胞免疫、病毒和肿瘤的重要手段。
显微镜下的细胞融合过程融合过程中两个细胞膜的变化过程依据融合过程采用的助融剂的不同，细胞融合可分为：（1）病毒诱导的细胞融合，如：仙台病毒（hemagglutinating virus of Japan，HVJ）；（2）化学因子诱导的细胞融合，如：聚乙二醇（polyethyleneglycol，PEG）；（3）电场诱导的细胞融合；（4）激光诱导的细胞融合。
PEG是乙二醇的多聚化合物，存在一系列不同分子质量的多聚体。
PEG可改变各类细胞的膜结构，使两细胞接触点处脂类分子发生疏散和重组，引起细胞融合。
该方法应用分子质量为400—6000的PEG溶液引起细胞的聚集和粘连，产生高频率的细胞融合。
融合的频率和活力与所用PEG的分子质量、浓度、作用时间、细胞的生理状态与密度等有关。
【方法与步骤】1. 鸡血细胞的获得：从家鸡的翼根静脉用注射器采血，注入试管后，迅速加入肝素（100U 肝素/ 5ml全血）混合，制成抗凝全血。
2. 鸡血细胞储备液的制备：在抗凝全血的试管中，加入4倍体积的0.85 %NaCl溶液，制成红细胞储备液，置于4℃冰箱内可供一周内使用。
3. 鸡血细胞悬液的制备：取鸡血细胞储备液1ml，加入4ml 0.85 %NaCl溶液，混匀后，1200rpm离心5min，弃去上清液，再加入5ml 0.85 %NaCl溶液按上述条件离心一次。
实验十 PEG法诱导鸡血细胞融合
（7）詹纳绿染液。
四、方法与步骤
（一）鸡血细胞的体外融合
1.鸡血细胞的获得 用肝素溶液润洗注射器，从家鸡的翼根静脉用注射器采血，
注入试管后，速加入肝素（100U肝素/5ml全血）混合，制 成抗凝全血。 2.鸡血细胞储备液的制备 在抗凝全血的试管中，加入4倍体积的0.85%NaCl溶液，制 成红细胞储备液，置于4℃冰箱内可供一周内使用。
• 影响原生质体融合的因素。 （1）首先是酶解条件： 渗透压稳定剂 Ca2+ 、Mg2+、蔗糖 可保持原生质体稳定利于再生；随着酶解时间的增加原生 质体的释放量增大；酶解浓度到达一定浓度后，原生质体 的再生率下降；再就是酶解温度。 （2）原生质体的脱壁是否完全会影响融合效果。有的原生质 体会很快再生细胞壁，因此在洗去酶液后，应立即进行融合 处理。 （3）原生质体的悬浮状况也会影响融合，如果两亲本原生质 体密度相差较大，就难以混和均匀，接触机会减少，这时应 用离心方法强迫它们密集
实验 十 PEG法诱导鸡血细胞融合
College of Life Science and Technology, XINJIANG Univercity
一、实验目的
了解聚乙二醇（PEG）诱导体外细胞融合 的基本原理。
通过PEG诱导鸡血细胞之间的融合实验， 初步掌握细胞融合的基本方法。
二、实验原理
荧光标记的细胞融合
三．实验仪器、材料和试剂
仪器、用具：注射器、刻度离心管、离心 机、血细胞记数板、水浴锅、滴管、显微 镜、烧杯、容量瓶、凹面载玻片、盖玻片、 酒精灯等。
材料：成年家鸡。
■ 试剂
（1）0.85%NaCl溶液:
PEG诱导鸡血细胞融合实验方法比较
PEG诱导鸡血细胞融合实验方法比较PEG（聚乙二醇）介导的鸡血细胞融合实验是一种常用的细胞学实验方法，用于研究细胞融合、基因转移、病毒感染等现象。
在这个实验中，PEG起到促进融合的作用。
本文将对常用的PEG诱导鸡血细胞融合实验方法进行比较。
1.直接混合法：直接混合法是最简单直接的方法，将两种不同细胞类型的细胞直接混合，加入PEG处理后，通过细胞的融合产生融合细胞。
实验步骤：a.将两种不同类型的鸡血细胞分别培养至对数生长期。
b.将细胞收集、洗涤后，按照一定比例混合在一起。
c.在混合细胞悬液中加入PEG，进行处理。
d.处理后的细胞悬液进行培养。
优点：简单快捷，操作方便。
缺点：融合效率低，融合细胞的纯度较低，难以鉴定融合细胞。
2.等渗处理法：等渗处理法使用PEG使两个细胞类型的渗透压基本相等，减小由于渗透压差带来的融合细胞死亡的可能性。
实验步骤类似于直接混合法，不同之处在于在混合前要将细胞分别处理加入等量的PEG。
优点：可以减少融合细胞死亡的可能性。
缺点：融合效率仍然较低，难以确保融合细胞的纯度。
3.高瓶底法：高瓶底法是一种间接融合法，将两种细胞性的细胞分别培养到八倍增生指数时接种于两个高菌瓶内，将角质层去除，用高菌瓶口与高速离心的纺棉花轻摩转盘瓶底，离心至指定g数。
因离心后双方菌瓶接触，菌体外膜断裂，细胞在瓶壁内微小空间聚集，有利于融合。
实验步骤：a.将两种不同类型的鸡血细胞分别培养至八倍增生指数。
b.将细胞收集后接种于两个高菌瓶内。
c.去除角质层，将高菌瓶口与高速离心的纺毛轻摩转盘瓶底。
d.将菌瓶离心至指定g数。
优点：融合效率较高，融合细胞纯度较高。
缺点：操作复杂，需要使用专用设备。
4.电熔法：电熔法是利用电场将两种细胞融合的方法。
通过电熔法可以达到融合效率较高的效果。
实验步骤：a.将两种不同类型的鸡血细胞分别培养至对数生长期。
b.将细胞收集后接种于电熔腔中。
c.设置一定的电场参数，通过电场产生的作用使细胞融合。
实验一：鸡血细胞融合
实验一：鸡血细胞融合一、实验目的1、熟悉细胞融合的理论；2、掌握PEG诱导的细胞融合方法。
二、实验原理1、细胞融合原理两个以上的细胞合并成为一个双核或多核细胞称为融合细胞。
在通常情况下，两个细胞接触并不发生融合现象，因为各自存在完整的细胞膜，在特殊融合诱导物的作用下，两个细胞膜发生一定的变化，就可促进两个或多个细胞聚集，相接触的细胞膜之间融合，继之细胞质融合，形成一个大的融合细胞。
利用PEG介导的动物细胞融合，其实验原理到目前为止还没有完全定论。
学者们一般认为，PEG改变各类细胞的膜结构，使两细胞相互接触部位的膜脂双层中磷脂分子发生疏散、进而使其结构发生重排，再加上膜脂双层的相互亲合以及彼此间表面张力的作用，引起相临的重排质膜在修复时相互合并在一起,使两细胞的胞质沟通,从而造成相互接触的细胞之间发生融合。
细胞与组织不同，不排斥异类、异种细胞。
不仅能产生同种细胞融合、种间细胞融合，而且也能诱导动植物细胞间产生融合。
细胞融合(Cell fusion)，即在自然条件下或用人工方法(生物的、物理的、化学的)使两个或两个以上的细胞合并形成一个细胞的过程。
人工诱导的细胞融合不仅能产生同种细胞融合，也能产生种间细胞的融合。
2、细胞融合方法诱导细胞融合的主要方法有：病毒诱导融合，化学融合剂诱导融合和电融合。
1. 病毒诱导融合：有许多种类的病毒能介导细胞融合，最常用的是灭活的仙台病毒（HVJ），为RNA病毒。
病毒诱导细胞融合的过程有：首先是细胞表面吸附许多病毒粒子，接着细胞发生凝集，几分钟至几十分钟后，病毒粒子从细胞表面消失，而就在这个部位邻接的细胞的细胞膜融合，胞浆相互交流，最后形成融合细胞。
2. 化学融合剂诱导融合：化学融合剂主要有高级脂肪酸衍生物、脂质体、钙离子、水溶性高分子化合物、水溶性蛋白质和多肽，其中最常用的是聚已二醇（PEG）。
PEG用于细胞融合至少有两方面的作用：①可促使细胞凝结；②破坏互相接触处的细胞膜的磷脂双分子层，从而使相互接触的细胞膜之间发生融合，进而细胞质沟通，形成一个打的双核或多核融合细胞。
动物细胞融合实验实验报告
动物细胞融合实验实验报告
实验目的：1、了解动物细胞融合的常用方法
2、学习化学融合的基本操作过过程
3、观察动物细胞融合过程中的细胞行为和变化
实验材料：鸡血红细胞、50%PEG溶液、0.85%氯化钠溶液、显微镜、离心机、载玻片、盖玻片等
实验原理：聚乙二醇（PEG）能够改变细胞膜脂质分子的排列，在去除这些物质之后，细胞膜趋向于恢复原有的有序结构。
在恢复过程中相接触的细胞由于接口处脂质双分
子层的互相亲和与表面张力，细胞膜融合，胞质流通，发生融合。
实验步骤：1、取鸡血，离心后去除上清液，以0.85%氯化钠溶液制成5%~10%的悬液
2、加入GKN液4ml，混匀
3、加入14滴PEG液，静置3~5min后混匀，放于显微镜下观察
实验结果：显微镜下可观察到有些细胞发生质膜融合
分析与讨论：细胞融合的应用有微生物原生质体融合构成新菌株、利用原生质体融合和培养技术培育新植物、细胞杂交瘤技术与单克隆抗体、用于基因定位和绘制人类基因
图谱、用于生产树突状细胞抗肿瘤疫苗、用于动物育种、用于细胞疗法等。
鸡血细胞体外融合的影响因素研究
１ ． ２ ． ５ 鸡 血细胞 悬液 的 配制【 ‘ ３ Ｉ
红， ＧＫＮ 液． 血 细胞 计 数 板 ， 刻度离心管 ， 离心机 ， 水 浴锅 ， 盖 玻片 ， 容量 瓶 ， 载玻片， 移 液管 等．
１ ． ２ 实 验 方 法
１ ． ２ ． １ ０ ． ８ ５ Ｎａ Ｃ１ 溶 液 的 配 制
１ ． ２ ． ３ Ｈａ ｎ ｋ ｓ液 的 配 制 。 。 。
原 液 Ａ： 称取 Ｎ ａ Ｃ １ １ ６ ． ０ ｇ 、 Ｋ Ｃ １ ８ ． ０ ｇ 、 Ｍｇ Ｓ Ｏ ４・ ７ Ｈ２ ０ ２ ． ０ ｇ 、 Ｍｇ Ｃ １ ２・６ Ｈ２ Ｏ ２ ． ０ ｇ 、 Ｃ ａ Ｃ １ ２ （ 无水 ）
称取 Ｎ ａ Ｃ １ ８ ． ０ ｇ 、 葡 萄糖 ２ ． ０ ｇ 、 Ｎａ ２ ＨＰ Ｏ ・
收 稿 日期 ： ２ ０ １ ４～０ ５—１ ７ ； 修 回 日期 ： ２ ０ １ ４—０ ６—２ ０
（ ２ ） 向 抗 凝 全 血 的 试 管 中加 入 ４倍 体 积 的
４ ． ０℃ ：
原液 Ｂ ： 葡 萄糖 ２ ０ ． ０ ｇ 、 Ｎａ ＨＰ Ｏ ・１ ２ Ｈ２ Ｏ
０ ． ０ ６ ｇ 、 ＫＨ ２ Ｐ Ｏ １ ． ２ ｇ 、 双 蒸水 ８ ０ ０ ｍＬ， 用 滤 纸 过
学 内容ｌ 】 ］ ． 在实 际 操作 中 ， 该 方 法 易 受 许 多 因 素 的
１ 材 料 与 方 法
１ ． １ 实 验 材 料 及 仪 器
公鸡 全 血， Ｐ Ｅ Ｇ， Ｎａ Ｃ １ ， Ｈａ ｎ ｋ ｓ液 ， ０ ． ５ 酚
（ ３ ）向 ４个小 烧杯 中分 别加 入 预热 至 ５ Ｏ℃ 的
Ｇ ＫＮ 液 混 匀 ， 配制成 １ ０ ， ３ Ｏ ， ５ ０ ， ７ ０ 的
实验五 鸡血细胞融合
实验五鸡血细胞融合一、实验目的掌握细胞融合技术二、实验原理PEG是乙二醇的多聚化合物，PEG可与水分子以氢键结合，在高浓度（50％）的PEG溶液中自由水消失，导致细胞脱水而发生质膜结构的变化，引起细胞融合三、实验用品（1）器材：离心机显微镜水浴锅血球计数板离心管滴管注射器盖玻片载玻片（2）试剂：①Alsever溶液：葡萄糖2.05g 柠檬酸钠0.80g Nacl 0.42g 溶于100Ml,ddH2O中②0.85％生理盐水③GKN溶液：Nacl 8g Kcl 0.4g Na2HPO4·12H2O 3.75g NaH2PO4·2H2O0.78g 葡萄糖2g 酚红0.01g 溶于100ML ddH20中④苏木精和伊红（HE）染液⑤ 50％PEG溶液，，取一定量PEG（WM=4000）水域加热溶解后（50℃）与GKN（50℃）等体积混合⑥鸡血四、方法与步骤注射器吸2ML Alsever 溶液取鸡血2ML→加入离心管→加入6MLAlsever （1:4）→取1 ML鸡血悬浮液加4ML 0.85％Nacl→离心1500r／min 3 min 后弃去上清液反复三次→加GKN 4 ML离心弃去上清液→加GKN（1：9）制成10％悬液→利用血球计数板计数控制在3-4×107个／ML取1 ML于离心管→37℃水浴同时水浴温度恒温（3-4 min）→加入50％PEG液0.5 ML（慢慢沿离心管流下融合），边加边摇匀放入水浴锅中→20-30 min后加GKN至8 ML（沿器壁）静止水浴锅中20 min→1500r／min 3 min 离心，弃上清液加GKN溶液离心→弃上清液加适量混匀取少量于载玻片上进行HE染色（可在水浴锅上适当烤片）,进行观察。
五、作业1、计算融合率融合率=视野内发生融合的细胞核总数／视野内所有细胞核总数2、绘图显示能观察到的细胞融合（要注明是何倍数下的结果）附：HE染色 1、染色划片晾片 2、苏木精（蒸馏水冲洗）15-20 min 3、伊红3 min（蒸馏水冲洗）。
鸡细胞融合实验报告
一、实验目的1. 了解PEG诱导细胞融合的基本原理。
2. 通过细胞融合实验，初步掌握细胞融合技术。
3. 观察鸡细胞融合过程中的细胞行为与变化。
二、实验材料与用品1. 实验材料：鸡红细胞、Hanks液、PEG（聚乙二醇）。
2. 实验用品：生物显微镜、离心机、恒温水浴箱、试管、离心管、滴管、酒精灯、载玻片、盖玻片、生理盐水、剪刀、镊子等。
三、实验方法1. 准备鸡红细胞悬液：取新鲜鸡血，用生理盐水稀释至10%的悬液。
2. 制备PEG溶液：称取0.5克PEG（分子量4000）放入试管内，在酒精灯上融化，迅速加入0.5ml预热的Hanks液混匀，制成50%的PEG溶液。
放入37℃水浴中待用。
3. 处理鸡红细胞：取10%的鸡红细胞悬液1ml放入离心管中，加入5ml Hanks液混匀，以1000rpm离心5分钟，小心弃去上清，用指弹法将细胞团块弹散。
4. 诱导细胞融合：取上述50%的PEG溶液0.5ml，在1分钟内滴加到鸡红细胞悬液中，边加边轻轻摇动混匀。
待PEG全部加入后静置1分钟左右。
此过程均在37℃水浴中进行。
5. 终止PEG作用：缓慢滴加9ml Hanks液以终止PEG的作用，在37℃水浴中静置5分钟。
6. 离心弃上清：离心弃去上清，取一滴融合后的细胞悬液滴片，加盖片镜检。
四、实验结果与分析1. 镜检观察：在显微镜下观察，可见鸡红细胞融合后的细胞呈现球形，细胞膜较厚，细胞质较为均匀。
2. 实验结果分析：本实验成功诱导鸡红细胞融合，说明PEG诱导细胞融合技术在鸡细胞融合实验中具有可行性。
鸡红细胞融合后的细胞形态较为规则，细胞膜完整，细胞质均匀，说明细胞融合过程较为顺利。
五、讨论1. 鸡红细胞融合实验的成功，为细胞融合技术的研究提供了实验依据。
本实验采用PEG诱导细胞融合技术，具有操作简便、效果显著等优点。
2. 鸡红细胞融合实验过程中，PEG的浓度、处理时间等因素对细胞融合效果有较大影响。
实验中，PEG浓度为50%，处理时间为1分钟，能够获得较好的融合效果。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
鸡血细胞的体外融合
[实验目的]
1、了解聚乙二醇（PEG）诱导体外细胞融合的基本原理。
2、通过PEG诱导鸡血细胞之间的融合实验，初步掌握细胞融合的基本方法。
[实验原理]
细胞融合又称体细胞杂交，是指用人工方法使两个或两个以上的体细胞融合成异核体细胞，随后，异核体同步进入有丝分裂，核膜崩溃，来自两个亲本细胞的基因组合在一起形成只含有一个细胞核的杂种细胞。
依据融合过程采用的助融剂不同，细胞融合可分为：
●病毒诱导的细胞融合，如仙台病毒（HVJ）；
●化学因子诱导的细胞融合，如聚乙二醇（PEG）；
●电场诱导的细胞融合；
●激光诱导的细胞融合
PEG是乙二醇的多聚化合物，可改变各类细胞的膜结构，使两细胞接触点处脂类分子发生疏散和重组，诱导产生细胞融合。
商品PEG存在一系列不同分子质量的多聚体，一般应用PEG4000~6000的溶液，能够产生高频率的细胞融合。
[实验材料]
注射器、滴管、烧杯、容量瓶、凹面载玻片、盖玻片、离心机、水浴锅、显微镜、细胞计数板、酒精灯、刻度离心管、
Hanks液：Hanks原液 100mL
重蒸水 896mL
0.5%酚红 4mL
配好的Hanks液，分装包扎好贴上标签，经过灭菌后，4℃保存。
GKN液：50%（m/V）PEG溶液
取50g PEG4000放入100mL瓶中，高压灭菌20min
让PEG冷却到50~60℃，勿让其凝固
加入50mL预热至50 ℃的Hanks液，混匀，至37 ℃保温备用。
詹纳斯绿染液、0.85% NaCl溶液
[实验步骤]
1、鸡血细胞悬液的制备
在离心后的鸡血细胞沉淀中加入10ml的GKN溶液，将细胞悬浮。
取0.5ml
鸡血细胞悬液，加3.5ml GKN溶液。
镜检，在血细胞计数板上计数。
稀释至1X107个/ml，于37℃保温。
2、鸡血细胞的收集
吸取1ml鸡血细胞悬液放入离心管中，加入4mlHanks液混匀，1000rpm离心5min。
弃去上清液，用手指轻弹离心管底部，使沉淀的血细胞团块松散。
3、PEG诱导细胞融合
吸取0.5ml 37℃的50%PEG溶液，慢慢沿着离心管壁逐滴加入，边加边轻摇离心管，使PEG与细胞混匀，然后在37℃水浴中静置2min。
4、终止PEG作用
缓慢加入5mL Hanks缓冲液，轻轻吹打混匀，于37℃水浴中静置5min。
5、制备细胞悬液
用吸管轻轻吹打细胞团数次使细胞团分散，1000rpm离心5min，使细胞完全沉降。
弃去上清液，加Hanks液，再离心一次，弃多数上清，留少许溶液，混匀。
6、染色和镜检
吸取细胞悬液，在凹面载玻片上滴一滴，加入詹纳斯绿染液混匀，染色3min 后盖上盖玻片，在显微镜下观察细胞融合情况。
注意事项：温度、融合时间、PEG的浓度与作用时间、细胞密度、机械力等因素均影响融合率，实验操作时应予以注意，并在需要的时候及时镜检。
[实验结果]
1、细胞融合率是指在显微镜的视野内，已发生融合细胞的细胞核总数与该视野内所有细胞的细胞核总总数之比，通常以百分数表示。
融合率 = 视野内融合细胞的核数/视野内细胞的总核数×100％
2、测定时要进行多个视野计数，并进行统计分析。