HPLC色谱条件的优化与色谱
最新HPLC色谱条件的优化与色谱
● 温度匹配 流动相须预热至柱温，温度匹 配可以使柱效提高50%以上。
柱后应配冷却单元，使洗脱液温度快速 降到一固定值（如35℃），以避免检测信号 的波动。
● 色谱柱 以硅胶为基质的填料，其使用温 度一般不超过60℃；HTLC使用以氧化锆、 多孔石墨碳、高分子微球为基质的填料或采 用多配位基有机硅胶为填料。
1、温度 柱温提高到40℃以上，谓之 HTLC（40℃—200℃）
● 温度上升→流动相粘度下降→流速增加 （≤8ml/min）→容量因子K下降→保留时
间缩短
●粘度降低→柱压下降→可采用细粒径填料 （＜3um）或长色谱柱→提高柱效
●提高灵敏度 色谱峰高与柱温呈指数函数 关系，即峰高的对数与柱温呈线性关系
1、柱效与流速的关系 存在最佳流速
2、柱效与填料粒径的关系
a）A=2λ·dp 式中 2λ为与填充均匀性有关的因数 dp为填料的粒径
b）小的dp有利于传质
c）减小填料粒径可显著提高柱效
由上表可见，减小dp可显著提高柱效→缩短
恒压
色谱柱 → 增加流速
↓
↓
缩短洗脱时间
三、影响分离效果的其他因素
适当改变流动相的组成、组分的比例或添加 调节剂。
5、N与α对Rs贡献的比较
二、Van Deemtor方程
h=A·F1/3+B/F+Cm·F+Cs·F=A·F1/3+C·F 式中 h=1/N 理论塔板高度
F=流动相流速 Cm，Cs=溶质在流动相和固定相中的浓度 B=纵向扩散的贡献因子（纵向浓度梯度） A=涡流扩散的贡献因子（色谱柱的不均匀性） 溶质在液体中的扩散系数比气体中小4—5个数 量级，所以在HPLC中在通常的流速条件下B项的贡 献可忽略 不计。
各国药典关于HPLC色谱条件允许调整范围
欧洲药典EP
流动相PH值 缓冲盐浓度 ±0.2，pH7.6可以在 7.4-7.8之间调整 ±10%，20mM磷酸钾可以 在18-22mM范围内，只要 pH值符合要求就行 ±30%，最小组成的比例 可以调整30%，但是，任 何组成的比例的改变不 能超过±10%.60:40乙腈 /水，水的比例可以调整 ±12%（=40*30%），但 是这超过了±10%的限制 。因此，这个条件下， 水的比例只能在30%至 50%之间进行调整。 不允许调整 ±70%，150*4.6mm规格 的色谱柱，柱长可以改 变±105mm ±25%，150*4.6mm规格 的色谱柱，内径可以改 变±1HP2010
流动相组成比例
紫外可见检测器检测波长 色谱柱长度
色谱柱内径
粒径
流速 进样体积 柱温 梯度洗脱
±0.2，pH7.6可以在7.4未明确 7.8之间调整 ±10%，20mM磷酸钾可以在 18-22mM范围内，只要pH值 未明确 符合要求就行 ±30%，最小组成的比例 ±30%，最小组成的比例可 可以调整30%，但是，任 以调整30%，但是，任何组 何组成的比例的改变不能 成的比例的改变不能超过± 超过±10%.60:40乙腈/ 10%.60:40乙腈/水，水的比 水，水的比例可以调整± 例可以调整±12% 12%（=40*30%），但是这 （=40*30%），但是这超过 超过了±10%的限制。因 了±10%的限制。因此，这 此，这个条件下，水的比 个条件下，水的比例只能在 例只能在30%至50%之间进 30%至50%之间进行调整。 行调整。 不允许调整 不可改变 ±70%，150*4.6mm规格的色 可适当调整 谱柱，柱长可以改变± 105mm ±25%，150*4.6mm规格的色 可适当调整 谱柱，内径可以改变± 1.15mm 可以适当调整；一般 3~10um，粒径更小（约 可以降至50%，10um的粒 可以降至50%，10um的粒径 2um）可用。孔径：分子 径可以调整为5um 可以调整为5um 量小于2000，孔径在150A 以下；分子量大于2000， 孔径300A。 ±50%，1mL/min流速可 ±50%，1mL/min流速可以在 可以适当调整 以在0.5至1.5mL/min范 0.5至1.5mL/min范围内变化 围内变化 只要精密度和检测限可 只要精密度和检测限可以达 可以适当调整 以达到要求就可以减少 到要求就可以减少 10%，最大不超过60℃ 10% 一起系统过大的滞留体 积会明显改变分离度， 保留时间和相对保留时 间
hplc法测定合成色素的方法原理
hplc法测定合成色素的方法原理HPLC法测定合成色素的方法原理HPLC（高效液相色谱法）是一种常用的分离和分析化学物质的方法。
它基于化学物质在液相中的分配行为，利用固定的填充剂和流动相进行分离。
在合成色素的分析中，HPLC法是一种非常有效的方法，能够精确、快速地测定和分析合成色素。
一、HPLC法的基本原理HPLC法是一种液相色谱法，它利用液态流动相将待测物分离开来并定量测定。
HPLC法有几个重要的组成部分，包括色谱柱、流动相、检测器和流速控制系统。
色谱柱是HPLC法的核心部分，其中填充有固定相，用于分离化合物。
流动相则是在色谱柱中移动的溶液。
检测器通过检测组分的物理性质（如吸光度、荧光强度等）来定量测定化合物。
流速控制系统用于控制流动相的流速，以确保分析的准确性和精确性。
二、HPLC法测定合成色素的步骤HPLC法测定合成色素的步骤可以分为样品制备、色谱柱条件优化、测量参数设置和数据处理等几个基本步骤。
1. 样品制备样品制备是HPLC法测定合成色素的第一步。
在样品制备中，需要将合成色素溶解在适当的溶剂中，以获得可以被HPLC法分析的溶液。
样品制备的目的是将合成色素转化为溶解度良好的溶液，以确保测定的准确性和重现性。
2. 色谱柱条件优化色谱柱是HPLC法分离化合物的关键。
在测定合成色素时，需要选择合适的色谱柱和填充剂，以获得良好的分离效果。
此外，还需要对色谱柱进行优化，包括流动相的选择和比例、温度的控制等。
通过不断调整这些条件，以获得良好的分离效果和分辨度。
3. 测量参数设置测量参数的设置是HPLC法测定合成色素的关键。
这些参数包括进样量、检测器的类型和参数、流动相的流速等。
在进样量方面，应根据样品的浓度和检测器的灵敏度进行适当的调整。
检测器的类型和参数应根据合成色素的特性和需要进行选择。
流动相的流速是影响分离和测定效果的重要因素之一，应根据色谱柱的特性和样品特性进行优化。
4. 数据处理在HPLC法测定合成色素后，需要对测定结果进行数据处理。
HPLC培训(峰与色谱条件)课件
高效液相 色谱
基本原理
加样
流动相
流动相
A
C
B
B
C
A
固定相 —— 柱内填料，流动相 —— 洗脱剂。
HPLC是利用样品中的溶质在固定相和流动相之间分 配系数的不同，进行连续的无数次的交换和分配而达 到分离的过程。
基本操作
1.打开泵电源，待自检完成后打开“Purge”阀进行排液以除去泵头之 前的气泡，排气完成后关闭“Purge”阀。按“Pump”键开启泵，然 后按“func”及数字键以0.2ml/min的速度慢慢将流速调1.0ml/min
色谱柱的良好使用规范
溶剂使用前必须过滤 运输中变干了的色谱柱要完全浸湿（预处理） 如果样品中含有无需考虑而保留强的组分时,必须进行前处理 清楚了解色谱柱填料适用的pH范围(3-7)，温度(<60),化学适应性 使用新鲜的水溶液,流动相现用现配制 定期用强极性溶剂冲洗色谱柱 储存色谱柱时,要将缓冲液冲洗干净,并保存在适合的溶剂中,如甲醇、
计算公式
或
重复性
用于评价连续进样中，色谱系统响应值的重复性能。
采用外标法时，通常取各品种项下的对照品溶液，连 续进样5次，除另有规定外，其峰面积测量值的相对标 准偏差应不大于2.0%。
相对标准偏差 RSD
采用内标法时，其相对标准偏差应不大于2.0%。
拖尾因子（T）
用于评价色谱柱的对称性。
反应峰
色谱柱故障诊断-- 峰形问题
拖尾峰－－对称因子>1.2
Normal
Tailing
Normal
Tailing
可能的原因
有些峰拖尾
1、二次保留效应，残留的硅羟基影 响
2、在大峰的尾部有小峰流出（DAD）
HPLC方法建立和优化
4.样品分离的系统方法
充分用已知样品结构确定以哪种方法开始
普通反相? 离子抑制? 离子对? 还是其他
观察流动相条件改变时色谱峰的移动
根据变化的方向及大小决定下一步干什么
低pH流动相中寿命缩短 的主要原因是键合相在酸 性条件下水解，这会导致 保留时间和峰形的明显改 变
2.2 色谱柱常见问题 3、色谱柱的维护
三、色谱分离基础
3.1 溶剂的基础知识
粘度
溶剂粘度：
3.5 3
2.5 2
1.5 1
0.5 0
流动相粘度 水百分比
系M列eO1H 系M列eC2N
系Et列OH3 系AMc列eeOtHo4ne 系TH列F 5
a改变 a改变 a改变 a改变 a改变 a改变 a改变 a改变
结果
改变K、a、N 的途径
改变a的途径
改变流动相
改变K、a、N 的途径
改变N值的方法∶
减小填料的颗粒度 找到最佳的流速（根据不同内径） 合适的温度：粘度低、温度高 降低溶剂的粘度 增加柱长 减小柱外效应
k＝VR’/V0
vR
VR v0
VR’
t0
tR‘
tR
k :用来描述色谱柱中溶 质的迁移速度
2.1 色谱柱的性能指标
3、分离因子（ a ）:
a ＝k2/k1
vR
VR v0
VR’
t0
tR‘
tR
a :用来描述和表征两种
不同的溶质在色谱柱里 的分离过程
2.1 色谱柱的性能指标
4、峰的对称性（ AS）:
美国药典要求（5％）
32.4% 13.4% 4.4%
tR
W1/2h
HPLC分离条件的优化步骤以及定量计算公式的选择
不同柱子其保留性差异很大，相同条件，不 同柱子比例会不一样。 不同色谱柱需合适的pH范围，一般在2.57.5之间，有的色谱柱比较耐碱，kromasil可以到 10，而杂化xterra在1－12,XDB在pH3-11.
3.分离条件的优化
3.1 容量因子和死时间的测量
在HPLC分析中，容量因子k′是一个非常重要的 参数，对如何选择流动相的溶剂组成、改善多组分 分离的选择性都发挥着重要的作用。 k′=t ′R／t M
式中，Ai—组分i的峰面积；
ƒ′i—i组分的质量校正因子
4.定量计算公式的选择
二、标准曲线法（外标法 / 直接比较法） 在HPLC中比较常用，是一种简便、快速的绝对 定量方法（归一化法是相对定量方法） 测定样品中组分含量时，根据峰面积和峰高在标 准工作曲线上直接查出进入色谱柱中样品组分的浓度 ，也可通过下式计算 pi / % = f i / A i(h i) 式中，A i(h i) —i组分的峰面积（峰高） f i—i组分标准工作曲线的斜率
3.分离条件的优化
2.由色谱柱的操作参数进行计算 t M =ΦηL2/△pd p2 式中，Φ为阻抗因子；η为流动相的动力黏度；L 为柱长； △p为柱压力降；d p为固定相粒径 3.依据经验公式计算 当dc/dp≥10 时，可按下述公式计算 t M： t M =L / u 对全多孔固定相 对非多孔固定相 u=1.5F/dc2 u=3F/dc2
3.分离条件的优化
对组成复杂、由具有宽范围k′值组分构成的 混合物，需用梯度洗脱技术，才能使样品中每个组 分都在最佳状态下洗脱出来。（采用梯度洗脱通常 能将组分的k′值减小至原来的1/10~1/100，从而 缩短了分析时间。）
3.4 相邻组分的选择性系数和分离度的选择
icg的hplc测定方法
icg的hplc测定方法
HPLC（高效液相色谱法）是一种常用的分析化学技术，用于分离、鉴定和定量化合物。
ICG（吲哚青绿）是一种常用的生物染料，
常用于生物医学研究和临床诊断。
下面我将从样品准备、色谱条件
和数据处理等多个角度来介绍ICG的HPLC测定方法。
首先，样品准备非常重要。
对于ICG的HPLC测定，样品的准备
包括样品的溶解和处理。
ICG通常是以固体形式存在，因此需要将
其溶解在适当的溶剂中，如甲醇或乙腈。
溶解后的样品需要通过滤
膜过滤，以去除悬浮物和杂质，确保样品纯度和稳定性。
其次，色谱条件对于HPLC测定至关重要。
选择合适的色谱柱、
流动相和检测波长是关键。
针对ICG的测定，常用的色谱柱是C18
反相色谱柱，流动相可以是水和乙腈的混合物，检测波长通常选择
在600nm左右。
在确定了色谱条件后，需要进行系统的优化，以获
得最佳的分离效果和分析速度。
最后，数据处理也是HPLC测定中不可或缺的一部分。
通过
HPLC仪器得到的数据需要经过处理和分析，包括峰识别、峰面积计
算和浓度计算等步骤。
这些步骤需要借助专业的数据处理软件完成，
以确保结果的准确性和可靠性。
综上所述，ICG的HPLC测定方法涉及样品准备、色谱条件和数据处理等多个方面。
通过合理的样品准备、优化的色谱条件和准确的数据处理，可以实现对ICG的高效、准确的测定。
当然，在实际操作中，还需要根据具体情况进行进一步的优化和验证，以确保测定结果的可靠性和重复性。
希望这些信息能够对你有所帮助。
高效液相色谱碘试剂柱后衍生测定粮油样品中黄曲霉毒素B_(1)的条件优化
160!"与油%2021346食品安全与检测效液试后定样品中黄曲B1的条件优化刘倩，马饪(上海科茂粮油食J质量检测有限公司，上海200333)摘要：优化了高效液相色谱测定粮油样J中黄曲霉毒素B1含量的检测方法&粮油样J中的黄曲霉毒素B1用甲醇：水体积比70德0的混合溶液提取，提取液经免疫亲和柱净化和富集，净化液稀释和过滤后，以甲醇：水体积比50:50为流动相，等梯度洗脱,通过高效液相色谱-碘试剂柱后衍生-荧光检测器进行测定，外标法定量。
结果表明：黄曲霉毒素B[在质量浓度0.03~5ny/mL范围内与响应峰面积呈现良好的线性关系，线性回归方程为==2.47x106X+1.39x105%相关系数r=0.9994、加标回收率为93.0%-101.0%、相对标准偏差(relative standard deviation,RSD)为0.41%-3.15%、方法检出限和定量限分别为0.018"g/ky和0.06"g/ky。
该方法相对于GB5009.22—2016第三法处理更简化，且未降低灵敏度，好，靠，为检测机构日常粮油样晶中黄曲霉毒素B1的检测方法&关键词：高液相色谱;粮油样J;黄曲霉毒素B1Optimization of conditions for determination of afatoxin B1 in grain and ot samples by high performancc linuin chromatography wit iodine reagent derivatization after columnLIU Qian,MA Yu(Shanghai Kemao Cereals,Oils and Foodstuffs Quality Testing Co.,Lid,Shanghai200333,China) Abstract:A method for Ox determination of aUatoxin B[in grain and oil samples by high performance liquid chromatography was optimized.The aUatoxin B[in grain and oil samples was extracted with mixed solution of methanol:water70：30by volume.The extracted solution was puffied and enfched by immu-noa e onotycoiumn.Thepueoeoed6oiutoon wa6doiuted and eoite eed.The mob oie pha6e wa6methano i：wate e 50:50by volume.The content of aUatoxin B[was determined by HPLC with iodine reagent post-column derivatization and quantified by extemal standard method.The results showed that the—was a good linear relationship between aUatoxin B[concentration and response peak area in the range of0.03〜5ng/mL.The linear mg—ssion equation was as follows:==2.47x106E+1.39x105,the cot—1/Wn coefficient r=0.9994,We standard recove—rate was93.0%〜101.0%,the relative standard deviation(RSD) was0.41%〜3.15%,The limits of detection and limits of quantification we—0.018"g/kg and0.06"g/kg,pared with the third method of GB5009.22—2016,the method was sim-pie,had good eepeataboioty,accueateand eeioabie,and couid beused asthedetectoon method oeaeiatoton B1on daoiygeaon and ooisampiesoedetectoon onstotutoons.Key words:high performance liquid ch—mUoymphy;grain and oil samples;aUatoxin B[中图分类号：TS207.5文献标志码：A文章编号：1008-9578(2021)06-0160-03黄曲霉毒素是一类由黄曲霉和寄生曲霉等真菌产生的次级代谢产物，主要包括黄曲霉毒素'1%收稿日期：2020-10-23作者简介：刘倩（1992—）,女，本科，学士，研究方向为食J检测。
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HPLC色谱条件的优化与色谱
HPLC（高效液相色谱）是一种常用的分析方法，广泛应用于药物、环境、食品等领域。
HPLC色谱条件的优化对于提高分离和检测的灵敏度、分离效果和分析速度非常重要。
下面将介绍HPLC色谱条件的优化以及HPLC色谱的发展。
首先是样品前处理，样品前处理的目的是去除干扰物、浓缩样品和改善样品溶解性。
常用的样品前处理方法包括固相萃取、液液萃取、蒸发浓缩等。
选择合适的样品前处理方法可以提高样品的灵敏度和准确性。
其次是色谱柱选择，色谱柱的选择对于色谱分离效果和分析速度有很大影响。
常见的色谱柱有反相柱、离子交换柱、凝胶柱等。
根据具体分析物的性质和需求选择合适的色谱柱可以提高分离效果。
流动相选择是HPLC色谱条件优化中很关键的一步。
常用的流动相有水、乙腈、甲醇等有机溶剂和一些缓冲溶液。
通过调整流动相的比例、溶剂类型和缓冲溶液的pH值可以提高分离效果、降低柱背压和改善峰形。
检测波长选择也是HPLC色谱条件中的一个重要环节。
根据分析物的特征选择合适的检测波长可以提高检测的灵敏度和选择性。
常见的检测器有紫外检测器、荧光检测器、质谱检测器等。
最后是色谱条件参数优化，色谱条件参数包括流速、柱温、进样量、柱背压等。
通过对这些参数的优化可以实现快速分离和高效分离。
优化色谱条件参数还可以提高信噪比、减少噪声、降低回收率和节约试剂等。
优化色谱条件参数需要根据具体的样品和需求进行调整，需要进行多组实验来找出最佳的条件参数。
此外，随着科学技术的发展和人们对分析能力的要求提高，HPLC色谱也在不断发展。
现代HPLC色谱已经发展出许多新的技术和方法，如超高效液相色谱（UHPLC）、毛细管电泳段（CEC）、离子色谱（IC）等。
这些新的方法和技术具有高分辨率、高灵敏度和高效率的特点，能够更好地满足各类分析需求。
综上所述，HPLC色谱条件的优化对于提高分离效果、分析速度和灵敏度至关重要。
通过合理的样品前处理、色谱柱选择、流动相选择、检测波长选择和色谱条件参数优化等方面的优化，可以获得更好的分析结果和数据。
同时，随着科学技术的发展，HPLC色谱也在不断演化和创新，为我们提供了更多样化和高效的分析方法。