单抗简述
单抗药物治疗前景
单抗药物治疗前景1. 背景介绍单抗药物是一类能够针对特定蛋白靶点的药物，通过与靶点结合，影响细胞的生长、凋亡、分化等，从而达到治疗疾病的效果。
随着生物技术的发展，单抗药物作为一种新型的治疗手段，正逐渐成为医学领域的热点之一。
2. 单抗药物的分类根据单抗药物的来源和作用机制，可以将其分为两大类：一种是来自动物细胞，另一种是来自人体细胞。
前者主要包括了小鼠单克隆抗体、大鼠单克隆抗体和人-小鼠嵌合抗体等，而后者则包括了全人源单克隆抗体和人源化单克隆抗体。
这些不同来源的单抗药物在临床上均有不同的应用场景和治疗效果。
3. 单抗药物在肿瘤治疗中的应用随着对肿瘤微环境和肿瘤生长的深入研究，单抗药物在肿瘤治疗中发挥着越来越重要的作用。
它们可以通过针对癌细胞表面的特异蛋白靶点，实现对癌细胞的精准打击，同时减少对正常细胞的影响。
并且，单抗药物还能够激活免疫系统，增强机体自身对肿瘤的免疫应答，提高治疗效果。
4. 单抗药物在自身免疫性疾病治疗中的应用除了在肿瘤治疗中的应用之外，单抗药物还被广泛运用于自身免疫性疾病的治疗。
例如风湿性关节炎、多发性硬化等疾病，单抗药物通过调控免疫系统功能，减轻机体对自身组织的攻击，从而缓解患者的症状，并延缓疾病的进展。
5. 单抗药物在传染病治疗中的潜在应用随着传染性微生物耐药性问题日益严重，科学家们开始探索是否可以利用单抗药物来对付一些传染性微生物所引起的感染性疾病。
初步试验结果显示，单抗药物在传染性微生物方面也具有潜在的治疗应用前景。
未来，在这一领域还将有更多更深入的应用探索。
6. 发展趋势与挑战当前，在单抗药物领域依然存在着一些挑战。
比如，在临床治疗中出现的不良反应、价格昂贵等问题仍然制约着其广泛应用。
同时，在单抗药物开发过程中，需要对其剂型、给药途径、剂量等各方面进行更加深入全面地优化和改进。
因此，在未来发展中需要不断完善相关制度法规和加大技术创新力度，从而更好地推动单抗药物行业健康持续发展。
单抗作用机制
单抗作用机制引言：单抗（Monoclonal Antibodies）是一种由单一抗体群体制备而成的药物，具有高度特异性和亲和力。
单抗通过与特定的分子靶标结合，发挥其治疗作用。
本文将重点介绍单抗的作用机制。
I. 单抗的起源和结构：单抗是通过细胞工程技术制备的，起源于被称为淋巴细胞瘤的B细胞克隆。
单抗的基本结构由两个重链和两个轻链组成，重链和轻链通过二硫键连接。
重链和轻链的不同组合形成了不同种类的单抗。
II. 单抗的作用机制：单抗的作用机制主要包括以下几个方面：1. 特异性识别和结合靶标：单抗通过其可变区域与靶标特异性结合，靶标可以是细胞表面的蛋白质、抗原或药物。
单抗的特异性结合使其能够选择性地作用于目标细胞或分子，减少对正常细胞的影响。
2. 激活免疫系统：单抗可以激活免疫系统，促进机体产生免疫反应。
例如，某些单抗可以结合肿瘤细胞表面的抗原，激活免疫细胞（如T细胞和自然杀伤细胞），引发免疫细胞对肿瘤细胞的杀伤作用。
3. 抑制信号通路：单抗可以通过抑制信号通路来发挥治疗作用。
例如，某些单抗可以结合肿瘤细胞表面的受体，阻断受体与其配体之间的结合，从而阻止信号传导，抑制肿瘤细胞的生长和增殖。
4. 介导细胞毒作用：某些单抗被设计用于介导细胞毒作用。
这些单抗被结合到细胞表面的抗原上后，可以激活免疫细胞，释放细胞毒性物质，直接杀伤目标细胞。
5. 促进药物输送：单抗可以与药物结合，促进药物的输送到特定的组织或细胞。
这种方法可以提高药物的局部浓度，减少对正常组织的毒性。
III. 单抗的临床应用：单抗作为一种重要的生物制剂，已经在临床上取得了显著的成效。
目前，单抗被广泛应用于肿瘤治疗、免疫调节、自身免疫性疾病治疗等领域。
1. 肿瘤治疗：单抗在肿瘤治疗中的应用主要包括以下几个方面：a) 靶向治疗：某些单抗可以选择性地结合肿瘤细胞表面的抗原，抑制肿瘤生长和扩散。
b) 免疫检查点抑制剂：通过阻断肿瘤细胞与T细胞之间的相互作用，增强机体免疫应答，提高肿瘤治疗效果。
单克隆抗体技术历史与发展简述
单克隆抗体技术历史与发展简述陈 光(首都师范大学生物系北京100037)1 单克隆抗体技术的研究背景单克隆抗体(monocl onal an tibody,sho rt fo r M c A b)技术(简称单抗),又被称为肿瘤"生物导弹",是能直接导向肿瘤的药物。
1975年英国科学家Koh ler和M ilstein将产生抗体的淋巴细胞同肿瘤细胞融合,成功的建立了单克隆抗体技术,因此在1984年获得诺贝尔医学和生理学奖。
单克隆抗体,顾名思义,是与“多克隆抗体”相对而言的,那么认识、理解什么是多克隆抗体对进一步明确单克隆抗体的概念就显得尤为重要。
以抗淋巴细胞多克隆抗体(po lycl onal an tilymphocyte an tibody)为例,来初步阐述多克隆抗体的定义。
这是一类特异性免疫抑制剂,直接作用于人体免疫系统中的淋巴细胞,破坏和抑制淋巴细胞及其功能,特别是T淋巴细胞的功能,可用于同种异体器官移植排斥反应的防治以及其他免疫紊乱性的自身免疫病,如重型再障等的治疗。
抗淋巴细胞多克隆抗体是通过注射人类淋巴细胞、胸腺细胞或B 淋巴细胞至马、兔、山羊或猪等动物体内所产生的抗淋巴细胞抗体。
由于淋巴细胞膜表面抗原成分复杂,免疫血清中的抗体是针对淋巴细胞多种抗原成分的抗体,即多克隆抗体。
根据所用免疫原的不同,有不同的名称,用淋巴细胞作抗原免疫称抗淋巴细胞血清(an tilympho2 cyte serum,AL S);用胸腺细胞作抗原免疫则称抗胸腺细胞血清(an titymphocyte serum,A T S)。
如果将AL S 和A T S进行吸收并提纯其免疫球蛋白则分别称抗淋巴细胞球蛋白(an ti lymphocyte gl obulin,AL G)和抗胸腺细胞球蛋白(an tithymocyte gl obulin,A T G)。
与此对应的,单克隆抗体的制备原理就是,动物受到外界抗原刺激后可诱发免疫反应,产生相应抗体。
单抗制备的详细步骤
单抗制备的详细步骤单抗（monoclonal antibody）是由单一细胞母克隆细胞系产生的抗体，具有高度特异性和一致性。
单抗制备的过程通常包括免疫原的选择、动物免疫、细胞融合、克隆筛选和克隆扩增等步骤。
下面将详细介绍这些步骤。
第一步，免疫原的选择。
免疫原是制备单抗必不可少的关键组成部分。
免疫原的选择应基于目标抗体的特异性和重要性。
常用的免疫原包括蛋白质、多肽、多糖、细胞表面分子等。
为了提高免疫原的免疫原性，可以将免疫原与佐剂混合，以增强其免疫原性。
第二步，动物免疫。
将选择的免疫原注射到合适的动物体内。
常用的免疫动物包括小鼠、大鼠、兔子等。
在免疫过程中，通常需要多次免疫，在每次免疫之间有一定的间隔时间，以增强免疫效果。
在免疫的过程中，可以通过采血检测免疫反应的进展，并决定最佳的免疫时间点。
第三步，细胞融合。
在免疫过程中，免疫细胞会产生针对免疫原的抗体。
为了制备单抗，需要将这些抗体产生的免疫细胞与癌细胞进行融合，形成杂交瘤细胞。
常用的癌细胞包括骨髓瘤细胞、葡萄膜炎细胞等。
第四步，克隆筛选。
将细胞融合密度适宜的细胞悬浮液均匀分配到培养皿中，使单个杂交瘤细胞分布在不同的培养皿中。
培养皿中含有特定选择性培养基，使只有杂交瘤细胞能够存活和生长。
在适当的条件下，杂交瘤细胞会形成一个细胞克隆。
然后，可以通过ELISA、细胞培养和动物注射等方法对克隆的细胞上清液进行筛选，以检测是否含有特定的抗体。
第五步，克隆扩增。
通过继续培养和传代，可以扩增含有特定抗体的细胞克隆。
克隆扩增的时间可能需要数周或数月，具体取决于细胞系的生长速度和特性。
最后，可以将克隆扩增的细胞培养液进行纯化和浓缩，以获得高纯度的单抗。
通常使用亲和层析、离心、电泳等技术进行单抗的纯化。
单抗制备的最终产品可以用于医学研究、诊断和治疗等领域。
尽管以上步骤可以概括标准的单抗制备过程，但实际制备中可能因为不同的实验目的和具体需求而存在一些变化。
制备单抗是一个复杂而耗时的过程，需要专业的实验技术和丰富的经验。
单抗制备的详细步骤
单克隆抗体研制最详细步骤单克隆抗体的研制一、单克隆抗体的概念抗体是机体在抗原刺激下产生的能与该抗原特异性结合的免疫球蛋白。
常规的抗体制备是通过动物免疫并采集抗血清的方法产生的，因而抗血清通常含有针对其他无关抗原的抗体和血清中其他蛋白质成分。
一般的抗原分子大多含有多个不同的抗原决定簇，所以常规抗体也是针对多个不同抗原决定簇抗体的混合物。
即使是针对同一抗原决定簇的常规血清抗体，仍是由不同B细胞克隆产生的异质的抗体组成。
因而，常规血清抗体又称多克隆抗体（polyclonal antibody），简称多抗。
由于常规抗体的多克隆性质，加之不同批次的抗体制剂质量差异很大，使它在免疫化学试验等使用中带来许多麻烦。
因此，制备针对预定抗原的特异性均质的且能保证无限量供应的抗体是免疫化学家长期梦寐以求的目标。
随着杂交瘤技术的诞生，这一目标得以实现。
1975年，Kohler和Milstein建立了淋巴细胞杂交瘤技术，他们把用预定抗原免疫的小鼠脾细胞与能在体外培养中无限制生长的骨髓瘤细胞融合，形成B细胞杂交瘤。
这种杂交瘤细胞具有双亲细胞的特征，既像骨髓瘤细胞一样在体外培养中能无限地快速增殖且永生不死，又能像脾淋巴细胞那样合成和分泌特异性抗体。
通过克隆化可得到来自单个杂交瘤细胞的单克隆系，即杂交瘤细胞系，它所产生的抗体是针对同一抗原决定簇的高度同质的抗体，即所谓单克隆抗体（monoclonal antibody），简称单抗。
与多抗相比，单抗纯度高，专一性强、重复性好、且能持续地无限量供应。
单抗技术的问世，不仅带来了免疫学领域里的一次革命，而且它在生物医学科学的各个领域获得极广泛的应用，促进了众多学科的发展。
Kohler和Milstein两人由此杰出贡献而荣获1984年度诺贝尔生理学和医学奖。
二、杂交瘤技术（一）杂交瘤技术的诞生淋巴细胞杂交瘤技术的诞生是几十年来免疫学在理论和技术两方面发展的必然结果，抗体生成的克隆选择学说、抗体基因的研究、抗体结构与生物合成以及其多样性产生机制的揭示等，为杂交瘤技术提供了必要理论基础，同时，骨髓瘤细胞的体外培养、细胞融合与杂交细胞的筛选等提供了技术贮备。
单克隆抗体的应用及原理
单克隆抗体的应用及原理单克隆抗体是指由单一细胞株产生的、只针对特定抗原的抗体。
相对于多克隆抗体，单克隆抗体具有更高的特异性和稳定性，因此在医学、生物学、生物技术等领域有着广泛的应用。
本文将从单克隆抗体的原理、制备方法和应用三个方面进行介绍。
一、单克隆抗体的原理单克隆抗体的制备基于生物学中的免疫原理。
当机体受到外来抗原的侵袭时，免疫系统会产生对抗原的免疫应答，其中的一种反应是产生抗体。
抗体是一种由免疫细胞（主要是B细胞）合成的蛋白质，它可以结合到抗原表面的特定区域（抗原决定簇，Epitope），从而识别和中和抗原。
抗体的结构包括两个重链和两个轻链，每个链都含有一个可变区（variable region，V区）和一个恒定区（constant region，C区）。
V区是抗体分子中最为多样化的部分，它决定了抗体的特异性。
当抗原与B细胞表面的抗体结合后，B细胞会被激活并分化成浆细胞，进而产生大量的抗体分子。
单克隆抗体的制备过程中，需要先制备出特定的抗原。
然后，将该抗原注射到小鼠等动物体内，激活其免疫系统产生抗体。
接着，从动物的脾脏等淋巴组织中分离出B细胞，并将其与肿瘤细胞融合，形成一种称为杂交瘤（hybridoma）的细胞。
杂交瘤细胞既具有B细胞的抗体合成能力，又具有肿瘤细胞的无限增殖能力。
在一系列的筛选和鉴定过程中，可以筛选出只针对特定抗原的单克隆抗体细胞株，进而大规模制备单克隆抗体。
二、单克隆抗体的制备方法单克隆抗体的制备主要包括以下几个步骤：1. 抗原的制备：首先需要准备出特定的抗原，可以是蛋白质、多肽、糖类、药物等。
2. 动物免疫：将抗原注射到小鼠等动物体内，激活其免疫系统产生抗体。
注射的方式有多种，如皮下注射、腹腔注射、静脉注射等。
3. B细胞的分离：从动物的脾脏等淋巴组织中分离出B细胞，可以使用离心、梯度离心等方法。
4. 杂交瘤的制备：将B细胞与肿瘤细胞融合，形成一种称为杂交瘤的细胞。
杂交瘤细胞既具有B细胞的抗体合成能力，又具有肿瘤细胞的无限增殖能力。
单抗药物治疗前景
单抗药物治疗前景什么是单抗药物？单抗药物，全称为单克隆抗体药物，是一种可以识别并结合特定分子的生物制剂。
它的研发和应用代表了生物技术和医学领域的重要进步，被认为是目前治疗各种疾病的重要手段之一。
从生物学角度来看，单抗药物是来源于人工克隆的单一细胞系，可以精确地识别和结合到靶分子上。
这种特性使得单抗药物在治疗和预防多种疾病中具有巨大潜力。
单抗药物的应用领域癌症治疗单抗药物在癌症治疗中起到了革命性的作用。
它可以针对肿瘤细胞表面的特定抗原进行靶向治疗，降低毒副作用的同时提高治疗效果。
目前已经有多种单抗药物被广泛应用于肿瘤的治疗和预防中，例如曲妥珠单抗、帕尼单抗等。
自身免疫性疾病治疗除了癌症治疗，单抗药物也被广泛运用于治疗自身免疫性疾病，如类风湿关节炎、自身免疫性血小板减少性紫癜等。
通过干预免疫系统功能，调节机体内部的免疫失衡状态，进而达到控制和缓解相关疾病的目的。
传染性疾病防治随着新型传染性疾病不断出现，如HIV、埃博拉、新型冠状病毒等，单抗药物也展现出了潜在的应用前景。
一些针对传染性疾病致病机制的深入了解和相关单抗药物的开发，有望成为未来传染性疾病防控领域的重要利器。
单抗药物治疗前景随着生物技术和医学领域的不断发展，单抗药物在临床应用中展现出了巨大的潜力。
首先，在癌症治疗方面，越来越多针对不同癌种的单抗药物陆续问世，并且取得了显著的临床效果。
同时，随着个体化医学理念的逐步深入人心，定制化的单抗药物治疗方案也将加速发展，以满足不同患者的个体化需求。
其次，在自身免疫性和传染性疾病领域，随着对免疫失衡机制和致病微生物深入理解，相应的单抗药物也将更加精准地应用于临床实践中，并且有望成为相关领域防控和治疗的重要手段。
总之，作为生物技术与医学结合发展的产物，单抗药物将持续引领医学进步的方向，并且在未来更多领域内发挥积极作用。
随着技术不断创新和临床经验积累，相信单抗药物在医学领域的治疗前景一定会更加广阔。
单抗与多抗的区别
单抗与多抗的区别
点击次数：7543 发布时间：2013/7/24
抗体（Antibody）是机体在抗原物质刺激下，由B细胞分化成的浆细胞所产生的、可与相应抗原发生特异性结合反应的免疫球蛋白。
抗体是具有4条多肽链的对称结构，其中2条较长、相对分子量较大的相同的重链（H链）；2条较短、相对分子量较小的相同的轻链（L链）。
链间由二硫键和非共价键联结形成一个由4条多肽链构成的单体分子。
具体如下图所示：
由于一个大蛋白分子表面具有多种抗原决定簇，因此免疫动物后，这些不同的决定簇分别诱导动物产生不同的抗体，每种抗体的特异性不同。
单抗（单克隆抗体）是有单个细胞起源的细胞克隆分泌的，所以只针对蛋白抗原的单一抗原决定簇，而多抗（多克隆抗体）是有多个不同克隆的B细胞产生的，是多种细胞的混合物，但其中的每一种抗体也只是针对一种决定簇。
单抗与多抗的制备区别
首先要从抗体的产生来探讨。
把某一抗原免疫某种动物而得到单抗或多抗。
如果用经免疫过的动物的脾细胞获得杂交瘤细胞，则得到单克隆抗体（简称“单抗”），如果用动物的血清，则得到多克隆抗体（简称“多抗”）。
单抗与多抗的应用区别
单抗：识别单个抗原表位，所以特异性高。
但如果所识别的抗原表位被破坏，则会影响实验结果，这也是单抗的缺点之一。
（未必出结果，但是出了结果就很有说服力）
多抗：虽然存在交叉反应的问题，但由于识别多个抗原表位，所以即使有
少数几个抗原表位被破坏，仍然不会影响实验结果，这是多抗的优点之一。
（容易出结果，对未必是真实的结果）。
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饲养细胞的制备 饲养细胞：融合成功的杂交瘤细胞很少，加入滋养细胞可帮 助杂交瘤细胞生长，而滋养细胞本身生长一段时间后会自然死亡。 加入的细胞称之为饲养细胞。（Feeder cell）。主要有小鼠腹 腔巨噬细胞和小鼠胸腺细胞。应用腹腔巨噬细胞的优点：做饲养 细胞，巨噬细胞可以吞噬死亡的细胞和细胞碎片，为融合细胞的 生长造成良好的环境。
选用HAT 选择性培养的目的： 免疫小鼠的脾细胞及小鼠骨髓瘤细胞经融合剂作用后，形成具 有五种细胞成分的复合体。除了所需要的杂交瘤细胞外，还包括骨 髓瘤细胞之间或脾细胞之间互相融合而成的四倍体细胞以及未融合 的骨髓瘤细胞及脾细胞，这些细胞都应被清除。采用加有次黄嘌呤 （H）、氨基喋呤（A）及胸腺嘧啶核苷（T）的HAT 选择性培养基， 即可达到选择保留所需的如何细胞的目的。
叁
单克隆抗体制备原理
用细胞融合技术将经抗原致敏且能分泌某种抗体的B 淋巴细胞（免疫动物B 细胞）与能够长期生长的骨髓瘤细 胞融合形成杂交瘤细胞，这种融合的杂交瘤细胞称为B 淋 巴细胞杂交瘤细胞。由于每一个产生抗体的细胞只能产生 单一的特异性抗体，因此杂交瘤细胞既具备了B细胞产生 特异性抗体的能力，同时又保留了瘤细胞长期增殖的特性。
脾细胞 (B淋巴细胞)
骨髓瘤细胞
杂交瘤细胞 脾细胞脾细胞 骨髓瘤细胞 骨髓瘤细 胞
脾细胞
骨髓瘤细胞
筛选出
HAT 选择性培养的原理： 在细胞内DNA合成一般有两条途径，主途径是在细胞内由糖 和氨基酸合成核苷酸，进而合成DNA，而氨基喋呤可以阻断此途 径。另一辅助途径是在次黄嘌呤和胸腺嘧啶核苷存在的情况下， 经酶催化作用合成DNA。在含有 HAT 的培养液中，细胞合成核酸 的主要途径被氨基喋呤所阻断，而用于细胞融合的骨髓瘤细胞均 经8-氮鸟嘌呤筛选而缺乏HGPRT（次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移 酶）或TK（胸腺嘧啶核苷激酶），因此它们合成核酸的补救途径 也被阻断；脾细胞虽然含有HGPRT,但他们在体外只能存活5~7d； 只有骨髓瘤细胞与脾细胞融合后所形成的杂交瘤细胞，因能从脾 细胞中获得所缺乏的酶类，又有组织培养条件下生长能力，故在 含有HAT 的培养液中通过补救途径合成核酸而继续生长繁殖。
贰
单克隆抗体的概念
单克隆抗体：一种抗体分子是由一个B 淋巴细胞分 化增殖而形成的浆细胞系产生的。由一个细胞增殖而形 成的具有相同遗传特征的细胞群叫做“克隆”。由一个 浆细胞大量增殖形成的克隆产生的抗体称单克隆抗体 （Monoclonal antibody，McAb）。这种抗体分子组成 均匀，特异性单一。用杂交瘤技术制备出来的单克隆抗 体纯度高、专一性强、效价高。
杂交瘤细胞的筛选 融合后的细胞在含有HAT 培养基中培养后，即有部分培养孔 出现杂交瘤集落，但其中仅部分是分泌针对预定特异性抗体的杂 交瘤细胞。在培养7~10d 后，用低倍镜观察，杂交瘤细胞的集落 长成约占1/3~1/2 视野面积时，即可取培养上清进行特异性抗体 的检测，确定有无分泌McAb 的能力，以便及时进行细胞克隆化。 由于融合后，细胞上清份数多，但每份体积有限，因此ELISA（酶 联免疫吸附试验）是最适合用于初步筛选的方法。
单克隆抗体的大量制备 筛选出的阳性细胞株应及早进行抗体制备，因为融合细胞随培 养时间的延长，易发生污染、染包体丢失和细胞死亡的机率增加。 抗体制备有两种方法： 1.增量培养法：即将克隆化的细胞在体外进行大量培养，收集上清 液而获得大量的单一的克隆化抗体。 2.小鼠腹腔接种法:最普遍采用的方法。杂交瘤细胞具有从亲代淋 巴细胞得来的肿瘤细胞的遗传特性。如接种到组织相容性的同系小 鼠或不能排斥杂交瘤的小鼠（无胸腺的裸鼠），杂交瘤细胞就开始 无限地繁殖，直至宿主死亡。（近年来世界范围内单抗用量过多， 世界年需数百万只小鼠，在生产中还给实验动物带来极大痛苦，出 于人道主义，荷兰、德国已禁止使用该技术，美国、英国、加拿大、 瑞士等国也加强了对该技术使用的限制，因此用于细胞培养的生物 反应器有了较快发展）
单克隆抗体的鉴定 （1） 杂交瘤细胞染色体的检查 ：采用秋水仙素裂解法进行。 （2） 单克隆抗体的类型、亚型的测定：购买兔抗小鼠Ig 类型和 亚型的标准抗血清，采用琼脂扩散法或ELISA 夹心法测定单抗的Ig 类型和亚型。 （3） 单抗的特异性鉴定 ：可以采用各种方法，如免疫荧光法、 ELISA 法、间接血凝和免疫印迹技术等，同时还需做免疫阻断试验 等。 （4） 单抗的效价测定： 可采用凝集反应、ELISA 或放射免疫测 定。不同的测定方法效价不同。培养上清液的效价远不如腹水的效 价。采用凝集反应，腹水效价可达5×104。而采用ELISA 检查，腹 水效价可达1.0×106。单抗的效价以培养上清和腹水的稀释度表示。 (5） 必要时还可以测定单抗的亲和力和识别抗原表位的能力测定。
杂交瘤细胞的亚克隆化 经过抗体测定的阳性孔，可以扩大培养，进行克隆，以得到 单个细胞的后代分泌单克隆抗体。克隆的时间一般说来越早越好。 因为在这个时期各种杂交瘤细胞同时旺盛生长，互相争夺营养和 空间，而产生指定抗体的细胞有被淹没和淘汰的可能。但克隆时 间也不宜太早，太早细胞性状不稳定，数量少也易丢失。克隆化 的阳性杂交瘤细胞，经过一段时期培养之后，也还会因为细胞突 变或特定染色体的丢失，使部分细胞丧失产生抗体的能力，所以 需要再次或多次克隆化培养。克隆化的方法很多，包括有限稀释 法、显微操作法、软琼脂平板法及荧光激活分离法等。
免疫动物：以小鼠为例，正常小鼠脾脏含有能产生各种不同抗体 的B淋巴细胞，一只纯种小白鼠估计能产生1.0×107~5.0×107 种 不同的抗体。因此一只正常的小白鼠的脾细胞与小鼠骨髓瘤融合， 只能有千万分之一的机会获得某一种特定抗体。所以为了提高得 到某种杂交瘤的机会，必须加强免疫，使产生特异性抗体的B 淋 巴细胞大量增加。一般，一次免疫难以达到预期效果，故通常要 对小鼠进行首次免疫，加强免疫，冲击免疫，加强免疫可做多次。
细胞融合 概念：通过培养和诱导，两个或多个细胞合并成一个双核 或多核细胞的过程称为细胞融合（cell fusion）或细胞杂交 （cell hybridization）。 诱导细胞融合的方法：灭活的仙台 病毒法融合、PEG法（应用最广）、电融合法、离心、振动等。 PEG：聚乙二醇（PEG），在分子量为200～700 时，呈无 色、无臭的粘稠状液体，分子量大于1 000 时，呈乳白色蜡状 固体，能溶于水、乙醇及其他许多有机溶剂，对热稳定，与许 多化学药品不起作用。用作细胞融合剂的聚乙二醇一般选用分 子量为4000 者，常用浓度为50％，pH8.0～pH8.2（用10％ NaHCO3调整），分子量小的PEG，融合效应差，又有毒性，分子 量过大，则粘性太大，不易操作。
杂交瘤的冷冻保存及复苏 选出的阳性细胞株应及早冻存。冻存的温度越低越好，冻 存于液氮的细胞株活性仅有轻微的降低，而冻存在－70℃冰箱 则活性改变较快。细胞不同于菌种，冻存过程中需格外小心。 二甲基亚砜（DMSO）是普遍应用的冻存保护剂。冻存细胞复苏 后的活性多在50％～95％之间。
伍 单克隆抗体的应用
脾细胞的制备 冲击免疫后3 天（免疫以后7~8 天，虽然是抗体产生的高 峰时期，但形成有活力的杂交瘤细胞的可能反而减少。故一般 认为冲击免疫后的第三天应杀鼠取脾做细胞融合。），摘除小 鼠眼球放血并收集。 收集的血液离心，血清留作阳性对照。按 无菌操作规程取出脾脏，压碎研磨,加入无血清的培养液，清洗 离心，悬浮备用。
分泌抗体 短命
不分泌抗体 长命
脾细胞 (B淋巴细胞)
骨髓瘤细胞
分泌抗体 长命 杂交瘤细胞
在HAT 培养基的选择作用下，只有融合成功 的杂交瘤细胞才能顺利生长，经过反复的免疫学 检测和大量细胞培养，最终获得既能产生所需抗 体、又能不断繁殖的纯系杂交瘤系。将这种细胞 扩大培养，接种于小鼠腹腔，在其后产生的腹水 中即可得到高效价的单克隆抗体。
杂交瘤技术制备单克隆抗体
壹 贰 叁 肆 伍
单克隆抗体技术的历史 单克隆抗体的概念 单克隆抗体制备原理 单克隆抗体制备过程 单克隆抗体的应用
壹
单克隆抗体技术的历史
1975 年，Kohler 和Milstein 应用小鼠骨髓瘤细胞和绵羊细胞 致敏的小鼠脾细胞融合，得到的一部分融合杂交细胞既能继续生 长，又能分泌抗羊红细胞抗体，将这种杂交细胞系统称为杂交瘤， 应用这种方法可制备单一抗原决定簇的单克隆抗体，创立了单克 隆抗体技术，获1984 年诺贝尔奖。
杂交瘤细胞的选择性培养 将经PEG 处理并在CO2 孵箱培养24h 的融合后的细胞悬浮 于HAT 培养液中，再送回到CO2孵箱培养。每2~3d 更换培养液 一次，1 周后改用HT 培养液（HT是次磺嘌呤和胸腺嘧啶核苷的 混合剂，溶解后用培养液稀释，作为DNA补救合成途径的补充剂 用于杂交瘤筛选培养基的添加剂和营养添加剂以克服细胞内残 留氨基喋呤对DNA经典合成途径的抑制作用），2 周后改用15% 小牛血清的完全培养液。
骨髓瘤细胞的制备 选择骨髓瘤细胞的条件：①两者同系 ②稳定，易培养 ③自身不分泌免疫球蛋白 ④融合率高 ⑤是HGPRT缺陷株 ⑥生长速度快，繁殖时间短。 现有的小鼠骨髓瘤细胞株大多数是 MOPC-21 细胞株的后 代，它的HGPRT 缺陷细胞亚株在Milstein 实验室建立，简称 为X63。Kohler 等人在此基础上进一步诱发出完全不分泌免疫 球蛋白的P3.653 和SP2/0 等。应用最多的是 Sp2/0 细胞株。 该细胞株生长及融合效率均佳，倍增时间通常为10～15h。为 了防止出现返祖现象，骨髓瘤细胞株在融合前应先用含 8-氮 鸟嘌呤的培养基作适应培养。
8-氮鸟嘌呤
骨髓瘤细胞 （毒性核苷酸） DIE
骨髓瘤细胞
骨髓瘤细胞 （正常核苷酸）
LIVE
骨髓瘤细胞
脾细胞 HAT 培养基 骨髓瘤细胞 骨髓瘤细胞
一段时间后死亡
长期存活
脾细胞脾细胞 一段时间后死亡
杂交瘤细胞
肆
单克隆抗体制备过程
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 抗原制备 免疫动物 骨髓瘤细胞的制备 饲养细胞的制备 脾细胞的制备 细胞融合 杂交瘤细胞的选择性培养 杂交瘤细胞的筛选 杂交瘤细胞的亚克隆化 单克隆抗体的鉴定 性抗原的发现及提纯 2、单克隆抗体的导向治疗 3、病理组织定位诊断中的应用 4、用于淋巴细胞分类、鉴定、结构与功能的研究 5、临床生化诊断中的应用 6、应用抗T 细胞McAb 可防止器官移植排斥反应及治疗某些 自身免疫