食品中丙烯酰胺测定的前处理条件和色谱条件优化

Ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ Ｐｒｅｔｒｅａｔｍｅｎｔ ａｎｄ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｉｃ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ａｃｒｙｌａｍｉｄｅ Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ
ＺＨＡＮＧ Ｈｕｉ－ｚｈｅｎ，ＭＡ Ａｉ－ｇｕｏ＊，ＳＵＮ Ｙｏｎｇ－ｙｅ，ＬＵＯ Ｙｏｎｇ－ｂｉｎｇ （Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ， Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｍｅｄｉｃａｌ， Ｑｉｎｇｄａｏ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ， Ｑｉｎｇｄａｏ ２６６０２１， Ｃｈｉｎａ）
丙烯酰胺（ａｃｒｙｌａｍｉｄｅ，ＡＡ），分子量为 ７１．０９，化学 分子式 Ｃ Ｈ ２＝ Ｃ Ｈ － Ｃ Ｏ － Ｎ Ｈ ２，丙烯酰胺是一种高水溶性的 α，β － 不饱和羰基化合物，其聚合物聚丙烯酰胺是一种 工业絮凝剂，一般用于污水净化等工业用途。自 ２ ０ ０ ２ 年瑞典科学家发现淀粉类食物经过高温油炸会产生丙烯 酰胺以来，丙烯酰胺问题一直成为食品安全的热点问题 之一［１－７］，由于食物源性丙烯酰胺摄入对人体健康的评价 与定性、定量分析方法的可靠性直接相关。因此，丙
２．１．２ 固相萃取条件的选择 用 ５ｇ 土豆泥作样品，添加 １０ｍｇ／Ｌ 的丙烯酰胺和甲
基丙烯酰胺各 １００μｌ，按 １．３．１ 样品的净化方法，分别 用 Ｃ １８、石墨化碳黑、硅藻土 ３ 种固相萃取小柱做淋洗 曲线（图 １），３ 种 ＳＰＥ 小柱对丙烯酰胺和甲基丙烯酰胺基 本上没有吸附作用，但石墨化碳黑小柱对杂质的吸附作 用较好。 ２．２ 液相色谱分析仪器条件的优化
流动相甲醇 －０．０２ｍｏｌ／Ｌ 乙酸铵（５：９５，Ｖ／Ｖ），流速 ０．６ｍｌ／ ｍ ｉ ｎ ；检测波长 ２ ０ ５ ｎ ｍ ；进样量 １ ０μｌ 。
１．２．２．２ 气相色谱仪器条件 色谱柱：ＨＰ－ＦＦＡＰ 柱，３０ｍ × ０．３２ｍｍ × ０．２５μｍ；
柱箱温度：６５℃（１ｍｉｎ）→ １５℃／ｍｉｎ → ２５０℃（１５ｍｉｎ）；进 样口温度：２ ５ ０ ℃；检测器温度：３ ０ ０ ℃；载气：高 纯氮气，１ ｍ ｌ ／ ｍ ｉ ｎ ；进样方式：无分流进样；进样量： １μｌ 。
※分析检测
食品科学
2008, Vol. 29, No. 04 279
的高效液相色谱（ＨＰＬＣ－ＶＷＤ）和气相色谱（ＧＣ－ μＥＣＤ）分析 方法。优化前处理步骤和仪器分析条件，Ｈ Ｐ Ｌ Ｃ 分析方 法采用 ０ ． １ ％ 甲酸溶液提取，石墨化碳黑固相萃取小柱 净化，甲醇 －０．０２ｍｏｌ／Ｌ 乙酸铵（５：９５）做流动相测定。ＧＣ－ μＥＣＤ 法采用强酸体系中用 ０．１ｍｏｌ／Ｌ ＫＢｒＯ３ 和 ＫＢｒ 对丙烯 酰胺进行加成反应衍生化，乙酸乙酯提取衍生化产物α， β － 二溴丙酰胺，用 Ｈ Ｐ － Ｆ Ｆ Ａ Ｐ 毛细管柱分离，电子捕 获检测器测定。
２ 结果与分析
２．１ 液相色谱前处理条件的优化
２．１．１ 提取液的选择 丙烯酰胺在水中的溶解度很大（２１５５ｇ／Ｌ），水是理想
的提取溶剂，用水提取还可以去除油炸食品中大量有机 物，考虑到丙烯酰胺的弱碱性，选择用 ０ ． １ ％ 的甲酸溶 液将其固定。由于样品中一般含有大量的淀粉和蛋白质 等，在提取过程中容易糊化，难于离心分离，因此选 择加入硫酸锌溶液和亚铁氰化钾溶液，并且，在提取 过程中为避免糊化，不宜加热和超声提取。
Ａｂｓｔｒａｃｔ ：Ａ ｈｉｇｈ ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ ｌｉｑｕｉｄ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｉｃ （ＨＰＬＣ） ｍｅｔｈｏｄ ａｎｄ ａ ｇａｓ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｉｃ ｍｅｔｈｏｄ ｗｅｒｅ ｏｐｔｉｍｉｚｅｄ ｆｏｒ ｔｈｅ ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ ａｃｒｙｌａｍｉｄｅ ｉｎ ｆｏｏｄ． ＨＰＬＣ ｍｅｔｈｏｄ ｗａｓ ｕｓｅｄ ａｓ ｆｏｌｌｏｗｓ： ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ ｉｓ ｃａｒｒｉｅｄ ｏｕｔ ｏｎ ａ ｃｏｌｕｍｎ ｏｆ Ｃ１８ （２５０ ×４．６ ｍｍ ｉ．ｄ ５μｍ） ｗｉｔｈ ｍｅｔｈａｎｏｌ－０．０２ ｍｏｌ／Ｌ ａｍｍｏｎｉｕｍ ａｃｅｔａｔｅ （５：９５， Ｖ／Ｖ） ａｓ ｍｏｂｉｌｅ ｐｈａｓｅ， ｅｌｕｔｉｏｎ ｆｌｏｗ ｒａｔｅ ０．６ ｍｌ／ｍｉｎ ａｎｄ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｗａｖｅｌｅｎｇｔｈ ２０５ ｎｍ． ＧＣ－μＥＣＤ ｍｅｔｈｏｄ ｗａｓ ｕｓｅｄ ａｓ ｆｏｌｌｏｗｓ： ＫＢｒＯ３ ａｎｄ ＫＢｒ ａｒｅ ａｐｐｌｉｅｄ ｔｏ ｄｅｒｉｖａｔｅ ａｃｒｙｌａｍｉｄｅ ｉｎｔｏ α，β－ｄｉｂｒｏｍｏｐｒｏｐｉｏｎａｍｉｄｅ（２，３－ＤＢＰＡ）－ ２－ｂｒｏｍｏｐｅｎａｍｉｄｅ（２－ＢＰＡ），ｗｈｉｌｅ ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ ｏｆ ａｃｒｙｌａｍｉｄｅ ａｒｅ ｓｅｐａｒａｔｅｄ ｂｙ ＦＦＡＰ ｃａｐｉｌｌａｒｙ ｃｏｌｕｍｎ ａｎｄ ｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄ ｂｙ ＧＣ－ μＥＣＤ．Ｔｈｅ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ ｒｅｓｕｌｔｓ ｓｈｏｗ ａ ｇｏｏｄ ｌｉｎｅａｒ ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐ ｂｅｔｗｅｅｎ ｔｈｅ ｐｅａｋ ａｒｅａ ａｎｄ ｔｈｅ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ （ｒ＞０．９９）， ｗｈｅｒｅ ａｓ ｔｈｅ ｒｅｃｏｖｅｒｉｅｓ ｆｏｒ ａｃｒｙｌａｍｉｄｅ ａｒｅ ｒｅｓｒｅｃｔｉｖｅｌｙ ８６．３ ％～９６．９ ％ ｆｏｒ ＨＰＬＣ ａｎｄ ８４．６ ％～ ９８．５ ％ ｆｏｒ ＧＣ， ａｎｄ ｔｈｅ ｒｅｌａｔｉｖｅ ｓｔａｎｄａｒｄ ｄｅｖｉａｔｉｏｎ ｉｓ ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ ２．１３ ％ ｆｏｒ ＨＰＬＣ ａｎｄ ４．３６％ ｆｏｒ ＧＣ． Ｔｈｅ ＬＯＱ ｉｓ ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ ０．０５ｍｇ／ｋｇ ｆｏｒ ＨＰＬＣ ａｎｄ ０．０２ ｍｇ／ｋｇ ｆｏｒ ＧＣ． Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｓｈｏｗ ｔｈａｔ ｔｈｅ ｔｗｏ ｍｅｔｈｏｄｓ ｈａｖｅ ｎｏ ｎｏｔａｂｌｅ ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ ａｎｄ ｂｏｔｈ ａｒｅ ｓｉｍｐｌｅ， ｒａｐｉｄ， ａｃｃｕｒａｔｅ ａｎｄ ｗｅｌｌ ｓｕｉｔｅｄ ｆｏｒ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ａｃｒｙｌａｍｉｄｅ ｉｎ ｆｒｉｅｄ ｆｏｏｄｓ ａｎｄ ｂａｋｅｄ ｆｏｏｄｓ ａｓ ｗｅｌｌ． Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ：ａｃｒｙｌａｍｉｄｅ ： ＨＰＬＣ；ＧＣ－μＥＣＤ ｅｌｅｃｔｒｏｃｈｒｏｍｉｓｍ ｄｅｖｉｃｅ；ｄｅｒｉｖａｔｅ 中图分类号：ＴＳ２０７．３ 文献标识码：Ａ 文章编号：１００２－６６３０（２００８）０４－０２７８－０５
烯酰胺（ Ａ Ａ ） 含量分析方法的可行性也广受关注［８－１２］，由 于丙烯酰胺分子结构简单，有机溶剂提取的特异性差， 并且，由于食品样本组成复杂，基质干扰多，食品中 丙烯酰胺的快速准确检测方法目前仍然是分析工作者面 临的难题。已有报道利用气相色谱 － 质谱联用法（ＧＣ－ＭＳ） ［１３－１５，１８］和液相色谱 － 串联质谱法（ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ）［１６－１８］法测定食 品中的丙烯酰胺，两种方法对仪器的要求都很高，不 适合在普通实验室的推广。本实验建立食品中丙烯酰胺
２．２．１ 色谱柱的选择 比较了 Ｃ ８、Ｃ １８、氰基柱不同填料的反相色谱柱在
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食品科学
※分析检测
食品中丙烯酰胺测定的前处理条件 和色谱条件优化
张辉珍，马爱国 ＊ ，孙永叶，罗勇兵
（青岛大学医学院营养研究所，山东 青岛 ２６６０２１）
摘 要：优化了食品中丙烯酰胺的高效液相色谱（ＨＰＬＣ－ＶＷＤ）和气相色谱（ｅｌｅｃｆｒｏｃｈｒｏｍｉｓｍ ｄｅｖｉｃｅ， ＧＣ－μＥＣＤ）分析方 法。ＨＰＬＣ 法采用 Ｃ１８（２５０ × ４．６０ｍｍ，５μｍ）色谱柱，流动相为甲醇 －０．０２ｍｏｌ／Ｌ 乙酸铵（体积比为 ５：９５），流速 ０．６ｍｌ／ ｍｉｎ；检测波长 ２０５ｎｍ； ＧＣ 法采用溴酸钾和溴化钾将丙烯酰胺的烯键加成为α，β － 二溴丙酰胺后，用 ＦＦＡＰ 石英 毛细管柱分离，电子捕获检测器定量测定。结果表明，两种方法均有良好的线性关系（ｒ ＞ ０．９９），ＨＰＬＣ 方法的定量限 为 ０．０５ｍｇ／ｋｇ，平均加标回收率为 ８６．３％～９６．９％，相对标准偏差 ＲＳＤ 为 ２．１３％。ＧＣ－ μＥＣＤ 法的定量限为 ０．０２ｍｇ／ｋｇ， 加标回收率为 ８４．６％～９８．５％，相对标准偏差 ＲＳＤ 为 ４．３６％。两种方法仪器设备易求，操作简便，回收率较高，精 密度良好，用 Ｈ Ｐ Ｌ Ｃ 和 Ｇ Ｃ 两种方法测得的结果无显著性差异，均可用于油炸及焙烤类食品中丙烯酰胺的测定。 关键词：丙烯酰胺；高效液相色谱法；气相色谱 － 电子捕获检测器；衍生化
Ａｇｉｌｅｎｔ１２００型液相色谱仪（带紫外检测器）、Ａｇｉｌｅｎｔ ６ ８ ９ ０ Ｎ 型气相色谱（ 带电子捕获检测器） 、高速离心机、 涡漩混合器、均质器、固相萃取装置、ｓ ｕ ｐ ｅ ｌ ｃ ｏ 石墨 化碳黑固相萃取柱（６ｍｌ， ５００ｍｇ） 。 １．２ 方法
１．２．１ 样品处理
１．２．１．１ 液相色谱测定样品前处理 准确称取 ５ ． ０ ｇ 左右预先均匀混合并研细的试样于
３０ｍｌ 离心管中，加 １０ｍｌ ０．１％ 的甲酸溶液，５ｍｌ ２１９ｇ／Ｌ 硫酸锌溶液，５ｍｌ １０９ｇ／Ｌ 亚铁氰化钾溶液，涡漩混合提 取 ２ｍｉｎ，加 １０ｍｇ／Ｌ 甲基丙烯酰胺 １００μｌ 作内标，混匀， 静置 １０ｍｉｎ，１２０００ｒ／ｍｉｎ 离心 １０ｍｉｎ，上清液全部转移至 分液漏斗中，分别用 １ ０ ｍ ｌ 正己烷萃取三次脱脂，弃去 上层正己烷，从下层水相的中间部位准确吸取 ５ ｍ ｌ 溶 液，调 ｐ Ｈ ７ 左右，过石墨化碳黑固相萃取（ Ｓ Ｐ Ｅ ） 小柱， ＳＰＥ 小柱预先依次用 ５ｍｌ 甲醇和 ５ｍｌ 水活化，收集中间 １～１．５ｍｌ 流出液，过 ０ ． ４５μｍ 滤膜，进液相色谱测定。
１ 材料与方法
１．１ 材 料 、试 剂 与 仪 器 一般市售薯片、饼干、油条、咖啡等食品。 丙烯酰胺标准品（９９．０％）、甲基丙烯酰胺标准品（９９．０％）
美国 Ｓｉｇｍａ 公司；甲醇（ＨＰＬＣ 级） 天津四友公司；甲 酸、乙酸铵、硫酸锌、亚铁氰化钾、正己烷、溴酸 钾、溴化钾、硫酸、硫代硫酸钠、乙酸乙酯、无水 硫酸钠均为分析纯试剂；水为二次去离子水。