藻蓝蛋白的抗癌活性研究

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藻蓝蛋白及其酶解产物的抗肿瘤效应研究

藻蓝蛋白及其酶解产物的抗肿瘤效应研究摘要：从海洋生物中寻找高效、低毒副作用的抗肿瘤药物是近年天然药物研究的新领域。

随着海洋生物药学研究的不断深入，发现许多海洋生物的活性物质源于其食物。

因此对于海洋生物食物链基层藻类的生物活性物质研究，更具有实际的意义。

藻蓝蛋白是存在于一些藻体中的光合色素蛋白，具有抗肿瘤、抗病毒、抗氧化等多种生物学功能，有重要的开发利用价值。

国内外关于藻蓝蛋白的抗肿瘤作用及其机制的研究已有报道，而酶解后的藻蓝蛋白多肽抗肿瘤效应研究国内外报道很少。

随着酶工程技术的发展和应用，利用蛋白酶水解藻蓝蛋白获取生物活性肽更具研究开发潜力，围绕藻蓝蛋白及其酶解产物的抗肿瘤活性及机制进行了综述。

关键词：藻蓝蛋白；酶解产物；抗肿瘤活性藻胆蛋白是大量出现于红藻、蓝绿藻和隐藻中的捕光色素蛋白，主要包括藻红蛋白 (R-PE)、藻蓝蛋白(C-PC) 和别藻蓝蛋白 (APC) 3 种。

藻胆蛋白在藻类细胞中的主要功能是作为光合作用捕光色素系统，把捕获的光能高效地传递给叶绿素，从而使海藻的光合作用得以发生[1]。

藻蓝蛋白 (Phycocyanin) 是从螺旋藻中提取的藻胆蛋白的一种，其氨基酸组成合理，其中必需氨基酸占氨基酸总量的37.42%。

大量的临床研究结果表明[2-9]，藻蓝蛋白具有抗肿瘤、抗辐射、抗疲劳、调节免疫力、清除自由基、促进细胞生长和保护神经等生理作用。

因此螺旋藻粉作为功能保健品十分受人欢迎。

当其被食用后，经过肠胃道的消化作用，形成一些多肽产物。

随着对酶解多肽的深入研究，发现其更具研究潜力。

1 藻蓝蛋白抗肿瘤活性研究进展1.1 藻蓝蛋白体外抗肿瘤实验研究提纯的藻蓝蛋白 (C-PC) 对体外培养的肿瘤细胞具有明显的抑制作用。

章申峰[2]报道较高浓度(>40 μmol/mL)的C-PC 可在体外显著抑制肺腺癌SPC-A1 细胞的生长，并具良好的时间剂量关系。

细胞核Hoechst 染色和DNA 片断化检测表明，诱导细胞凋亡是C-PC 杀伤肺腺癌SPC-Al 细胞的主要途径。

藻：藻类抗肿瘤活性物质的研究_徐年军

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《中国海洋药物》杂志 2000 年第 6期 (总第 78 期 )
Fig 4 Cry ptophycins
Cry ptoph ycins (图 4)是从念珠藻 ( Nostoc sp. st rain GSV 224)中提取的多肽 , 对小鼠异种移植的乳癌、卵巢癌、克隆癌、胰腺癌具有强的活性 , 其作用机理是通过引起微丝的解聚作用而阻碍细胞周期的 G2 / M 期。从念珠藻 ( Nostoc sp. )体内分离出 7个 Cryptophy cins, 其中 Crypto phcy cinl具有主要的细胞毒活性 , 它拥有一氯 L-O甲基酪氨酸单元。 Crypto phyci n 2 ～ 7 有较弱的活性。体内研究表明天然的 Crypto phyci ns1 和半合成的 Crypto phyci ns 8 对许多移植瘤包括多药物抗性 ( M ul tidrug Resista nce, MDR)细胞系具有活性 ,并且有较好的水溶性和治疗效果 , 而 M DR是影响肿瘤化疗效果的一个非常重要的因素 , 它预示 Crypt ophyci ns 很有可能成为临床药物 [10、 11 ]
1 [7 ] [ 5]
Fig 3 Ho r mothamnio ne A
Ho rmo thamni one A ( 图 3)是从海洋蓝藻 Chrysophaeum taylori 中提取的 , 它对 P388 淋巴白细胞和 HL-60 早幼粒白血病细胞都 1 有细胞毒作用 , 其 IC50分别是 4. 6 μ g· L 和 1 [ 9] 0. 1μ 从 Chrysophaeum taylori 还分 g· L 。离出一种新的细胞毒活性的 6-Desmet ho xyho rmot h-amni one。从一种金藻中也分离出了 Ho rmo thamni one A, 并具有同样的活性。

藻蓝蛋白及其酶解产物的抗肿瘤效应研究进展

藻蓝蛋白及其酶解产物的抗肿瘤效应研究进展邓伟;王雪青【摘要】从海洋生物中寻找高效、低毒副作用的抗肿瘤药物是近年天然药物研究的新领域.随着海洋生物药学研究的不断深入,发现许多海洋生物的活性物质源于其食物.因此对于海洋生物食物链基层藻类的生物活性物质研究,更具有实际的意义.藻蓝蛋白(C-phycocyanin, C-PC)是存在于一些藻体中的光合色素蛋白,具有抗肿瘤、抗病毒、抗氧化等多种生物学功能,有重要的开发利用价值.国内外关于藻蓝蛋白的抗肿瘤作用及其机制的研究已有报道,而酶解后的藻蓝蛋白多肽抗肿瘤效应研究国内外报道很少.随着酶工程技术的发展和应用,利用蛋白酶水解藻蓝蛋白获取生物活性肽更具研究开发潜力,围绕藻蓝蛋白及其酶解产物的抗肿瘤活性及机制进行了综述.【期刊名称】《海洋通报》【年(卷),期】2010(029)003【总页数】4页(P357-360)【关键词】藻蓝蛋白;酶解产物;抗肿瘤活性【作者】邓伟;王雪青【作者单位】天津市食品与生物技术重点实验室、天津商业大学生物技术与食品科学学院,天津300134;天津市食品与生物技术重点实验室、天津商业大学生物技术与食品科学学院,天津300134【正文语种】中文【中图分类】R282.77;R151.2藻胆蛋白是大量出现于红藻 (Rhodophyta)、蓝绿藻 (Cyanophyta) 和隐藻(Cryptophyta) 中的捕光色素蛋白，主要包括藻红蛋白 (R-PE)、藻蓝蛋白(C-PC)和别藻蓝蛋白 (APC) 3种。

藻胆蛋白在藻类细胞中的主要功能是作为光合作用捕光色素系统，把捕获的光能高效地传递给叶绿素，从而使海藻的光合作用得以发生[1]。

藻蓝蛋白 (Phycocyanin) 是从螺旋藻中提取的藻胆蛋白的一种，其氨基酸组成合理，其中必需氨基酸占氨基酸总量的37.42%。

大量的临床研究结果表明[2-9]，藻蓝蛋白具有抗肿瘤、抗辐射、抗疲劳、调节免疫力、清除自由基、促进细胞生长和保护神经等生理作用。

藻蓝蛋白抗肿瘤及其作用机制研究进展

藻蓝蛋白抗肿瘤及其作用机制研究进展
张晓平;李慧芬;黄润芸;田景振
【期刊名称】《医学研究杂志》
【年(卷),期】2013(042)009
【摘要】藻蓝蛋白（phycocyanin,PC）从藻类中提取,是来自真核藻类的一种捕光色素蛋白,捕光效能高,属于藻胆蛋白的一种,在螺旋藻中含量较高,主要由α和β两种亚基组成,天然状态下多以杂聚体形式存在.研究表明,藻蓝蛋白在抗肿瘤、抗氧化、提高机体免疫力等方面有着很高的活性,有极大开发成为药物的潜力[1,2].近年来在海洋生物中寻找高效、低毒、不良反应小的抗肿瘤药物已引起了国内外研究者的重视.现对藻蓝蛋白的抗肿瘤作用及其相关机制做一综述,为天然药物新领域研发和新药开发提供相关依据.
【总页数】4页(P26-28,41)
【作者】张晓平;李慧芬;黄润芸;田景振
【作者单位】250355 济南,山东中医药大学药学院;250355 济南,山东中医药大学药学院;250355 济南,山东中医药大学药学院;250355 济南,山东中医药大学药学院【正文语种】中文
【相关文献】
1.藻蓝蛋白生理活性及作用机制研究进展 [J], 赵艳景;胡虹;王颖
2.藻蓝蛋白及其酶解产物的抗肿瘤效应研究进展 [J], 邓伟;王雪青
3.黄芪多糖双向抗肿瘤作用机制的研究进展 [J], 石丽霞;李科;秦雪梅
4.水飞蓟素抗肿瘤作用机制研究进展 [J], 黄志豪;张建勇
5.藻蓝蛋白抗肿瘤活性及作用机制研究进展 [J], 韩敏敏;唐振洲;米顺利;陈显强;钟振国;谢金玲;高程海;张玲
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藻蓝蛋白及其酶解产物的抗肿瘤效应研究进展

ｎｔｒｌｍｅｉｉｅｒｓａｃｎｒｃｎｅｓＷｉｅｆｒｈｒｍａｉｅｐａｍａｅｔａｅｅｃ，ｅｐｅｆｕｄｔａ，ｎａｕａｄｃｎｅｅｒｈｉｅｅｔｙａ．ｔｔｕｔｅｒｎｈｒｃｕｉｌｓａｈｐｏｌｏｎｈｔｍａｙｒｈｈｃｒｒｓｅｉｃｐａｍａｏｏｉａｒｐｒｉｓｉｒｎｒａｉｓａｅｏｉｉａｅｏｔｅｒｆｏ．ｈｒｆｒｅｓｕｙｏｌａ，ｐｃｆｈｒｃｌｇｃｌｏｅｔｎｍａｉｅｏｇｎｓ，ｒｇｎｔｄｆｍｉｏｄＴｅｅｏｅｔｔｄｎａｇｅｉｐｅｍｒｒｈｈｗｈｃｅｏｇｏｔｅｂｓｆｆｏｈｉｆｍａｎｒａｉｍｓｗｉｅｍｏｅｐａｔａｉｎｆａｃ．ｈｃｃａｉｓａｉｈｂｌｎｓｔｈａｅｏｄｃａｎｏｒｅｏｇｓ，ｌｂｒｒｃｉｌｓｇｉｃｎｅＰｙｏｙｎｎｉｏｉｎｌｃｉｌｈ－ａｖｓｉｇｃｌｒｐｙｌｒｔｉｘｒｃｅｒｍｏｌａｈｔａｒａａｕｆｅｅｏｍｅｔｎｔｉａｉｎＩｉｔｒｅｔｈｏｏｈｌｐｏｅｎｅｔｔｄｆｏｓｍｅａｇｅｔａｓａｇｅｔｌｅｏｖｌｐｎｄｕｉｚｔ．ｔｇｈｎａｈｖｄａｌｏｈｓｍａｙｂｏｏｉａｎｔｏｓｕｈａｎｉｍｏｆｅｔａｔｉａｃｉｉ，ｎｔｘｄｔｎｅｃＴｅｓｄｅｎｔｅａｎｉｌｇｃｌｕｆｃｉｎ，ｓｃｓａｔｔ — ｕｒｅｆｃ，ｉｒｌｔｔａｄａｉｉａｉ，ｔ．ｈｔｉｓｏｎｖａｖｙｎｏｏｕｈ

宾美生物——螺旋藻C_藻蓝蛋白亚基分离及抗肿瘤活性研究_张昕

第37卷第3期2010年5月浙江大学学报(理学版)Journal of Zhejiang University(Science Edition)http://ww /sciVol.37No.3M ay2010收稿日期:2009-04-02.基金项目:浙江省重大科技专项重点项目(2006C12084).作者简介:张昕(1985-),女,硕士,主要从事生物化学与分子生物学研究. *通信作者,E-mail:gongxg@.DOI:10.3785/j.issn.1008-9497.2010.03.016螺旋藻C-藻蓝蛋白亚基分离及抗肿瘤活性研究张昕,郦剑勇,龚兴国*(浙江大学生命科学学院,生物化学研究所,浙江杭州310058)摘要:为解决C-藻蓝蛋白分子较大,难以直接与细胞发生作用的问题,对藻蓝蛋白亚基的分离纯化方法进行研究,并初步探讨了其对肿瘤细胞的抑制作用.对通过热变性、盐析和自制的羟基磷灰石吸附层析,从钝顶螺旋藻中获得高纯度的藻蓝蛋白(C-PC,A620/A280>4.5).C-PC用8mol#L-1的尿素溶液变性,过CM-Sephar ose F.F.阳离子交换层析、透析、复性,获得具活性的C-P C亚基.用CCK-8试剂盒分别研究了C-P C、A和B亚基对一个肺腺癌细胞株SPC-A-1的生长的影响,结果表明藻蓝蛋白及其亚基对该细胞株的生长具有抑制作用,B亚基效果最好,预示着它们具有一定的抗肿瘤潜力.关键词:柱层析;复性;亚基;肺腺癌细胞株SPC-A-1;生长抑制作用中图分类号:Q51文献标志码:A文章编号:1008-9497(2010)03-319-05ZHA N G X in,LI Jian-yong,GO NG X ing-g uo*(I ns titute of Biochemistr y,College of lif e Sciences,Zhej iang Uni-vers ity,H angz hou310058,China)Isolation of C-PC subunits from spirulina platensis and inhibitory effect on SPC-A-1cell line.Journal o f Zhejiang U niversit y(Science Edit ion),2010,37(3):319-323Abstract:In order to solve the difficult y of interactio n betw een C-phycocyanin(C-PC)and cells,the metho ds o f isolating and purif ying C-PC subunits w ere investig ated and the ant-i t umo r effects of them o n the SPC-A1cells wer e studied also.A hig h efficiency and relat ively convenient pur ificatio n sy stem w ith tw o-step self-composed H A chr omatog ram w as dev ised in the research,and obtained pure C-PC with OD620/OD280of4.5.A fter denatur ing the purified C-P C by so dium acetate buffer containing8mol#L-1urea,the subunits w ere isolated by cat ion ex chang e chr omatog ra phy by using CM-sephar ose F.F,t hen the subunits wer e r enatured separately.Both o f the t wo subunits had stro ng fluo rescence activ ity.T he ant-i tumor effect of highly purified C-PC、A and B subunit was t ested o n gr ow th and multiplication of human lung adenocar cino ma cell line(SPC-A-1).T he results indicated t hat the B subunit o f C-P C w as the po tentest ant-i cancer frag ment under the same concentr atio n conditio n in v itr o.Key Words:chr omato gr aphy;renature;act ivity;inhibitor y effect;subunits藻蓝蛋白是蓝藻、红藻等藻类的主要集光分子,传光效率极高[1].大量研究表明,藻蓝蛋白具有抗氧化[2]、清除自由基[3]、抗炎症、抗肿瘤[4]等作用,能有效预防和治疗多种疾病.藻蓝蛋白已广泛应用于食品、化妆品、医药等领域.根据其来源不同,可将藻蓝蛋白分为C-藻蓝蛋白(C-PC)和R-藻蓝蛋白(R-PC).近年来,国外有大量文献报道了藻蓝蛋白的抗肿瘤活性,以及藻蓝蛋白诱发细胞调亡的原理[5],引起了国内外广泛的兴趣.但是,对藻蓝蛋白亚基的分离少见报道.本文运用热变性的方法,从钝顶螺旋藻中分离出C-藻蓝蛋白,研究获得组成其的两个亚基A和B,并考察藻蓝蛋白亚基对肺腺癌细胞的生长抑制作用,以期为藻蓝蛋白亚基的研究开发提供依据.1材料材料:钝顶螺旋藻(S p irulina p latensis)购自江苏溧阳;人源肺腺癌SPC-A1细胞株,购自中科院细胞所.试剂:CCK-8试剂盒(Cell Counting Kit-8),日本同仁化学研究所;RPM I-1640液体培养基,吉诺生物有限公司;胰酶-EDTA,吉诺生物有限公司;超级新生牛血清,杭州四季青生物公司.仪器:Bio40紫外/可见分光光度计,美国Per-kin Elmer公司,850型荧光分光光度仪,日本H ita-chi公司,微型蛋白质电泳系统,美国Bio-Rad公司.2实验方法2.1藻蓝蛋白的分离纯化取螺旋藻藻泥100g左右,加入pH6.8的磷酸缓冲液,4e保存过夜.待其完全融解后,超声破碎.温水浴热变性后,30%~65%硫酸铵盐析,离心去上清.沉淀用PBS溶解,透析脱盐后,羟基磷灰石柱层析,使用文献报道的自制羟基磷灰石[6-7].得到1g 左右的藻蓝蛋白(A620/A280> 4.0),再次羟基磷灰石层析,藻蓝蛋白纯度进一步提高,得到A620/A280> 4.5的高纯度藻蓝蛋白,G25脱盐,冻干粉保存.2.2藻蓝蛋白亚基的分离取新鲜制备的藻蓝蛋白(A620/A280>4.5)溶液用硫酸铵盐析,4e静置过夜,冷冻离心,弃上清.沉淀溶于醋酸缓冲液中,避光低温保存1d.第2天可见藻蓝蛋白颜色由亮蓝色变为绿色.溶液用含8mol#L-1脲的醋酸缓冲液透析,直至无硫酸铵.CM-Sepharose F.F.离子交换层析,层析柱用含8M脲的醋酸缓冲液预平衡,离子强度梯度洗脱,洗脱液为0~0.2mo l#L-1N aCl的醋酸缓冲液[8-10].分别收集两个蛋白峰,采用透析复性的方法对两者复性.B亚基较易复性,直接置于2M脲的醋酸缓冲液中透析复性.A亚基复性较难,在连续脲梯度的醋酸缓冲液中进行复性,控制适当的浓度变化率,获得较好的复性效果.复性效果可以通过紫外和荧光光谱观测.2.3藻蓝蛋白及其亚基对肺腺癌细胞SPC-A-1生长的影响2.3.1肺腺癌SPC-A-1细胞的培养用含有10%的热灭活新生牛血清的RPM I-1640培养基,37e、饱和湿度、5%CO2的培养箱中培养至对数生长期后用于实验.2.3.2细胞毒性分析用日本同仁化学研究所的CCK-8试剂盒检测[12].取长至7~8成满的细胞消化离心,制成悬液,每孔80L L接种于96孔板,使每孔约3000~ 4000个细胞.培养24h后,加入不同浓度的20L L 的C-PC、A亚基和B亚基以获得所需的终浓度梯度,蛋白质浓度用Folin-酚法确定,每个浓度设5个复孔,并设不加药物的阴性对照和不加细胞的空白对照.分别以不同的时间梯度进行培养后,加入10L L CCK-8试剂,置饱和湿度培养箱培养2h后,用酶标仪在450nm下测吸光值.按以下公式计算抑制率:细胞抑制率=(阴性对照组-实验组)/(阴性对照-空白对照).用S统计对数据进行分析[10].3结果3.1藻蓝蛋白亚基的分离结果离子交换层析结果可见两个明显的蛋白收集峰,如图1所示.经SDS聚丙烯酰胺电泳确定,其中先出峰的是B亚基,后出峰的为A亚基,分离达到电泳单一条带.图1C-PC亚基的层析图谱Fig.1Column chro mat og raphy of C-PC subunits流速:0.5mL#min-1,洗脱梯度:0~0.2m ol#L-1NaCl的醋酸缓冲液,各150mL连续梯度洗脱3.2藻蓝蛋白及其亚基的紫外可见光谱分析变性状态下藻蓝蛋白及其亚基三者的紫外可见光谱很相似(见图2).复性后三者的区别较明显(见图3),可见区藻蓝蛋白的最大吸收峰为620nm,而且在600nm处还有一个明显的肩峰;A亚基最大吸收峰为624nm;B亚基最大吸收峰为610nm.由图证明亚基的复性已经比较成功.320浙江大学学报(理学版)第37卷图2 变性状态的藻蓝蛋白与变性状态的B 亚基、A 亚基Fig.2 UV -V is spectral scan of denatured C -PC and B ,A subunits图3 藻蓝蛋白、B 亚基和A 亚基的紫外可见光谱Fig.3 U V -V is spectra l scan o f C -P C and B ,A subunits3.3 荧光光谱图A 亚基的最大激发波长为610nm,最大发射峰642nm(见图4(a)),另外280nm 的光也能够激发A亚基的荧光,最大发射峰依然为642nm.B 亚基最大激发波长为623nm ,最大激发峰650nm (见图4(b)).藻蓝蛋白的荧光最大发射峰为648nm.图4 亚基荧光发射光谱A 亚基(610nm 激发,图4(a))、B 亚基(623nm 激发,图4(b))F ig.4 F luor escence emission spectrum of A subunit(610nm)and B subunit (623nm)3.4 SDS -聚丙烯酰胺凝胶电泳参照5分子克隆实验指南6配制15%的分离胶,采用10V #cm -1的电压跑电泳,考马斯亮蓝染色,电泳结果显示(见图5)两个亚基分离成功,在SDS -聚丙烯酰胺凝胶电泳显示为一条带[10].图5 亚基的电泳图片Fig.5 Electr opho resis pattern of subunits1:C -PC,2、3:A 亚基,4:B亚基图6 C -P C 、A 亚基与B 亚基对SP C -A -1细胞生长的影响F ig.6 Effects of C -PC,A subunit and B subuniton gr ow th of SPC -A -1cells3.5 C -PC 及其亚基对SPC -A1细胞生长的影响C -PC 对该细胞的生长有抑制作用,并有良好的时间和剂量关系(见图6(a)).较高浓度的C -PC 有显著的抑制作用,40L mo l #L -1的C -PC 处理细胞24h 后,细胞存活率降至67.75%;60L mo l #L-1的C -PC 处理细胞24h 后,细胞存活率仅为34.10%.321第3期张昕,等:螺旋藻C -藻蓝蛋白亚基分离及抗肿瘤活性研究但是,较低浓度的C-PC对SPC-A-1细胞的杀伤效果则明显较弱,10L mol#L-1的C-PC处理该细胞48h 后,细胞存活率为81.50%;而5L mol#L-1的C-PC 处理该细胞48h后,细胞存活率仍高达90.11%.A亚基对SPC-A-1细胞的生长有一定的抑制作用,20L m ol#L-1的A亚基处理该细胞48h后存活率与对照细胞相比降为75.32%,总体效果与相同摩尔浓度的C-PC杀伤效果相当(见图6(b)),B亚基对SPC-A-1细胞生长的影响,与相同摩尔浓度的C-PC和A亚基相比(见表1),B亚基对该细胞具有更显著的杀伤效果,具有良好的剂量和时间关系.10L mol#L-1浓度的B亚基处理该细胞24h后存活率降为45.30%,20L m ol#L-1的B亚基处理该细胞48h后,细胞存活率仅为13.69%,提示B亚基作为抗肿瘤药物的良好潜力(见图6 (c)).表1相同摩尔浓度下B亚基分别与C-PC、A亚基对SPC-A-1细胞抑制作用比较(x?s) T able1Co mpar ison of the ant-i tumor ef fects of B subunit,C-PC and A subunit on the SPC-A-1cellsin the same concentr atio n(x?s)样品浓度(L mol#L-1)151020 C-PC组/%24h95.48?0.5*92.46?0.7*73.54?0.8*48h90.11?0.6*81.50?0.8*68.44?0.6* A亚基组/%24h92.11?0.7*85.45?0.8*82.78?0.5**78.64?0.6**48h88.86?0.5*86.47?0.5**80.09?0.6**75.32?0.8* B亚基组/%24h81.50?0.8**66.19?0.6**45.30?0.7**36.77?0.7**48h75.69?0.9**40.31?0.5**29.88?0.5**13.69?0.5**注t检验,*P<0.05,**P<0.01(vs control)4结论藻蓝蛋白是一种普遍存在于蓝藻中,含开链四吡咯结构的天然色素蛋白.藻蓝蛋白亚基与藻蓝蛋白性质相近,但是亚基分子量小,更容易直达病灶,与细胞发生作用.本文第1次在藻蓝蛋白的分离中运用热变性的方法,简化了藻蓝蛋白的提取方法,降低了生产成本.通过脲变性、CM-Sepharose F.F.阳离子交换层析与透析复性得到电泳单一条带的亚基.得到的亚基保持了藻蓝蛋白原有的光谱学性质和荧光性质,三者可见区吸收峰在620nm附近,荧光最大发射峰很接近,都在640nm和650nm之间.这证明了此方法分离C-PC亚基行之有效.变性状态下藻蓝蛋白及其亚基三者的紫外可见光谱很相似,可以说基本没有什么大的区别,这是由于在变性条件蛋白质处于舒展状态,发色团周围氨基酸对发色团的影响不大即发色团所处的环境为溶液环境,所以三者的光谱学性质接近.复性后三者的区别较明显,说明亚基的复性比较成功,发色团的发色受到了周围氨基酸环境的影响.藻蓝蛋白对肿瘤细胞具有直接杀伤作用,国内外已有文献报道.李冰等[11]认为,藻蓝蛋白具有抗肿瘤效应,其机理可能是藻蓝蛋白作为一种有丝分裂原,可与肿瘤细胞表面的有丝分裂受体结合,通过受体的交联和蛋白激酶活化从而促进细胞内CD59基因的转录表达,诱导死亡结构域的活化,从而抑制肿瘤细胞的增殖,促进肿瘤细胞的凋亡.亚基的分子量小,更容易与细胞表面受体结合,与细胞发生作用,因此亚基具有更好的抗癌效果,特别表现在B亚基.5L mol#L-1B亚基浓度作用48h后的抑制率已经达到59.69%,具有很好的抗肿瘤潜力.这为藻蓝蛋白抗肿瘤药物的开发研究奠定了基础.由于提取工艺比较复杂,特别是工艺中包含了蛋白质的变性复性,导致亚基的质量不是很稳定,限制了进一步研究和实际应用.此外,A亚基对该细胞株的生长抑制与藻蓝蛋白差不多,这意味着三者与细胞的作用效果除受分子大小的影响还受其它因素的影响,需要进行进一步的研究和探讨.参考文献(References):[1]GL A ZER A N.Phy co bilipr oteins-a 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螺旋藻C-藻蓝蛋白亚基分离及抗肿瘤活性研究

获得高纯度的藻蓝蛋白（ — Ｃ，／＞４５． — Ｃ用８ｍｏ。ＣＰＡＡ。．）ＣＰ卜Ｉ的尿素溶液变性，ＣＳｐａｏｅＦＦ阳离＿过Ｍ— ｅｈｒｓ．．
子交换层析、析、透复性，得具活性的Ｃ～获ＰＣ亚基．Ｃ用ＣＫ一８试剂盒分别研究了ＣＰｄ和Ｂ亚基对一个肺腺癌细 — Ｃ、
（江大学生命科学学院，物化学研究所，江杭州３０５）浙生浙１０８
摘要：解决Ｃ藻蓝蛋白分子较大，以直接与细胞发生作用的问题，藻蓝蛋白亚基的分离纯化方法进行研为难对究，初步探讨了其对肿瘤细胞的抑制作用．通过热变性、析和自制的羟基磷灰石吸附层析，钝顶螺旋藻中并对盐从
中图分类号：５Ｑｌ
ＺＨＡＮＧＸｉｄｉｎｙｎｎ，ＩＪａ — ｏｇ，ＧＯＮＧｎ — ｕ（ｎｔｔｔｆＢｉｃｅｉｔｙ，ｌｅｅｏ ’ｉｅＳｃｅｃｓｈｊａｇＵｎ — ＸｉｇｇｏＩｓｉｅｏｈｍｓｒＣｏｌｇＪｌｆｉｎｅ，Ｚｅｉｎｉｕｏ
ｖｒｉｙ，Ｈａｎｅｓｔｇｚｈ００５ｏｕ３１８，Ｃｈｉｎａ）
ＩｏａｉｎｏＰｓｂｎ￣ｆｏｓｉｕｉａｐａｅｓｓａｄｉｈｂｔｒｆｅｔｏＰ。１ｅｌｌｅＪｕｎｌｏｈｅｉｎｓｌｔｆＣ— ＣｕｕｉｒｍｐｒｌｌｔｎｉｎｎｉｉｏｙｅｆｃｎＳＣＡ‘ ｃｌｉ．ｏｒａｆＺｊｇｏｎｎａ

螺旋藻藻蓝蛋白的稳定性及抗癌活性研究

螺旋藻藻蓝蛋白的稳定性及抗癌活性研究
陈新美;王晓华
【期刊名称】《氨基酸和生物资源》
【年(卷),期】2006(28)1
【摘要】螺旋藻藻蓝蛋白提取物在pH4．0～8．5、40℃以下和弱光环境中表现稳定，并通过MTT比色法测定其对肝癌细胞SMMC-7721和喉癌细胞HEp-2的生长抑制作用，研究了其抗癌活性。

【总页数】4页(P59-62)
【关键词】螺旋藻;藻蓝蛋白(PC);抗癌活性
【作者】陈新美;王晓华
【作者单位】广州医学院生化教研室
【正文语种】中文
【中图分类】Q949.22;Q319.2
【相关文献】
1.螺旋藻藻蓝蛋白在水和磷酸缓冲液中稳定性的对比研究 [J], 李潇飒;江秀强;邹宁;孙东红
2.钝顶螺旋藻藻蓝蛋白储存稳定性研究 [J], 徐润;陈野;孙平
3.钝顶螺旋藻藻蓝蛋白稳定性研究 [J], 欧瑜;叶瑞玲
4.螺旋藻藻蓝蛋白在碳酸饮料中的稳定性研究 [J], 张少斌;梁玉金;郭俊美;汪澈
5.螺旋藻藻蓝蛋白稳定性的实验研究 [J], 吕平平;李传茂;杨登亮;林盛杰;刘德海
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藻蓝蛋白的抗癌活性研究*摘要:活细胞脱氢酶催化四唑盐(MTT)还原,生成溶于有机溶剂的蓝色甲月赞结晶,可定量反映细胞生长.流式细胞技术可根据细胞中DNA 的质量分数来检测其所处的细胞周期.采用上述两种方法,研究了藻蓝蛋白(PC)对HeLa细胞的抗癌活性.实验证明,PC对HeLa细胞生长有明显的抑制作用,当PC浓度为80 mg/L时对癌细胞的抑制率达31.0%.初步认为这种抑制机理为:PC使HeLa细胞由合成期(S)或分裂期(M)向G1期转变和积集,细胞DNA合成衰减.关键词:螺旋藻;藻蓝蛋白;四唑盐;流式细胞技术;人子宫颈癌细胞(HeLa细胞)中图分类号:Q17文献标识码:A文章编号:1008-973X(2001)06-0672-04螺旋藻(spirulina)的蛋白质高达50%～70%,其中,藻蓝蛋白(PC)占总蛋白的7%左右.PC具有特征性的吸收光谱和荧光光谱是一种新颖的荧光分子探针[1,2].随着生物学、医学、海洋药物学等学科的发展,PC 的生物活性已成为人们关注的热点.饭岛登等(1982)发现PC可提高淋巴细胞活性,增强机体抵抗力,继而在1983年发现PC能维持和促进正常受控细胞的功能,防止肿瘤的生长和复发.抗肿瘤药物的体外筛选,通常有染料排除法,软琼脂克隆法和[3H]胸腺嘧啶掺入法等[3].但这些方法准确度较差,重复性低、操作复杂,实验周期长.本文采用MTT法[4]和流式细胞技术对PC的抗癌活性进行了研究.1 材料与方法1.1 实验材料HeLa细胞株(人子宫颈癌细胞),由浙江省肿瘤医院提供. PC由浙江大学生物科学与技术系细胞实验室纯化制备.1.2 主要试剂RPMI1640培养基(Gifco Co),胎牛血清(杭州四季青生物工程公司),胰蛋白酶trypsin (Difco进口分装),MTT (Sigma Co),二甲基亚砜DMSO(Merck Co),Triton x-100(Sigma进口分装),RNase A(Sigma),PI 染料(Sigma)等.1.3 溶液配制PBS液:每升溶液含NaCl 8.00 g、kCl 0.020 g、Na2HPO4·H2O 1.56 g、KH2PO40.3 g, 15磅灭菌15 min.Hanks液:每升溶液含NaCl 18.40 g、kCl 0.40 g、CaCl20.14 g、MgSO4·7H2O 0.2 g、Na2HPO4·H2O 0.06 g、KH2PO40.06 g, NaHCO30.35 g,葡萄糖1.00 g,酚红0.02 g,8磅灭菌20 min.D-Hanks液:每升溶液含NaCl 8.00 g、kCl 0.40 gNa2HPO4·H2O 0.06 g、NaHCO30.35 g、酚红0.02 g,8磅灭菌20min.Trypsin-EDTA液:Trypsin (Difco 1:250) 0.5 g、EDTA 0.2 g,1 000 mL D-Hanks液,用NaOH调pH至7.5,超滤除菌.MTT液:用PBS深解成5 g/L,超滤除菌,4℃避免保存.1.4 主要仪器CO2自动细胞培养箱(VWR Model 1720, Forma Co. USA),酶标仪(EIA-11,上海四达生物技术研究所),流式细胞仪(Becton Dickinson Co. USA),细胞培养瓶(25 mL), 96孔板,24孔板(华美公司).1.5 HeLa细胞的培养无菌条件下,将HeLa细胞放于RPMI1640+20%胎牛血清的培养基中,置于37℃,5%的CO2中培养,细胞形成单层后进行传代培养.1.6 MTT法检没PC对HeLa细胞生长的抑制作用用Trysin-FDTA消化单层HeLa细胞,离心除去上清液,加培养液配成细胞悬液,并以1.0×105细胞孔接入96孔板.共设5组,每组8孔,每孔100LL.培养24 h后,更换新鲜培养液.其中4组为实验组,每组每孔分别加入100LL质量浓度为20、40、80、160 mg/L的PC液,使PC最终作用质量浓度分别为10、20、40、80 mg/L.另一组为空白对照组,每孔加100LL PBS.于37℃培养72h后,加入MTT液,20LL/孔,37℃温育4 h,弃培养液,加入DMSO或无水乙醇( 100LL/孔),轻微振荡使甲月赞结晶充分溶解,用酶标仪在490 nm测定OD值,按下列公式计算抑制率:抑制率=1-实验组OD-对照组OD-×100%.以细胞浓度1.0×104、1.5×104、2.0×104、2.5×104、3.0×104个/孔,分别接入96孔板,每组8孔培养24 h后,每孔加20LL MTT,用MTT法测各级490 nm OD值,并与细胞密度对应坐标图得出线性归迹.1.7 流式细胞技术检测PC对HeLa细胞的抗癌活性方法试验设4个组、每组3瓶,每瓶接入2 mL(2×105cells/mL)的细胞悬液,置于37℃,5%CO2培养24 h后,试验组(Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ)分别加入1 g 的PC液100、200、300LL,其中,Ⅰ、Ⅱ分别再补加200、100LL PBS.空白组每瓶加300LL PBS.轻微振荡后,继续培养72 h.用Trysin-EDTA 消化各组,合并,3 000×10-6r/min离心10 min,弃上清液,用PBS离心洗涤细胞两次,70%乙醇固定.然后再用PBS离心洗涤两次,细胞沉淀加入1 mL 1% Triton x-100(25℃,10 min), 3 000×10-6r/min离心5 min弃上清,PBS洗涤两次,加入1 g/L RNaseA l mL (37℃, 10 min);然后室温下用PI染色处理.振荡成均匀悬液,上机检测.2 实验结果与讨论2.1 PC对HeLa细胞的细胞毒作用实验结果表明,PC对HeLa细胞的抑制作用随PC浓度的提高而明显增强,抑制率由3.5%增至31.0%(表1)表1 MTT检测的PC对HeLa细胞的抑制作用Tab.1 The inhibition activity of phycocyanin to Hela cells (MTT test)PC浓度/(mg·L-1)OD OD±S抑制率/%空白0.625 0.621 0.650 0.643 0.619 0.627 0.636 0.619 0.630±0.012—10 6.14 0.588 0.578 0.620 0.617 0.619 0.594 0.625 0.603±0.017 3.520 0.565 0.580 0.573 0.575 0.568 0.570 0.587 0.528 0.575±0.010 3.740 0.543 0.531 0.555 0.529 0.546 0.530 0.547 0.539 0.540±0.011 14.380 0.415 0.423 0.447 0.432 0.419 0.449 0.469 0.426 0.435±0.020 31.02.2 PC对HeLa细胞周期的影响利用流式细胞仪对试验各组HeLa细胞DNA进行分析,表2为各组中细胞周期所占的比率.从实验结果可知:PC可影响HeLa细胞由合成期(S)和分裂期(M)向G1期转移,并且这种转移随PC浓度的增强而增加(图1). G1期细胞的比率逐步增加,而(S+G2+M)期的细胞比率逐步减小,说明PC可使HeLa细胞停滞于G1期,阻止了细胞的DNA复制和分裂. 表2 样品中细胞周期各时期所占百分比Tab.2 The percentage of different phyase in cell division cyclePC浓度/(mg·L-1) G1/% S/% G2+M/% S+G2+M/%空白19.9 76.0 4.1 80.143.5 31.5 64.5 4.0 68.587.0 40.3 56.1 3.6 59.7130.5 50.9 45.6 3.5 49.4A:空白,B:PC最终浓度43.5Lg/mL,C:PC最终质量浓度87.0Lg/mL,D:PC最终质量浓度130.5Lg/mL图1 样品中G1期细胞所占百分比Fig.1 The percentage of G1phase cell以上实验结果表明,PC对体外培养的HeLa细胞有较好的抑制生长作用,且随PC剂量从10 mg/L增高至80 mg/L,抑制率逐步提高,可从3.5%升高至31.0%.流式细胞技术可进一步对活细胞的细胞周期进行检测,从细胞的DNA合成活性来检测PC的抗癌活性. PC使HeLa细胞由S、G2、M期向G1期转变和积聚,这是DNA合成静止期,说明DNA 合成逐步衰减.初步认为这可能是PC抑制癌细胞生长的机理.通过RNaseA处理除去细胞中的RNA,再用DNA染料PI对DNA进行荧光染色,流式细胞仪可根据每个细胞中DNA的质量分数分辩出每个细胞所处的细胞周期,并给出1万个细胞以上所处细胞周期的统一数据.各种细胞周期的峰值和数据非常精确,使本文研究结果十分可靠.PC是由藻蓝素与藻胆蛋白共价结合的大分子复合物.藻蓝素是一种分子质量约0.6 kD的开链四吡咯环化合物,其分子上的乙叉基与藻胆蛋白多肽链上的半胱氨酸以硫醚键共价连接.在分离和纯化PC时是按蛋白质纯化程序进行的,PC是一种蓝色的蛋白质药物分子.参考文献:[1] VERNON J O I, GLAZER A N. Fluorescent phycobiliprotein conjugates for analyses of cells and molecules[J]. J Cell Biol, 1982, 93:981-986.[2] HARDY R R, HAYAKAWA K, PARKS D R,et al. Demonstration of B-cell maturation in X-linkedimmunodeficient mice by simultaneous three-colour immunofluorescence[J]. Nature, 1983, 306:270-272.[3] HONGO T, FUJII Y, IGARASHI Y. An in vitro chemosensitivity test for the screening of anti-cancer drugsin childhood leukemia[J]. Cancer, 1990, 15:65(6):1263-72.[4] MOSMANN T. Rapid colorilmetric assay for cellular growth and survial: Application to proliferafion andcytoxicity assays[J]. J lmmunol Methods, 1983, 65: 55-59.。